Name: measuring liver mitochondrial oxygen consumption and proton leak kinetics to estimate mitochondrial respiration in holstein dairy cattle
Uploaded: 2018-11-30T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af Alltech og USDA Hatch midler gennem Center for Food Animal Health ved UC Davis School of Veterinary Medicine.

Alle metoder, protokol og undersøgelser beskrevet her blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) fra University of California, Davis.
1. at opnå en leverbiopsi fra Holsten malkeko
Bemærk: En leverbiopsi bør udføres af en autoriseret dyrlæge. Leveren biopsier kan udføres på webstedet mejeri hvor køerne er placeret. Ammende malkekøer kan fortsætte med at blive malket normalt og mælk skal ikke trækkes fra fødevareforsyning før elle...

<ol>
	<li>Brand, M. D., Divakaruni, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology. 26, 192-205 (2011).</li><li>Stephenson, E. J., Hawley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+in+metabolic+health:+A+genetic+and+environmental+tug+of+war.">Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).</li><li>Bartlett, K., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+B+oxidation.">Mitochondrial B oxidation.</a> European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).</li><li>Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+Consumption,+Respiratory+Control+Ratio+(RCR)+and+Mitochondrial+Proton+Leak+of+broilers+with+and+without+growth+enhancing+levels+of+minerals+supplementation+challenged+with+Eimeria+maxima+(Ei).">Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei).</a> Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).</li><li>Wallace, D. C., Fan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics,+epigenetics,+mitochondrial+genetics.">Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics.</a> Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).</li><li>Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+mitochondrial+bioenergetics+and+cardiolipin+in+aging.">Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging.</a> Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).</li><li>Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+mitochondrial+oxygen+consumption+and+efficiency+of+milk+production+in+lactating+Holstein+cows+supplemented+with+Copper,+Manganese+and+Zinc.">Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc.</a> Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).</li><li>Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+metabolism+and+performance+of+cattle.">Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle.</a> Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).</li><li>Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+mitochondrial+function+and+residual+feed+intake+in+Angus+steers.">The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers.</a> Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).</li><li>Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+residual+feed+intake+and+hepatic+mitochondrial+function+in+growing+beef+cattle.">Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle.</a> Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).</li><li>Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+liver+mitochondrial+respiration+and+proton+leak+kinetics+in+low+and+high+RFI+steers+from+two+lineages+of+RFI+Angus+bulls.">Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls.</a> ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).</li><li>Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+oxidants+in+biological+systems:+The+superoxide+theory+of+oxygen+toxicity.">Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity.</a> Free Radicals in Biology and Medicine. , 186-187 (1989).</li><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nutrient Requirements of Dairy Cattle. , (2001).</li><li>Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+energy+intake,+energy+expenditure,+and+aging.">Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging.</a> Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).</li><li>Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+control+of+immunity:+beyond+ATP.">Mitochondrial control of immunity: beyond ATP.</a> Nature. 17, 608-620 (2017).</li><li>Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+assays+of+respiratory+chain+complex+activity.">Biochemical assays of respiratory chain complex activity.</a> Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).</li><li>Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milk+yield+differences+between+1x+and+4x+milking+are+associated+with+changes+in+mammary+mitochondrial+number+and+milk+protein+gene+expression,+but+not+mammary+cell+apoptosis+or+SOCS+gene+expression.">Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression.</a> Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).</li><li>Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+high-fat+feeding+on+metabolic+efficiency+and+mitochondrial+oxidative+capacity+in+adult+rats.">Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats.</a> British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).</li><li>Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SirT1+regulates+energy+metabolism+and+response+to+caloric+restriction+in+mice.">SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice.</a> PloS One. 3 (3), e1759 (2008).</li><li>Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+dietary+lipid+composition+on+liver+mitochondria+from+mice+following+1+month+of+calorie+restriction.">The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction.</a> Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).</li><li>Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bioenergetic+health+index:+a+new+concept+in+mitochondrial+translational+research.">The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research.</a> Clinical Science. 127, 367-373 (2014).</li></ol>

Det mest kritiske punkt i protokollen at opnå en repræsentativ lever vævsprøve og begynder isolering af mitokondrier hurtigst muligt efter biopsi. Variation i respiration målinger er lavt (tabel 1) på grund af en kort transporttid fra ko til laboratorium. For at reducere transporttiden, en lille laboratorium blev oprettet i office af mejeriet, og leveren prøver blev kørt til office laboratorium, som hver blev indsamlet, således at mitokondrier var isoleret inden for 10 min af biopsi. Opsætning ...

Mitokondrier er meget følsomme over for stress og deres cellulære miljø kan bidrage til en bred vifte af metaboliske sygdomme. Forbrug af ilt og proton lækage i mitokondrier er indikatorer for mitokondrier sundhed. De beskrevne i dette papir skøn mitokondriets energieffektivitet ved hjælp af RCR metoder baseret på iltforbrug med og uden proton lækage. Disse resultater kan udgøre 30% af den energi tabt i næringsstofudnyttelse1. Ændringer i ilt forbrug og proton lækage kan identificere mitokondriel dysfunktion, som bidrager til metabolisk sygdom og resulterer i nedsat energieffektivitet. Disse metoder kan også bruges til at undersøge effekten af forskellige behandlinger på mitokondrie respiration. Det overordnede mål for måling af mitokondrie iltforbrug og proton lækage kinetik er at evaluere mitokondrie-funktion og energiske effektivitet.
Nedsat mitokondriel dysfunktion har været forbundet med flere sygdomme i malkekvæg. Cellulære metabolisme evne til at skifte mellem kulhydrat og lipid brændstoffer når de står med et energi underskud i tidlig laktation er påvirket af den nummer og funktion af mitochondrier i cellen2. Defekter i mitokondrierne evne til at tilpasse sig til en øget efterspørgsel efter energi og øget β-oxidation kan føre til ophobning af intracellulære lipid associeret med insulinresistens og kan føre til dannelse af fedtlever i tidlig laktation malkekøer. Mitokondrierne, kan som stedet for keton organ produktion og anvendelse, spille en nøglerolle i ketosis i malkekøer3. Manglende mitokondrier eller mitokondriel dysfunktion vil påvirke brændstof tilgængelighed til periferien og afspejles i ændringer i forbrug af ilt eller RCR.
Mitokondrie ilt forbrug ændringer som reaktion på betændelse. Syv dage gamle slagtekyllinger blev tilfældigt tildelt en gruppe, der er inficeret med Eimeria maxima og en kontrol gruppe4. Slagtekyllinger, der ikke undergår coccidiose udfordring havde lavere forbrug af ilt på grund af proton lækage og højere RCR med angivelse af at leveren mitokondrier reagere på en immun udfordring ved stigende proton lækage. Mens proton lækage og reaktive ilt arter produktion blev engang betragtet som et tegn på mitokondrielle membran dysfunktion og skadelig for energiske effektivitet, nu det er kendt at det er vigtigt for import af proteiner og calcium til mitokondrier5 , og for generation af varme1.
Elektron lækage fra respiratorisk kæden gør mitokondrier modtagelige for reaktive ilt arter produktion og oxidative skader til mitokondrielle Membranproteiner, lipider og mitokondrie-DNA. Som mitokondrier alder, skaden kan ophobes især til mtDNA forårsager yderligere dysfunktion i mitokondrie stofskifte6 og større modtagelighed af koen til sygdom. I praksis, er mange dyr dyr fodret høje niveauer af kosttilskud såsom Cu, Zn og Mn at øge antioxidant funktion. Men fodring høje niveauer af Cu, Zn og Mn faldt mælkeproduktion og øget iltforbrug på grund af proton lækage (State 4 respiration)7.
Tidligere forskning på rollen mitokondriel funktion i energieffektivitet i kvæg har fokuseret på ændringer i mitokondrie iltforbrug og proton lækage. Meget få undersøgelser er blevet offentliggjort i malkekvæg og de fleste papirer sammenligne produktionseffektivitet i form af resterende foderoptagelse (RFI) til mitokondrie-funktion kødkvæg. Variation i mitokondrie respiration satser blev undersøgt ved måling tilstand 3, stat 4 og RCR i lever fra både ammende Holstein køer og ammende oksekød køer (Angus og Hereford, Brangus)8. Forskerne fandt ikke nogen korrelation i mitokondrie respiration med vækst eller malkning træk for kødkvæg men rapport en korrelation mellem mitokondriel respiration og malkning træk for Holstein. I to undersøgelser, blev RFI sammenlignet i kødkvæg til mitokondrie respiration satser (tilstand 3, stat 4 og RCR) i muskel mitokondrier9,10. Mitokondrie respiration satser ændret svar på DMI og lave priser var forbundet med mindre effektive oksekød stude. I en anden undersøgelse, RFI af stude fra højt eller lavt RFI tyre blev sammenlignet med mitokondrie respiration satser og proton lækage kinetik mellem de to grupper af afkom11. Forskellene skyldtes gevinst bekræfter den konklusion, at få gør ikke virkning mitokondrie respiration i kødkvæg.
I dette papir, et eksperiment undersøger leveren RCR svar på fodring 3 antioxidant mineraler til ammende malkekvæg illustrerer brugen af metoder til at måle iltforbruget under State 4 og 3 respiration og PMF.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Liver Biopsy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument</td>
			<td>Sontec Instruments Englewood CO</td>
			<td>1103-904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-037-516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture needles</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Included with Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S2896 / S2646</td>
			<td># for handle and blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery towels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-129-6667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>Z168750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-314387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needles (22, 2 1/2)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MJ8881-200342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cow halter</td>
			<td>Tractor Supply Co.</td>
			<td>101966599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabbing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gauze squares (4x4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-246069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical scissors</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>Z265969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clostridia Vaccine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone Scrub</td>
			<td>Aspen Veteterinary Resources</td>
			<td>21260221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>793213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% lidocaine HCl (10-15 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation of Mitochondria (liver)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-911-527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Motor</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04369-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04468-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto Pipette (10 mL)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL) with ice</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB100600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microfuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-002-441EW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab102536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>EDS-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (fatty acid free)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A7030-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M4125-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>38796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,&#160; pH 7.4 at 4 &#176;C, will last 2 days in refrigerator</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial Oxygen Comsuption</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode</td>
			<td>Hansatech (PP Systems)</td>
			<td>OXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoregulated Water Pump</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLE2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark type Oxygen electrode</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autopipette (1 mL)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-70</td>
			<td>Included with Oxy1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small magnetic stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (10 &#956;L)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P9333-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P5655-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M1028-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>E3889-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,&#160; pH 7.4 at 30 &#176;C with 0.3% defatted BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone (4 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>R8875-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate (1 M solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S3674-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP (100 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A5285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin (solution of 8 &#956;g/mL in ethanol)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP electrode</td>
			<td>World Precision Instruments.</td>
			<td>DRIREF-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malonate (0.1 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin (8 &#956;g/mL in ethanol), keep in freezer</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,&#160; pH 7.4 at 30 &#176;C with 0.3% defatted BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring liver mitochondrial oxygen consumption and proton leak kinetics to estimate mitochondrial respiration in holstein dairy cattle

Forbrug af ilt, proton motiv tvinge (PMF) og proton lækage er målinger af mitokondrie respiration, eller hvor godt mitokondrier er købedygtig omforme NADH og FADH i ATP. Da mitokondrier er også den primære lokalitet for oxygen brug og næringsstof oxidation til CO2 og vand, hvor effektivt de bruger ilt og producerer ATP direkte vedrører effektiviteten af næringsstof metabolisme, næringsstofbehov af dyret, og sundhed af dyret. Formålet med denne metode er at undersøge mitokondrie respiration, som kan bruges til at undersøge virkningerne af forskellige stoffer, kostvaner og miljømæssige effekter på mitokondrie stofskifte. Resultaterne omfatter iltforbrug målt som proton afhængige respiration (tilstand 3) og proton lækage afhængige respiration (status 4). Forholdet mellem staten 3 / stat 4 respiration er defineret som luftvejskontrol ratio (RCR) og kan repræsentere mitokondrie energiske effektivitet. Mitokondrie proton lækage er en proces, der giver mulighed for spredning af mitokondrielle membran potentiale (MMP) ved frakobling oxidativ fosforylering af ADP faldende effektiviteten i ATPsyntesen. Ilt og TRMP + følsomme elektroder med mitokondrie substrater og elektron transport kæde hæmmere anvendes til at måle tilstand 3 og staten 4 respiration, mitokondrielle membran PMF (eller potentiale til at producere ATP) og proton lækage. Begrænsninger til denne metode er at leveren væv skal være så frisk som muligt og alle biopsier og assays skal udføres i mindre end 10 h. Dette begrænser antallet af prøver, der kan indsamles og behandles af en enkelt person i en dag til ca 5. Dog er kun 1 g af levervævet nødvendige, så i store dyr, som malkekvæg, mængden af prøven nødvendige er lille i forhold til leveren størrelse og der er lidt restitutionstid behov.

Positive resultater viser RCR og proton lækage kinetik er vist i tabel 1 og Figur 15, henholdsvis. I denne undersøgelse7, RCR og protein lækage blev kinetik målt i Holsten malkekøer på 70 dage i mælk efter køer havde fået 1 af 5 forskellige niveauer af Cu, Zn og Mn i 28 dage. Staten 4, maksimale proton lækage-afhængige respiration, havde en tendens til at blive påvirket af mineral indtagelse af Cu, Mn og Zn...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle at JoVE.com

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Her deler vi metoder til måling af mitokondrie iltforbrug, et definerende begrebet ernæringsmæssige energetik og proton lækage, den primære årsag til ineffektivitet i mitokondrie generation af ATP. Disse resultater kan udgøre 30% af den energi tabt i næringsstofudnyttelse til at hjælpe med at evaluere mitokondrie funktion.

Måling af leveren mitokondrie iltforbrug og Proton lækage kinetik for at anslå mitokondrie Respiration i Holsten malkekvæg

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i den energiske område, såsom mitokondriel sundhed, energisk effektivitet og energiforbrug. Den største fordel ved denne teknik er, at iltforbrug af isolerede mitokondrier måles direkte. Det er ikke nødvendigt at korrigere resultaterne for andre intracellulære metaboliske processer.Vi besluttede først at forfølge denne metode i malkekvæg, da vi ønskede at undersøge, hvordan mitokondriel effektivitet påvirker fodereffektiviteten. Video demonstration af denne metode er kritisk, da trinene i mitokondriel isolation er vanskelige at lære, fordi de skal være konsekvent og præcis. Så hurtigt som muligt efter, at leverprøven er fjernet fra koen, vaskes prøven i mitokondriers isolationsmedier for at fjerne de røde blodlegemer.Brug saks fint hakke vævet i en kølet bægerglas, der indeholder nok isolation medier til at holde vævet fugtigt. Den hakkede lever overføres til et glashætteglas med 30 milliliterglas indeholdende mitokondriers isolationsmedier. Tilsæt en Teflon støder, der har en clearance på 0,16 millimeter, og som er blevet inkuberet i is og homogenisere leverprøven ved 500 RPM i et minut med fire slag i minuttet.Derefter overføres homogenatet til et rør, der indeholder mitokondriers isolationsmedier, og dette anbringes i et ispakket bægerglas. Centrifuge homogenat ved 500 gange G og fire grader Celsius i 10 minutter. Skal pellets kasseres, og supernatanten overføres til et kølet centrifugerør.Centrifuge den resulterende supernatant på 10, 000 gange G og fire grader Celsius i 10 minutter for at opnå mitokondrielle pellet. Opslæm og vask pellet i 10 milliliter mitokondrier isolationsmedier med fedtsyre-fri BSA. Derefter centrifuge på 8, 100 gange G og fire grader Celsius i 10 minutter.Kassér supernatanten og opsplit pellet i 200 mikroliter af isolationsmedier. Placer dette på is, indtil klar til brug for iltforbrug og proton lækage kinetiske analyser. Der bestemmes proteinkoncentrationen af pelletsuspensionen ved hjælp af et bicinoninsyresæt pr. producentens anvisninger ved hjælp af BSA som standard.Først skal du oprette iltforbrugsmedier som beskrevet i tekstprotokollen. Inkuber iltforbruget medier ved 30 grader Celsius. Dernæst oprettes respirationskammeret, pumpen og iltelektroden til oxygraph-systemet i henhold til producentens anvisninger.Anstænke derefter en milliliter iltforbrugsmedie i respirationskammeret. Derefter tilsættes 0,35 milligram mitokondrielt protein til kammeret. Rør kraftigt for at sikre, at opløsningen bliver mættet med luft og opretholde en temperatur på 30 grader Celsius.Optag iltforbruget i ca. fem minutter. Når iltforbruget konstant repræsenteres af en faldende lige linje, skal dette registreres som baseline-iltforbruget. Der tilsættes 1,25 mikroliter af en 4 millimolar rotenonopløsning for at hæmme den komplekse opløsning, og der tilsættes derefter fem mikroliter af en molære succinateopløsning for at nå en endelig koncentration på fem millimolar succinat i åndedrætskammeret.Dette er stat IV iltforbrug. Derefter tilsættes en mikroliter af en 100-millimolar ADP-opløsning for at nå en endelig koncentration på 100 mikromolar i respirationskammeret. Iltforbruget vil falde i cirka fem minutter og derefter vil blive en lige linje.Optag dette iltforbrug som staten III respiration. Beregn åndedrætskontrolforholdet som beskrevet i tekstprotokollen. Derefter aspirere alle løsningerne ud af respirationskammeret.Skyl kammeret flere gange med dobbelt deioniseret vand. Først forberedes en opløsning på 80 nanogram pr. milliliter nigericin i ethanol, der begrænser mængden af ethanol, der tilsættes mindre end én mikroliter. Også forberede en opløsning på otte mikrogram pr milliliter oligomycin i ethanol.Efter grundig skylning af kammeret med dobbelt deioniseret vand, placere en milliliter af iltforbrug medier i respiration kammer og rør kraftigt med en magnetisk røre bar. Tilføj 0,35 milligram mitokondrielt protein til respirationskammeret. Tilføj en methyl-triphenylphosphonium-følsom elektrode til kammeropsætningen og sørg for, at den anden ende er korrekt forbundet til en pH-måler.Der tilsættes 1,25 mikroliter af en 4-millimolar rotenonopløsning for at hæmme kompleks I.Record respirationen i to til fem minutter. Værdien for iltforbrug registreres, når den bliver konstant. Dernæst tilsættes 0,56 mikroliter af en oligomycinopløsning for at hæmme ADP-udnyttelsen.Optag respiration i omkring to til fem minutter. Værdien for iltforbrug registreres, når den bliver konstant. Derefter tilsættes 0,112 mikroliter af en 80 nanogram pr. milliliter nigericinopløsning for at afskaffe pH-gradienten på tværs af mitokondriel indre membran.Optag respiration i to til fem minutter, og noter iltforbrugsværdien, når den bliver konstant. Der tilsættes fem mikroliter af 10 millimolar methyl triphenylphosphonium-opløsning til mitokondriel inkubation for at begynde at forberede en standardkurve. Denne tilsætning gentages yderligere fire gange, indtil der er en samlet koncentration på 2,5.micromolar er blevet tilføjet. Efter dette, tilsæt fem mikroliter af en molære succinate opløsning til kammeret for at indlede respiration. Respirationen registreres, indtil der er fundet et stabilt spor.Tilføj derefter malonate for at pirre systemet som beskrevet i tekstprotokollen. I denne undersøgelse måles RCR og protonlækagekinetik i mælken fra holstenske malkekøer 70 dage efter, at malkekøerne var blevet fodret med forskellige niveauer af kobber, zink og mangan i 28 dage. Stat IV respiration ses at være den højeste hos køer givet lave niveauer af mangan, men er lavest i kontrol køer, hvilket indikerer, at mangan spiller en vigtig rolle i at minimere proton lækage-afhængige respiration.Analyse af den hepatiske proton lækage-afhængige respiration afslører, at dette åndedræt er størst hos køer behandlet med lav mangan, og den laveste i kontrol køer. Disse resultater bekræfter, at den lave mangangruppe har den største tilstand IV respiration, mens kontrolgruppen har den laveste. Mens fodereffektiviteten er højere i Angus stude født af lav RFI tyre end høj RFI tyre, dette blev ikke afspejlet i mitokondrielle RCR eller proton lækage kinetik.Under udførelsen af denne procedure er det vigtigt at holde alle hætteglas og bægerglas på is, mens behandlingen af mitokondrier. Efter sin udvikling denne teknik banede vejen for forskere inden for mejeri ernæring til at udforske den rolle, mitokondrier effektivitet i fodereffektivitet og mitokondrielle funktion i leveren. Glem ikke, at arbejde med rotenone kan være farligt, og forholdsregler såsom at bære handsker, øjenbeskyttelse og korrekt PPE bør altid tages, mens du udfører denne procedure.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyser af mitokondrie Calcium tilstrømning i isolerede mitochondrier og kulturperler celler

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Måling af mitokondrie iltforbrug i Permeabilized fibre fra Drosophila bruger minimale mængder af væv

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Måling og fortolke ilt forbrug satser helt flyve hoved segmenter

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

Måling Mitokondrie Elektron Overførsel Komplekser i tidligere frosne hjertevæv fra afkom af so: En model til at vurdere Motion-induceret Mitokondrie Bioenergetics Ændringer

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Billedbaseret kvantificering med høj kapacitet af mitokondrie-DNA-syntese og -distribution

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

Oxygenuafhængige assays til måling af mitokondriefunktion hos pattedyr

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

En forbedret metode til at isolere mitokondriekontaktsteder

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Analyzing Mitochondrial Physiology and Bioenergetics in Fruit Flies

Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry

Exploring Mitochondrial Function and Chemical Toxicity Using Drosophila melanogaster (Video) | JoVE

Analyse af mitokondriefunktion i en Drosophila melanogaster PINK1 B9-null-mutant ved hjælp af respirometri med høj opløsning

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy ...