Name: measuring liver mitochondrial oxygen consumption and proton leak kinetics to estimate mitochondrial respiration in holstein dairy cattle
Uploaded: 2018-11-30T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle at JoVE.com

Dit onderzoek werd gesteund door Alltech en USDA Hatch fondsen door het centrum voor levensmiddelen, diergezondheid bij UC Davis School voor diergeneeskunde.

Alle methoden, protocol en studies die hier beschreven werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Californië, Davis.
1. het verkrijgen van een lever biopsie van een melkkoe van Holstein
Opmerking: Een lever biopsie moet worden uitgevoerd door een erkende dierenarts. Lever biopten kunnen worden uitgevoerd op de zuivel-site waar de koeien zich bevinden. Zogende melkkoeien kunnen blijven normaal worden gemolk...

<ol>
	<li>Brand, M. D., Divakaruni, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology. 26, 192-205 (2011).</li><li>Stephenson, E. J., Hawley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+in+metabolic+health:+A+genetic+and+environmental+tug+of+war.">Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).</li><li>Bartlett, K., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+B+oxidation.">Mitochondrial B oxidation.</a> European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).</li><li>Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+Consumption,+Respiratory+Control+Ratio+(RCR)+and+Mitochondrial+Proton+Leak+of+broilers+with+and+without+growth+enhancing+levels+of+minerals+supplementation+challenged+with+Eimeria+maxima+(Ei).">Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei).</a> Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).</li><li>Wallace, D. C., Fan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics,+epigenetics,+mitochondrial+genetics.">Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics.</a> Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).</li><li>Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+mitochondrial+bioenergetics+and+cardiolipin+in+aging.">Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging.</a> Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).</li><li>Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+mitochondrial+oxygen+consumption+and+efficiency+of+milk+production+in+lactating+Holstein+cows+supplemented+with+Copper,+Manganese+and+Zinc.">Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc.</a> Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).</li><li>Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+metabolism+and+performance+of+cattle.">Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle.</a> Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).</li><li>Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+mitochondrial+function+and+residual+feed+intake+in+Angus+steers.">The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers.</a> Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).</li><li>Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+residual+feed+intake+and+hepatic+mitochondrial+function+in+growing+beef+cattle.">Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle.</a> Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).</li><li>Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+liver+mitochondrial+respiration+and+proton+leak+kinetics+in+low+and+high+RFI+steers+from+two+lineages+of+RFI+Angus+bulls.">Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls.</a> ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).</li><li>Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+oxidants+in+biological+systems:+The+superoxide+theory+of+oxygen+toxicity.">Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity.</a> Free Radicals in Biology and Medicine. , 186-187 (1989).</li><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nutrient Requirements of Dairy Cattle. , (2001).</li><li>Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+energy+intake,+energy+expenditure,+and+aging.">Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging.</a> Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).</li><li>Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+control+of+immunity:+beyond+ATP.">Mitochondrial control of immunity: beyond ATP.</a> Nature. 17, 608-620 (2017).</li><li>Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+assays+of+respiratory+chain+complex+activity.">Biochemical assays of respiratory chain complex activity.</a> Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).</li><li>Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milk+yield+differences+between+1x+and+4x+milking+are+associated+with+changes+in+mammary+mitochondrial+number+and+milk+protein+gene+expression,+but+not+mammary+cell+apoptosis+or+SOCS+gene+expression.">Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression.</a> Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).</li><li>Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+high-fat+feeding+on+metabolic+efficiency+and+mitochondrial+oxidative+capacity+in+adult+rats.">Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats.</a> British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).</li><li>Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SirT1+regulates+energy+metabolism+and+response+to+caloric+restriction+in+mice.">SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice.</a> PloS One. 3 (3), e1759 (2008).</li><li>Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+dietary+lipid+composition+on+liver+mitochondria+from+mice+following+1+month+of+calorie+restriction.">The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction.</a> Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).</li><li>Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bioenergetic+health+index:+a+new+concept+in+mitochondrial+translational+research.">The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research.</a> Clinical Science. 127, 367-373 (2014).</li></ol>

Het meest kritieke punt in het protocol is het verkrijgen van een steekproef representatief leverweefsel en beginnen het isolement van de mitochondriën zo spoedig mogelijk na biopsie. Variatie in ademhaling metingen is laag (tabel 1) als gevolg van een korte transporttijd van koe naar laboratorium. Verklein de transporttijd en een klein laboratorium opgericht in het kantoor van de melkerij, en lever monsters naar het laboratorium van office werden verdreven, zoals elk werd verzameld zodat mitochondriën...

Mitochondriën zijn zeer gevoelig voor stress en hun cellulaire omgeving kan bijdragen tot een breed scala aan metabole ziekten. Zuurstofverbruik en proton lek in mitochondriën zijn indicatoren voor de gezondheid van de mitochondriën. De methoden die worden beschreven in dit papier schatting mitochondriale energie-efficiëntie met behulp van RCR gebaseerd op zuurstofverbruik met en zonder proton lek. Deze resultaten kunnen goed voor 30% van de energie verloren in nutriënten gebruik1. Wijzigingen in zuurstof verbruik en proton lek herkent mitochondriale dysfunctie die bijdraagt tot metabole ziekte en resulteert in verminderde energie-efficiëntie. Deze methoden kunnen ook worden gebruikt om te onderzoeken van het effect van verschillende behandelingen op mitochondriale ademhaling. Het algemene doel van het meten van mitochondriale zuurstofverbruik en proton lek kinetiek is mitochondriale functie en energetische doeltreffendheid te beoordelen.
Hepatische mitochondriale dysfunctie is gekoppeld aan verschillende ziekten in melkvee. Het vermogen van cellulaire metabolisme om te schakelen tussen koolhydraten en lipide brandstoffen wanneer zij worden geconfronteerd met een energie tekort in begin lactatie wordt beïnvloed door het aantal en de functie van de mitochondriën in de cel2. Defecten in het vermogen van de mitochondriën aan te passen aan een grotere vraag naar energie en hogere β-oxidatie kunnen leiden tot ophoping van intracellulaire lipide geassocieerd met insulineresistentie en kunnen leiden tot de vorming van vette lever in begin lactatie melkkoeien. Mitochondriën, kunnen als de site van keton lichaam productie en gebruik, een belangrijke rol in ketose in melkkoeien3. Een gebrek van de mitochondriën of mitochondriale dysfunctie zal gevolgen hebben voor de beschikbaarheid van de brandstof naar de periferie en worden weerspiegeld in veranderingen in zuurstofverbruik of RCR.
Mitochondriale zuurstof verbruik verandert in reactie op ontsteking. Zeven-dag-oude vleeskuikens werden willekeurig toegewezen aan een groep geïnfecteerd met Eimeria maxima en een controle groep4. Vleeskuikens die coccidiosis uitdaging niet ondergaan had lager zuurstofverbruik als gevolg van proton lek en hogere RCR die aangeeft dat de lever-mitochondria op een immuun uitdaging door toenemende proton lek reageren. Terwijl het proton lek en reactieve zuurstof soorten productie werd ooit beschouwd als een teken van mitochondriale membraan dysfunctie en ten koste van energetische efficiëntie, nu het is bekend dat het belangrijk is voor de invoer van proteïnen en calcium in mitochondriën5 , en voor de opwekking van warmte1.
Elektron lek uit de luchtwegen keten maakt mitochondriën vatbaar voor reactieve zuurstof soorten productie en oxidatieve schade aan mitochondriale membraaneiwitten, lipiden en mitochondriaal DNA. Als mitochondriën leeftijd, schade kan accumuleren vooral aan mtDNA, waardoor verdere dysfunctie in mitochondriale metabolisme6 en grotere gevoeligheid van de koe voor ziekte. In de praktijk worden veel dieren dieren hoge niveaus van supplementen zoals Cu, Zn en Mn te stimuleren anti-oxidant functie gevoed. Echter voeding van hoge niveaus van Cu, Zn en Mn daalde de melkproductie en toegenomen zuurstofverbruik als gevolg van proton lek (staat 4 ademhaling)7.
Eerder onderzoek over de rol van mitochondriale functie in energie-efficiëntie bij runderen heeft gericht op veranderingen in de mitochondriale zuurstofverbruik en proton lek. Weinig studies zijn gepubliceerd in melkvee en de meeste papieren vergelijk productie-efficiëntie in de vorm van residuele voeropname (RFI) aan mitochondriale functie in runderen. Variabiliteit in mitochondriale ademhaling tarieven werden onderzocht door het meten van toestand 3, staat 4 en RCR in levers van zowel zogende Holstein koeien en rundvlees zogende koeien (Angus, Brangus en Hereford)8. De onderzoekers did niet vondst ieder correlatie in mitochondriale ademhaling met groei of eigenschappen voor runderen melken maar een correlatie tussen mitochondriale ademhaling en melken eigenschappen voor Holsteins verslag. In twee studies, bedroeg RFI vergeleken in rundvlees vee naar mitochondriale ademhaling tarieven (staat 3, staat 4 en RCR) in spier mitochondriën9,10. Mitochondriale ademhaling tarieven gewijzigd in reactie op DMI en lage tarieven werden geassocieerd met minder efficiënt rundvlees ossen. In een andere studie, RFI van ossen uit de hoge of lage RFI stieren werden vergeleken met de tarieven van mitochondrial ademhaling en proton lek kinetiek tussen de twee groepen van nakomelingen11. Verschillen waren te wijten aan winst bevestigen de conclusie dat krijgen doet niet effect mitochondriale ademhaling in runderen.
In deze paper, een experiment dat onderzoekt lever RCR in reactie op het vervoederen van 3 antioxidant mineralen aan zogende melkvee het gebruik van methoden illustreert voor het meten van zuurstofverbruik tijdens staat 4 en staat 3 ademhaling en PMF.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Liver Biopsy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument</td>
			<td>Sontec Instruments Englewood CO</td>
			<td>1103-904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-037-516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture needles</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Included with Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S2896 / S2646</td>
			<td># for handle and blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery towels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-129-6667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>Z168750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-314387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needles (22, 2 1/2)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MJ8881-200342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cow halter</td>
			<td>Tractor Supply Co.</td>
			<td>101966599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabbing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gauze squares (4x4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-246069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical scissors</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>Z265969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clostridia Vaccine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone Scrub</td>
			<td>Aspen Veteterinary Resources</td>
			<td>21260221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>793213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% lidocaine HCl (10-15 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation of Mitochondria (liver)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-911-527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Motor</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04369-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04468-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto Pipette (10 mL)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL) with ice</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB100600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microfuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-002-441EW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab102536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>EDS-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (fatty acid free)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A7030-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M4125-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>38796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,&#160; pH 7.4 at 4 &#176;C, will last 2 days in refrigerator</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial Oxygen Comsuption</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode</td>
			<td>Hansatech (PP Systems)</td>
			<td>OXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoregulated Water Pump</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLE2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark type Oxygen electrode</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autopipette (1 mL)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-70</td>
			<td>Included with Oxy1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small magnetic stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (10 &#956;L)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P9333-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P5655-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M1028-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>E3889-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,&#160; pH 7.4 at 30 &#176;C with 0.3% defatted BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone (4 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>R8875-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate (1 M solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S3674-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP (100 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A5285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin (solution of 8 &#956;g/mL in ethanol)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP electrode</td>
			<td>World Precision Instruments.</td>
			<td>DRIREF-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malonate (0.1 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin (8 &#956;g/mL in ethanol), keep in freezer</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,&#160; pH 7.4 at 30 &#176;C with 0.3% defatted BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring liver mitochondrial oxygen consumption and proton leak kinetics to estimate mitochondrial respiration in holstein dairy cattle

Zuurstofverbruik proton motive force (PMF) en proton lek zijn metingen van de mitochondriale ademhaling, of hoe goed de mitochondriën zijn kundig voor bekeerling NADH en FADH in ATP. Aangezien mitochondriën ook de primaire site voor zuurstof gebruik en nutriënten oxidatie in kooldioxide en water zijn, hoe efficiënt ze zuurstof gebruiken en produceren van ATP rechtstreeks betrekking heeft op de efficiëntie van nutriënten metabolisme, voedingsstoffen eisen van het dier, en gezondheid van het dier. Het doel van deze methode is te onderzoeken van mitochondriale ademhaling, die kan worden gebruikt voor het bestuderen van de gevolgen van verschillende drugs, diëten en milieueffecten op mitochondriale metabolisme. Resultaten omvatten zuurstofverbruik gemeten als proton afhankelijke ademhaling (staat 3) en proton lek afhankelijke ademhaling (staat 4). De verhouding tussen staat 3 / staat 4 ademhaling wordt gedefinieerd als respiratoire controle verhouding (RCR) en mitochondriale energetische efficiëntie kan vertegenwoordigen. Mitochondriale proton lek is een proces waarmee dissipatie van Mitochondriale membraanpotentiaal (MMP) door ontkoppelingseiwit oxidatieve fosforylatie van ADP minderen van de efficiëntie van de ATP-synthese. Zuurstof en TRMP + gevoelige elektroden met mitochondriale substraten en elektronentransport keten remmers worden gebruikt als eenheid staat 3 en staat 4 ademhaling, mitochondriale membraan PMF (of het potentieel voor de productie van ATP) en proton lek. Beperkingen van deze methode zijn dat leverweefsel zo vers mogelijk moet en alle biopsies en tests moeten worden uitgevoerd in minder dan 10 h. Dit beperkt het aantal monsters dat kan worden verzameld en verwerkt door één persoon in een dag om ongeveer 5. Echter, slechts 1 g van leverweefsel nodig is, dus in grote dieren, zoals melkvee, de hoeveelheid monster nodig klein ten opzichte van de grootte van de lever is en er weinig hersteltijd nodig is.

Positieve resultaten tonen de RCR en proton lek kinetiek worden weergegeven in tabel 1 en Figuur 15, respectievelijk. In deze studie7, RCR en eiwit lek kinetiek werden gemeten in Holstein melkkoeien op 70 dagen pas in melk nadat koeien had 1 van 5 verschillende niveaus van Cu, Zn en Mn gevoederd gedurende 28 dagen. Staat 4, maximale proton lek-afhankelijke ademhaling, had de neiging te worden beïnvloed door minerale i...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle at JoVE.com

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

We delen hier, methoden voor het meten van mitochondriale zuurstofverbruik, een bepalende concept van nutritionele energetics en proton lek, de primaire oorzaak van inefficiëntie in mitochondriale generatie van ATP. Deze resultaten kunnen goed voor 30% van de energie verloren in nutriënten gebruik om te helpen evalueren van mitochondriale functie.

Meten lever mitochondriale zuurstofverbruik en Proton lek kinetiek te schatten van mitochondriale ademhaling in Holstein melkvee

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van energetica, zoals mitochondriale gezondheid, energetische efficiëntie en energieverbruik. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zuurstofverbruik van geïsoleerde mitochondriën direct wordt gemeten. Resultaten hoeven niet te worden gecorrigeerd voor andere intracellulaire metabolische processen.We hebben eerst besloten om deze methode in melkvee voort te zetten toen we wilden onderzoeken hoe mitochondriale efficiëntie de efficiëntie van het voer beïnvloedt. Video demonstratie van deze methode is van cruciaal belang als de stappen in mitochondriale isolatie zijn moeilijk te leren, omdat ze nodig hebben om consistent en nauwkeurig te zijn. Zo snel mogelijk nadat het levermonster uit de koe is verwijderd, was het monster in mitochondriën isolatiemedia om de rode bloedcellen te verwijderen.Met behulp van een schaar fijn gehakt het weefsel in een gekoeld beker dat genoeg isolatie media bevat om het weefsel vochtig te houden. Breng de gehakte lever in een 30-milliliter glazen flacon met mitochondriën isolatie media. Voeg een Teflon stamper die een klaring van 0,16 millimeter heeft en die is geïncubeerd in ijs en homogeniseren het levermonster op 500 RPM gedurende een minuut met vier slagen per minuut.Breng hierna het homogenaat over op een buis met mitochondriënisolementmedia en plaats dit in een beterde beker met ijs. Centrifuge homogenaat op 500 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Gooi de pellet weg en breng de supernatant over op een gekoelde centrifugebuis.Centrifuge de resulterende supernatant op 10,000 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten om de mitochondriale pellet te verkrijgen. Resuspend en was de pellet in 10 milliliter mitochondriën isolatie media met vetzuurvrije BSA. Dan centrifugeren op 8, 100 keer G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Gooi de supernatant weg en verleg de pellet in 200 microliter isolatiemedia. Plaats dit op ijs tot klaar voor gebruik voor het zuurstofverbruik en protonlek kinetische testen. Bepaal de eiwitconcentratie van de pelletsuspensie met behulp van een bicinchoninic zuurkit per instructies van de fabrikant met BSA als standaard.Maak eerst zuurstofconsumptiemedia zoals beschreven in het tekstprotocol. Broed het zuurstofverbruik media op 30 graden Celsius. Stel vervolgens de ademhalingskamer, pomp- en zuurstofelektrode voor het oxygraafsysteem in volgens de instructies van de fabrikant.Plaats vervolgens een milliliter zuurstofconsumptiemedia in de ademhalingskamer. Voeg vervolgens 0,35 milligram mitochondriaal eiwit toe aan de kamer. Roer krachtig om ervoor te zorgen dat de oplossing verzadigd raakt met lucht en een temperatuur van 30 graden Celsius te behouden.Nota van het zuurstofverbruik gedurende ongeveer vijf minuten. Wanneer het zuurstofverbruik constant wordt, wordt dit weergegeven door een dalende rechte lijn, registreert u dit als het zuurstofverbruik bij de basislijn. Voeg 1,25 microliter van een vier-millimolar rotenone oplossing om complexe te remmen, en voeg vervolgens vijf microliters van een molaire beknopte oplossing om een definitieve concentratie van vijf millimolar succinate in de ademhalingskamer te bereiken.Dit is het zuurstofverbruik van staat IV. Voeg hierna een microliter van een ADP-oplossing van 100 millimolar toe om een uiteindelijke concentratie van 100 micromolar in de ademhalingskamer te bereiken. Het zuurstofverbruik neemt ongeveer vijf minuten af en wordt dan een rechte lijn.Record dit zuurstofverbruik als de toestand III ademhaling. Bereken de ademcontroleverhouding zoals beschreven in het tekstprotocol. Dan aspirate alle oplossingen uit de ademhalingskamer.Spoel de kamer meerdere malen af met dubbel gedeïmiseerd water. Bereid eerst een oplossing voor van 80 nanogram per milliliter nigericine in ethanol die de hoeveelheid ethanol beperkt die wordt toegevoegd tot minder dan één microliter. Bereid ook een oplossing voor van acht microgram per milliliter oligomycine in ethanol.Na het grondig spoelen van de kamer met dubbel gedeïmiseerd water, plaats een milliliter van de zuurstofconsumptie media in de ademhalingskamer en roer krachtig met een magnetische roerstaaf. Voeg 0,35 milligram mitochondriaal eiwit toe aan de ademhalingskamer. Voeg een methyl triphenylphosphonium-gevoelige elektrode toe aan de kameropstelling om ervoor te zorgen dat het andere uiteinde goed is aangesloten op een pH-meter.Voeg 1,25 microliter van een vier-millimolar rotenone oplossing toe om Complex I.Record de ademhaling gedurende twee tot vijf minuten te remmen. Nota van de waarde van het zuurstofverbruik wanneer deze constant wordt. Voeg vervolgens 0,56 microliter van een oligomycine-oplossing toe om het ADP-gebruik te remmen.Neem de ademhaling op voor ongeveer twee tot vijf minuten. Nota van de waarde van het zuurstofverbruik wanneer deze constant wordt. Voeg vervolgens 0,112 microliter van een 80 nanogram per milliliter nigericin oplossing toe om de pH-gradiënt over het mitochondriale binnenmembraan af te schaffen.Neem de ademhaling gedurende twee tot vijf minuten op en let op de waarde van het zuurstofverbruik wanneer deze constant wordt. Voeg vijf microliter van 10 millimolar methyl triphenylphosphonium oplossing aan de mitochondriale incubatie om te beginnen met de voorbereiding van een standaard curve. Herhaal deze toevoeging vier keer extra tot een totale concentratie van 2,5.micromolar is toegevoegd. Voeg hierna vijf microliters van één molaire beknopte oplossing toe aan de kamer om ademhaling te initiëren. Nota van de ademhaling totdat een stabiel spoor is bereikt.Voeg vervolgens malonaat toe om het systeem te titreren zoals beschreven in het tekstprotocol. In deze studie worden RCR en protonlekkinetiek gemeten in de melk van Holsteinse melkkoeien 70 dagen nadat de melkkoeien gedurende 28 dagen met verschillende niveaus van koper, zink en mangaan waren gevoederd. Staat IV ademhaling wordt gezien als de hoogste in koeien gezien lage niveaus van mangaan, maar is het laagst in de controle koeien, wat aangeeft dat mangaan een belangrijke rol speelt bij het minimaliseren van proton lek-afhankelijke ademhaling.Analyse van de leverprotonlekafhankelijke ademhaling toont aan dat deze ademhaling het grootst is bij koeien die met een laag mangaan worden behandeld en de laagste in controlekoeien. Deze resultaten bevestigen dat de lage mangaangroep de grootste status IV ademhaling heeft, terwijl de controlegroep het laagste heeft. Terwijl de voerefficiëntie hoger is in Angus-ossen die geboren zijn uit lage RFI-stieren dan hoge RFI-stieren, werd dit niet weerspiegeld in de mitochondriale RCR of de protonlekkinetiek.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alle flesjes en bekers op ijs te houden tijdens het verwerken van de mitochondriën. Na de ontwikkeling van deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van zuivelvoeding om de rol van mitochondriën efficiëntie in voerefficiëntie en mitochondriale functie in de lever te verkennen. Vergeet niet dat het werken met rotenone gevaarlijk kan zijn, en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen, oogbescherming en een goede BESCHERMINGsmiddelen moeten altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyses van mitochondriale Calcium toestroom in geïsoleerde Mitochondria en gekweekte cellen

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Meting van mitochondriale zuurstofverbruik in permeabel vezels van Drosophila met minimale hoeveelheden weefsel

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Meten en interpreteren van zuurstof verbruik geheel vliegen hoofd segmenten

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

Het meten van mitochondriale elektronenoverdrachtscomplexen in eerder bevroren hartweefsel van de nakomelingen van zeug: een model om door inspanning geïnduceerde mitochondriale bio-energetische veranderingen te beoordelen

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

High-throughput image-based kwantificering van mitochondriale DNA-synthese en -distributie

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

Zuurstofonafhankelijke assays om de mitochondriale functie bij zoogdieren te meten

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

Een verbeterde methode om mitochondriale contactplaatsen te isoleren

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Analyzing Mitochondrial Physiology and Bioenergetics in Fruit Flies

Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry

Exploring Mitochondrial Function and Chemical Toxicity Using Drosophila melanogaster (Video) | JoVE

Analyse van de mitochondriale functie in een Drosophila melanogaster PINK1 B9-Null-mutant met behulp van respirometrie met hoge resolutie

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy ...