Name: measuring liver mitochondrial oxygen consumption and proton leak kinetics to estimate mitochondrial respiration in holstein dairy cattle
Uploaded: 2018-11-30T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי קרנות Alltech פתח משרד החקלאות דרך המרכז לבריאות בעלי חיים מזון ב- UC דיוויס בית הספר לרפואה וטרינרית.

כל השיטות, פרוטוקול ולימודי המתוארים כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת קליפורניה, דייוויס.
1. לקבל את ביופסיה של הכבד של פרה חלב הולשטיין
הערה: ביופסיה של הכבד צריכה להתבצע על-ידי וטרינר מורשה. ביופסיות כבד יכול להתבצע ?...

<ol>
	<li>Brand, M. D., Divakaruni, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology. 26, 192-205 (2011).</li><li>Stephenson, E. J., Hawley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+in+metabolic+health:+A+genetic+and+environmental+tug+of+war.">Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).</li><li>Bartlett, K., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+B+oxidation.">Mitochondrial B oxidation.</a> European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).</li><li>Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+Consumption,+Respiratory+Control+Ratio+(RCR)+and+Mitochondrial+Proton+Leak+of+broilers+with+and+without+growth+enhancing+levels+of+minerals+supplementation+challenged+with+Eimeria+maxima+(Ei).">Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei).</a> Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).</li><li>Wallace, D. C., Fan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics,+epigenetics,+mitochondrial+genetics.">Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics.</a> Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).</li><li>Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+mitochondrial+bioenergetics+and+cardiolipin+in+aging.">Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging.</a> Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).</li><li>Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+mitochondrial+oxygen+consumption+and+efficiency+of+milk+production+in+lactating+Holstein+cows+supplemented+with+Copper,+Manganese+and+Zinc.">Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc.</a> Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).</li><li>Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+metabolism+and+performance+of+cattle.">Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle.</a> Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).</li><li>Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+mitochondrial+function+and+residual+feed+intake+in+Angus+steers.">The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers.</a> Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).</li><li>Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+residual+feed+intake+and+hepatic+mitochondrial+function+in+growing+beef+cattle.">Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle.</a> Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).</li><li>Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+liver+mitochondrial+respiration+and+proton+leak+kinetics+in+low+and+high+RFI+steers+from+two+lineages+of+RFI+Angus+bulls.">Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls.</a> ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).</li><li>Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+oxidants+in+biological+systems:+The+superoxide+theory+of+oxygen+toxicity.">Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity.</a> Free Radicals in Biology and Medicine. , 186-187 (1989).</li><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nutrient Requirements of Dairy Cattle. , (2001).</li><li>Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+energy+intake,+energy+expenditure,+and+aging.">Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging.</a> Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).</li><li>Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+control+of+immunity:+beyond+ATP.">Mitochondrial control of immunity: beyond ATP.</a> Nature. 17, 608-620 (2017).</li><li>Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+assays+of+respiratory+chain+complex+activity.">Biochemical assays of respiratory chain complex activity.</a> Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).</li><li>Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milk+yield+differences+between+1x+and+4x+milking+are+associated+with+changes+in+mammary+mitochondrial+number+and+milk+protein+gene+expression,+but+not+mammary+cell+apoptosis+or+SOCS+gene+expression.">Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression.</a> Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).</li><li>Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+high-fat+feeding+on+metabolic+efficiency+and+mitochondrial+oxidative+capacity+in+adult+rats.">Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats.</a> British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).</li><li>Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SirT1+regulates+energy+metabolism+and+response+to+caloric+restriction+in+mice.">SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice.</a> PloS One. 3 (3), e1759 (2008).</li><li>Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+dietary+lipid+composition+on+liver+mitochondria+from+mice+following+1+month+of+calorie+restriction.">The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction.</a> Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).</li><li>Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bioenergetic+health+index:+a+new+concept+in+mitochondrial+translational+research.">The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research.</a> Clinical Science. 127, 367-373 (2014).</li></ol>

הנקודה שבה רוב בפרוטוקול קבלת מדגם מייצג רקמת הכבד, מתחיל את ניתוקה של המיטוכונדריה בהקדם האפשרי לאחר ביופסיה. וריאציה במדידות נשימה הוא נמוך (טבלה 1) בשל תקופה קצרה בתחבורה ציבורית פרה למעבדה. כדי לצמצם את זמן תחבורה, מעבדה קטנה הוקם במשרד של החלב, דגימות הכבד גורשו למעבדה office כפי ...

המיטוכונדריה הם מאוד רגיש ללחץ, הסביבה התאית שלהם יכול לתרום למגוון רחב של מחלות מטבוליות. צריכת החמצן פרוטון דליפת בתוך המיטוכונדריה אינדיקטורים של המיטוכונדריה בריאות בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. בשיטות המתוארות הזה יעילות אנרגיה מיטוכונדריאלי הערכה של נייר באמצעות RCR מבוסס על צריכת חמצן עם וללא דליפה פרוטון. תוצאות אלו יכול להסביר 30% מהאנרגיה איבד ניצול מזין1. שינויים דליפת חמצן צריכת ואת פרוטון יכול לזהות בתפקוד מיטוכונדריאלי אשר תורם למחלות מטבוליות ותוצאות יעילות אנרגיה ירד. שיטות אלה יכולים לשמש גם כדי לבחון את ההשפעה של טיפולים שונים על נשימה מיטוכונדריאלי. המטרה הכוללת של מדידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי וקינטיקה הדליפה פרוטון הוא להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי ויעילות אנרגטית.
בעיות בתפקוד הכבד מיטוכונדריאלי כבר קשור למחלות רבות בבקר לחלב. היכולת של חילוף החומרים הסלולר כדי לעבור בין הפחמימות, השומנים דלקים להתמודדות עם גירעון האנרגיה הנקה מוקדם מושפעת את המספר והתפקוד של המיטוכונדריה בתא2. ליקויים ביכולת של המיטוכונדריה להסתגל הביקוש אנרגיה וβ-חמצון מוגבר יכול להוביל להצטברות של השומנים תאיים הקשורים עם תנגודת לאינסולין, עלול להוביל להיווצרות של כבד שומני בפרות חלב הנקה מוקדם. המיטוכונדריה, כמו האתר של הגוף קטון בייצור ושימוש, יכול לשחק תפקיד מפתח ketosis פרות חלב3. חוסר המיטוכונדריה או בתפקוד מיטוכונדריאלי תשפיע על דלק זמינות לפריפריה, יבואו לידי ביטוי שינויים צריכת חמצן או RCR.
שינויים בצריכת החמצן מיטוכונדריאלי בתגובה לדלקת. בת שבע יום פטם חולקו באופן אקראי לקבוצת נגוע Eimeria maxima ו שליטה קבוצה4. פטם זה לא עברה כגון האתגר היה צריכת חמצן נמוכה בשל דליפת פרוטון RCR גבוה המציין כי המיטוכונדריה הכבד להגיב לאתגר המערכת החיסונית על ידי הגדלת הדליפה פרוטון. בעת דליפת פרוטון ומגיבים הפקת מינים חמצן פעם אחת נחשב סימן של חוסר תפקוד ממברנה מיטוכונדריאלי, פוגעת יעילות אנרגטית, עכשיו זה ידוע שזה חשוב עבור ייבוא של חלבונים וסידן לתוך המיטוכונדריה5 , ובשביל הדור של חום1.
דליפת אלקטרונים בשרשרת הנשימה הופכת המיטוכונדריה רגישים ייצור מינים חמצן תגובתי, נזק חמצוני מיטוכונדריאלי קרום חלבונים, שומנים, דנ א מיטוכונדריאלי. כמו גיל המיטוכונדריה, נזק יכול להצטבר במיוחד כדי mtDNA גורם נוסף תפקוד חילוף החומרים מיטוכונדריאלי6 ו ולרגישות רבה יותר של הפרה למחלות. בפועל, חיות משק רבות אכלו רמות גבוהות של תוספי מזון כגון Cu, Zn, Mn כדי להגביר את הפונקציה נוגד חמצון. אולם, האכלה רמות גבוהות של Cu, Zn, Mn ירד ייצור החלב, גדלה צריכת חמצן בשל פרוטון דליפה (4 מצב הנשימה)7.
מחקרים קודמים על התפקיד של הפונקציה מיטוכונדריאלי ביעילות אנרגיה בבקר התמקדה שינויים צריכת החמצן מיטוכונדריאלי פרוטון הדליפה. אך מעט מחקרים פורסמו ב בקר לחלב והשווה רוב המסמכים יעילות הייצור בצורה של צריכת המזון שיורית (RFI) לפונקציה מיטוכונדריאלי ב בקר. השתנות בנשימה מיטוכונדריאלי המחירים נבחנו על ידי מדידת מצב 3, 4 והמדינה RCR ב הכבדים של פרות הולשטיין מניקות והן מניקות בשר פרות (אנגוס, Brangus והרפורד)8. החוקרים לא מצאו קשר בנשימה מיטוכונדריאלי עם צמיחה או חליבה תכונות עבור בקר אבל דיווחת מתאם בין נשימה מיטוכונדריאלי חליבה תכונות עבור Holsteins. שני מחקרים, RFI נמשל ב בקר תעריפי נשימה מיטוכונדריאלי (המדינה 3, 4 והמדינה RCR) שרירים המיטוכונדריה9,10. נשימה מיטוכונדריאלי המחירים השתנו בתגובה DMI, המחירים הנמוכים היו קשורים עם שוורים בשר פחות יעילה. במחקר אחר, RFI של שוורים מתוך שוורים RFI גבוה או נמוך הושוו עם שיעורי נשימה מיטוכונדריאלי וקינטיקה הדליפה פרוטון בין שתי הקבוצות של רומא11. ההבדלים היו בגלל רווח המאשרת למסקנה לזכות אינה לא ההשפעה נשימה מיטוכונדריאלי ב בקר.
בנייר זה, ניסוי בחינת הכבד RCR בתגובה 3 חמצון מינרלים להאכלת בקר לחלב מניקות מדגימה השימוש בשיטות למדידת צריכת החמצן במהלך המדינה 4 ואת המדינה 3 נשימה ומערכת PMF.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Liver Biopsy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument</td>
			<td>Sontec Instruments Englewood CO</td>
			<td>1103-904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-037-516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture needles</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Included with Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S2896 / S2646</td>
			<td># for handle and blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery towels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-129-6667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>Z168750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-314387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needles (22, 2 1/2)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MJ8881-200342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cow halter</td>
			<td>Tractor Supply Co.</td>
			<td>101966599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabbing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gauze squares (4x4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-246069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical scissors</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>Z265969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clostridia Vaccine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone Scrub</td>
			<td>Aspen Veteterinary Resources</td>
			<td>21260221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>793213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% lidocaine HCl (10-15 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation of Mitochondria (liver)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-911-527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Motor</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04369-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04468-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto Pipette (10 mL)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL) with ice</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB100600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microfuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-002-441EW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab102536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>EDS-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (fatty acid free)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A7030-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M4125-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>38796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,&#160; pH 7.4 at 4 &#176;C, will last 2 days in refrigerator</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial Oxygen Comsuption</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode</td>
			<td>Hansatech (PP Systems)</td>
			<td>OXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoregulated Water Pump</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLE2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark type Oxygen electrode</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autopipette (1 mL)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-70</td>
			<td>Included with Oxy1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small magnetic stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (10 &#956;L)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P9333-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P5655-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M1028-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>E3889-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,&#160; pH 7.4 at 30 &#176;C with 0.3% defatted BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone (4 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>R8875-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate (1 M solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S3674-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP (100 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A5285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin (solution of 8 &#956;g/mL in ethanol)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP electrode</td>
			<td>World Precision Instruments.</td>
			<td>DRIREF-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malonate (0.1 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin (8 &#956;g/mL in ethanol), keep in freezer</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,&#160; pH 7.4 at 30 &#176;C with 0.3% defatted BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring liver mitochondrial oxygen consumption and proton leak kinetics to estimate mitochondrial respiration in holstein dairy cattle

צריכת החמצן, פרוטון מניע כוח (PMF) ויש דליפת פרוטון המידות של נשימה מיטוכונדריאלי, או כמה טוב המיטוכונדריה הם מסוגלים להמיר NADH ו FADH ATP. מאז המיטוכונדריה הם גם האתר הראשי עבור השימוש החמצן וחמצון מזין פחמן דו-חמצני ומים, איך ביעילות הם להשתמש בחמצן, מייצרים ATP ישירות מתייחס יעילות חילוף החומרים התזונתיים, דרישות התזונתי של החיה, ו בריאות של החיה. מטרת שיטה זו היא לבחון את הנשימה מיטוכונדריאלי, אשר יכול לשמש כדי לבחון את ההשפעה של תרופות שונות, דיאטות and השפעות סביבתיות על חילוף החומרים מיטוכונדריאלי. התוצאות כוללות צריכת החמצן הנמדדת נשימה התלויים פרוטון (המדינה 3) ומערכת פרוטון הדליפה התלויים נשימה (4 המדינה). היחס של המדינה 4 3 / המדינה נשימה מוגדר יחס בקרת הנשימה (RCR) ולייצג מיטוכונדריאלי יעילות אנרגטית. פרוטון מיטוכונדריאלי הדליפה היא תהליך המאפשר פיזור של פוטנציאל הממברנה מיטוכונדריאלי (MMP) על ידי זרחון חמצוני uncoupling מ- ADP להפחתת היעילות של סינתזת ATP. חמצן ו- TRMP + אלקטרודות רגיש עם מצעים מיטוכונדריאלי, מעכבי שרשרת האלקטרונים תחבורה משמשות למדידת מצב 3 ו- 4 מצב נשימה, ממברנה מיטוכונדריאלי PMF (או פוטנציאל לייצר ATP), דליפת פרוטון. מגבלות לשיטה זו הם כי רקמת הכבד חייבים להיות טריים ככל האפשר, ביופסיות וכל מבחני חייב להתבצע תוך פחות מ 10 h. זה מגביל את מספר דוגמאות אשר ניתן לאסוף ולהשתמש שעובדו על-ידי אדם אחד ביום אחד כדי כ 5. עם זאת, רק 1 גרם של רקמת הכבד נדרש, כך בבעלי חיים גדולים, כגון בקר לחלב, כמות הדגימה הצורך הוא קטן יחסית לגודל כבד, יש מעט זמן ההחלמה הדרוש.

תוצאות חיוביות מציג קינטיקה הדליפה RCR ופרוטון מוצגים בטבלה 1 ו- 15 איור, בהתאמה. ב מחקר7, RCR ו חלבון הדליפה קינטיקה נמדדו ב פרות הולשטיין-70 יום בחלב אחרי הפרות היו הואכלו 1 של 5 רמות שונות של Zn, Cu, Mn במשך 28 ימים. המדינה 4, נשימה מקסימלית הפרוט?...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle at JoVE.com

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

כאן, אנו חולקים שיטות למדידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי, הגדרת המושג של energetics תזונתי, פרוטון הנזילה, הגורם העיקרי של חוסר היעילות בדור מיטוכונדריאלי של ATP. תוצאות אלו יכול להסביר 30% מהאנרגיה שקוע ניצול מזין כדי לעזור להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי.

מדידת צריכת החמצן מיטוכונדריאלי הכבד ואת פרוטון הדליפה קינטיקה להעריך נשימה מיטוכונדריאלי ב בקר לחלב הולשטיין

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האנרגטיות, כגון בריאות המיטוכונדריאלית, יעילות אנרגטית ושימוש באנרגיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי צריכת חמצן של מיטוכונדריה מבודדת נמדדת ישירות. אין צורך לתקן את התוצאות עבור תהליכים מטבוליים תאיים אחרים.החלטנו לראשונה להמשיך בשיטה זו בבקר חלב כשרצינו לבחון כיצד יעילות המיטוכונדריה משפיעה על יעילות המזון. הדגמת וידאו של שיטה זו היא קריטית כמו השלבים בבידוד המיטוכונדריאלי קשה ללמוד כי הם צריכים להיות עקביים ומדויקים. בהקדם האפשרי לאחר דגימת הכבד מוסר מן הפרה לשטוף את המדגם בתקשורת בידוד המיטוכונדריה כדי להסיר את תאי הדם האדומים.שימוש במספריים מרכך דק את הרקמה לתוך מקור מקורר המכיל מספיק מדיית בידוד כדי לשמור על הרקמה לחה. מעבירים את הכבד הטחון לבקבוקון זכוכית 30 מיליליטר המכיל תקשורת בידוד מיטוכונדריה. הוסף עלה טפלון כי יש אישור של 0.16 מילימטרים וזה כבר דגירה בקרח הומוגנית דגימת הכבד ב 500 סל"ד במשך דקה אחת עם ארבע משיכות לדקה.לאחר מכן, להעביר את homogenate לצינור המכיל תקשורת בידוד מיטוכונדריה ולמקם את זה לתוך מקור ארוז קרח. הומוגני צנטריפוגה ב 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. השליכו את גלולת הכדור והעברו את העל-טבעי לצינור צנטריפוגה צונן.צנטריפוגה supernatant וכתוצאה מכך ב 10, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להשיג את גלולת המיטוכונדריה. יש להתריע ולשטוף את גלולה ב-10 מיליליטר של מדיית בידוד מיטוכונדריה עם BSA נטול חומצות שומן. ואז צנטריפוגה ב 8, 100 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את גלולת הכדור ב-200 מיקרוליטרים של מדיית בידוד. מניחים את זה על קרח עד מוכן לשימוש עבור צריכת החמצן ואת דליפת פרוטונים מים קינטיים. לקבוע את ריכוז החלבון של ההשעיה גלולה באמצעות ערכת חומצה ביצינצ'ונית לכל הוראות היצרן באמצעות BSA כסטנדרט.תחילה, צור מדיה לצריכת חמצן כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הדגירה את אמצעי צריכת החמצן ב 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להגדיר את תא הנשימה, משאבה ואלקטרודה חמצן עבור מערכת oxygraph על פי הוראות היצרן.ואז למקם מיליליטר אחד של תקשורת צריכת חמצן לתא הנשימה. לאחר מכן מוסיפים 0.35 מיליגרם של חלבון מיטוכונדריאלי לתא. מערבבים במרץ כדי להבטיח כי הפתרון הופך רווי באוויר ולשמור על טמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.תקליט את צריכת החמצן במשך כחמש דקות. כאשר צריכת החמצן הופכת קבועה המיוצגת על ידי קו ישר יורד, רשום זאת כצריכת החמצן הבסיסית. הוסף 1.25 microliters של פתרון רוטנון ארבעה מילימולר כדי לעכב אחד מורכב, ולאחר מכן להוסיף חמישה microliters של פתרון אחד succinate טוחן כדי להגיע לריכוז סופי של חמישה סוצ'ילרים succinate בתא הנשימה.זוהי צריכת חמצן IV המדינה. לאחר מכן, להוסיף מיקרוליטר אחד של פתרון ADP 100 מילימולר כדי להגיע לריכוז סופי של 100 micromolar בתא הנשימה. צריכת החמצן תרד למשך כחמש דקות ולאחר מכן תהפוך לקו ישר.רשום את צריכת החמצן הזו כנשימה השלישית. חשב את יחס בקרת הנשימה כמפורט בפרוטוקול הטקסט. ואז לשאוף את כל הפתרונות מתוך תא הנשימה.שוטפים את התא מספר פעמים במים כפולים. ראשית, להכין פתרון של 80 ננוגרם למיליליטר של ניז'רין באתנול הגבלת כמות האתנול הוסיף פחות ממיקרוליטר אחד. כמו כן, להכין פתרון של שמונה מיקרוגרם לכל אוליגומיצין מיליליטר באתנול.לאחר שטיפה יסודית של התא במים כפולים, מניחים מיליליטר אחד של מדיית צריכת החמצן בתא הנשימה ומערבבים במרץ עם בר ערבוב מגנטי. מוסיפים 0.35 מיליגרם חלבון מיטוכונדריאלי לתא הנשימה. הוסף אלקטרודה רגישה למתיל טריפנילפוספוניום למערך התאים כדי לוודא שהצד השני מחובר כראוי למטר pH.הוסף 1.25 microliters של פתרון רוטנונה ארבעה מילימולר לעכב I.Record מורכב הנשימה במשך שתיים עד חמש דקות. רשום את ערך צריכת החמצן כאשר הוא הופך קבוע. לאחר מכן, להוסיף 0.56 microliters של פתרון אוליגומיצין כדי לעכב ניצול ADP.הקלט את הנשימה במשך כשתיים עד חמש דקות. רשום את ערך צריכת החמצן כאשר הוא הופך קבוע. לאחר מכן להוסיף 0.112 microliters של 80 ננוגרם לכל פתרון ניז'רין מיליליטר כדי לבטל את שיפוע ה- pH על פני הממברנה הפנימית המיטוכונדריאלית.הקלט נשימה במשך שתיים עד חמש דקות ושים לב לערך צריכת החמצן כאשר הוא הופך קבוע. הוסף חמישה microliters של 10 מילימולר מתיל טריפנילפוספוניום פתרון הדגירה המיטוכונדריאלית כדי להתחיל להכין עקומה סטנדרטית. חזור על תוספת זו ארבע פעמים נוספות עד ריכוז כולל של 2.5.מיקרומולר נוסף. לאחר מכן, להוסיף חמישה microliters של פתרון אחד לחות succinate לתא ליזום נשימה. הקלט את הנשימה עד להשגת עקבות יציבות.לאחר מכן הוסף מלונט כדי להפוך את המערכת כמפורט בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, RCR ו קינטיקה דליפת פרוטון נמדדים בחלב של פרות חולבות הולשטיין 70 ימים לאחר פרות חלב הוזנו עם רמות שונות של נחושת, אבץ, מנגן במשך 28 ימים. המדינה הרביעית הנשימה נתפסת להיות הגבוה ביותר בפרות נתון רמות נמוכות של מנגן, עדיין הוא הנמוך ביותר בפרות שליטה, המציין כי מנגן ממלא תפקיד חשוב במזעור נשימה תלויי דליפת פרוטון.ניתוח הנשימה תלוית דליפת הפרוטון בלחץ דם מגלה כי נשימה זו היא הגדולה ביותר בפרות שטופלו במנגן נמוך, והנמוך ביותר בפרות שליטה. תוצאות אלה מאשרות כי הקבוצה מנגן נמוך יש את המדינה הגדולה ביותר IV נשימה בעוד קבוצת הביקורת יש את הנמוך ביותר. בעוד יעילות ההזנה גבוהה יותר בהיגוי אנגוס שנולדו שוורים RFI נמוך מאשר שוורים גבוהים RFI, זה לא בא לידי ביטוי RCR המיטוכונדריאלי או קינטיקה דליפת פרוטון.בעת ביצוע הליך זה חשוב לשמור את כל הבקבוקונים והבקבוקונים על הקרח תוך עיבוד המיטוכונדריה. לאחר התפתחותה טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום תזונת החלב לחקור את התפקיד של יעילות המיטוכונדריה ביעילות ההזנה ותפקוד המיטוכונדריאלי בכבד. אל תשכח כי עבודה עם רוטנונה יכול להיות מסוכן, אמצעי זהירות כגון לבישת כפפות, הגנה על העיניים PPE הנכון תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

ניתוחים של סידן מיטוכונדריאלי זרם המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

מדידה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי של סיבי Permeabilized דרוזופילה באמצעות כמויות מינימליות של רקמות

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

מדידת ופרשנות חמצן קצב הצריכה כולה לטוס הראש מקטעים

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

מדידת מתחמי העברת אלקטרונים מיטוכונדריאליים ברקמת לב קפואה בעבר מצאצאי החזירה: מודל להערכת שינויים ביו-אנרגטית מיטוכונדריאליים הנגרמים על ידי פעילות גופנית

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

כימות מבוסס תמונה בתפוקה גבוהה של סינתזה והפצה של DNA מיטוכונדריאלי

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

בדיקות שאינן תלויות בחמצן למדידת תפקוד המיטוכונדריה ביונקים

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

שיטה משופרת לבידוד אתרי מגע מיטוכונדריאליים

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Analyzing Mitochondrial Physiology and Bioenergetics in Fruit Flies

Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry

Exploring Mitochondrial Function and Chemical Toxicity Using Drosophila melanogaster (Video) | JoVE

ניתוח תפקוד מיטוכונדריאלי במוטנט Drosophila melanogaster PINK1B9-Null באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy ...