Name: measuring liver mitochondrial oxygen consumption and proton leak kinetics to estimate mitochondrial respiration in holstein dairy cattle
Uploaded: 2018-11-30T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle at JoVE.com

इस शोध Alltech और USDA हैच धन द्वारा खाद्य पशु स्वास्थ्य के लिए UC डेविस स्कूल में पशु चिकित्सा के केंद्र के माध्यम से समर्थन किया गया था ।

सभी तरीकों, प्रोटोकॉल और अध्ययन यहां वर्णित संस्थागत पशु देखभाल और विश्वविद्यालय के कैलिफोर्निया, डेविस के उपयोग की समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. एक Holstein डेयरी गाय से एक जिगर बायोप्सी ...

<ol>
	<li>Brand, M. D., Divakaruni, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology. 26, 192-205 (2011).</li><li>Stephenson, E. J., Hawley, J. 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K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bioenergetic+health+index:+a+new+concept+in+mitochondrial+translational+research.">The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research.</a> Clinical Science. 127, 367-373 (2014).</li></ol>

प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण बिंदु एक प्रतिनिधि जिगर ऊतक नमूने प्राप्त करने और बायोप्सी के बाद जितनी जल्दी हो सके mitochondria के अलगाव की शुरुआत है । श्वसन मापन में भिन्नता कम है (तालिका 1) गाय से प्रयो?...

Mitochondria बहुत तनाव के प्रति संवेदनशील होते है और उनके सेलुलर वातावरण चयापचय रोगों की एक विस्तृत विविधता के लिए योगदान कर सकते हैं । ऑक्सीजन की खपत और mitochondria में प्रोटॉन रिसाव mitochondria स्वास्थ्य के संकेतक हैं । इस पेपर में वर्णित विधियों का अनुमान mitochondrial ऊर्जा दक्षता के साथ और प्रोटॉन रिसाव के बिना ऑक्सीजन खपत पर आधारित RCR का उपयोग कर । इन परिणामों के पोषक तत्व उपयोग1में खो ऊर्जा का 30% के लिए खाते में कर सकते हैं । ऑक्सीजन की खपत और प्रोटॉन रिसाव में परिवर्तन mitochondrial रोग है जो चयापचय रोग और कम ऊर्जा दक्षता में परिणाम के लिए योगदान की पहचान कर सकते हैं । इन तरीकों को भी mitochondrial श्वसन पर विभिंन उपचार के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । mitochondrial ऑक्सीजन की खपत और प्रोटॉन रिसाव कैनेटीक्स को मापने के समग्र लक्ष्य के लिए mitochondrial समारोह और ऊर्जावान दक्षता का आकलन है ।
यकृत mitochondrial रोग डेयरी मवेशियों में कई बीमारियों के साथ जुड़ा हुआ है । सेलुलर चयापचय की क्षमता कार्बोहाइड्रेट और लिपिड ईंधन के बीच स्विच करने के लिए जब जल्दी स्तनपान में एक ऊर्जा घाटे के साथ सामना करना पड़ा संख्या और सेल में mitochondria के समारोह से प्रभावित है2। mitochondria की क्षमता में दोष ऊर्जा के लिए एक वृद्धि की मांग के लिए अनुकूल करने के लिए और वृद्धि हुई β-ऑक्सीकरण इंसुलिन प्रतिरोध के साथ जुड़े intracellular लिपिड के संचय के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और जल्दी स्तनपान डेयरी गायों में फैटी लीवर के गठन के लिए ले सकता है । Mitochondria, कीटोंन शरीर के उत्पादन और उपयोग की साइट के रूप में, डेयरी गायों3में ketosis में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं । mitochondria या mitochondrial शिथिलता की कमी की परिधि के लिए ईंधन की उपलब्धता को प्रभावित करेगा और ऑक्सीजन की खपत या RCR में परिवर्तन में परिलक्षित होगा ।
सूजन के जवाब में Mitochondrial ऑक्सीजन की खपत में बदलाव । सात दिन पुराने विवादों बेतरतीब ढंग से एक Eimeria maxima और एक नियंत्रण समूह4से संक्रमित समूह को सौंपा गया । विवाद करने वालों कि coccidiosis चुनौती से गुजरना नहीं था कम ऑक्सीजन की वजह से प्रोटॉन रिसाव और उच्च RCR का संकेत है कि जिगर mitochondria प्रोटॉन रिसाव में वृद्धि से एक प्रतिरक्षा चुनौती का जवाब की खपत थी । जबकि प्रोटॉन रिसाव और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन एक बार mitochondrial झिल्ली शिथिलता और ऊर्जावान दक्षता के लिए हानिकारक का संकेत माना जाता था, अब यह ज्ञात है कि यह mitochondria में प्रोटीन और कैल्शियम के आयात के लिए महत्वपूर्ण है5 , और1गर्मी की पीढ़ी के लिए ।
श्वसन श्रृंखला से इलेक्ट्रॉन रिसाव प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन और mitochondrial झिल्ली प्रोटीन, लिपिड और mitochondrial डीएनए को ऑक्सीडेटिव क्षति के लिए अतिसंवेदनशील mitochondria बनाता है । के रूप में mitochondria उंर, नुकसान विशेष रूप से mitochondrial चयापचय6 में आगे की शिथिलता और रोग के लिए गाय की अधिक संवेदनशीलता पैदा mtDNA के लिए जमा कर सकते हैं । व्यवहार में, कई पशुधन जानवरों की खुराक के उच्च स्तर जैसे घन, Zn और Mn के लिए एंटीऑक्सीडेंट समारोह को बढ़ावा देने के लिए खिलाया जाता है । हालांकि, घन, Zn और Mn के उच्च स्तर खिला दूध उत्पादन में कमी आई और प्रोटॉन रिसाव (राज्य 4 श्वसन) के कारण ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि हुई7।
मवेशियों में ऊर्जा क्षमता में mitochondrial समारोह की भूमिका पर पिछले अनुसंधान mitochondrial ऑक्सीजन की खपत और प्रोटॉन रिसाव में परिवर्तन पर ध्यान केंद्रित किया है । बहुत कुछ अध्ययनों से दुधारू मवेशियों में प्रकाशित किया गया है और अधिकांश कागजात अवशिष्ट फ़ीड सेवन (RFI) के रूप में उत्पादन क्षमता की तुलना मांस मवेशियों में mitochondrial समारोह के लिए । mitochondrial श्वसन दरों में परिवर्तनशीलता दोनों स्तनपान कराने वाली Holstein गायों और स्तनपान कराने वाली बीफ़ गायों (एंगस, Brangus और Hereford)8से जिगर में राज्य 3, राज्य 4 और RCR को मापने के द्वारा जांच की गई । शोधकर्ताओं ने mitochondrial श्वसन में कोई संबंध वृद्धि या मांस मवेशियों के लिए दुहना लक्षण के साथ नहीं मिला, लेकिन mitochondrial श्वसन और Holsteins के लिए गुण दुहना के बीच एक संबंध की रिपोर्ट किया था । दो अध्ययनों में, RFI मांस मवेशियों की तुलना में mitochondrial श्वसन दर (राज्य 3, राज्य 4 और RCR) मांसपेशी mitochondria9,10में किया गया था । Mitochondrial श्वसन दर DMI और कम दरों के जवाब में बदल कम कुशल बीफ़ बिजनस के साथ जुड़े थे । एक अन्य अध्ययन में, उच्च या निम्न RFI सांडों से RFI की तुलना mitochondrial श्वसन दरों और संतान के दो समूहों के बीच प्रोटॉन रिसाव कैनेटीक्स से की गई11. मतभेदों को निष्कर्ष है कि लाभ बीफ़ मवेशियों में mitochondrial श्वसन प्रभाव नहीं है पुष्टि लाभ के कारण थे ।
इस पत्र में, एक प्रयोग के जवाब में जिगर RCR की जांच 3 एंटीऑक्सीडेंट खनिजों स्तनपान कराने वाली डेयरी पशु के लिए तरीकों का उपयोग करने के लिए 4 राज्य और राज्य 3 श्वसन और PMF के दौरान ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए दिखाता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Liver Biopsy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument</td>
			<td>Sontec Instruments Englewood CO</td>
			<td>1103-904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-037-516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture needles</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Included with Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S2896 / S2646</td>
			<td># for handle and blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery towels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-129-6667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>Z168750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-314387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needles (22, 2 1/2)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MJ8881-200342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cow halter</td>
			<td>Tractor Supply Co.</td>
			<td>101966599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabbing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gauze squares (4x4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-246069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical scissors</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>Z265969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clostridia Vaccine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone Scrub</td>
			<td>Aspen Veteterinary Resources</td>
			<td>21260221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>793213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% lidocaine HCl (10-15 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation of Mitochondria (liver)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-911-527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Motor</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04369-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04468-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto Pipette (10 mL)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL) with ice</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB100600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microfuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-002-441EW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab102536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>EDS-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (fatty acid free)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A7030-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M4125-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>38796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,&#160; pH 7.4 at 4 &#176;C, will last 2 days in refrigerator</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial Oxygen Comsuption</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode</td>
			<td>Hansatech (PP Systems)</td>
			<td>OXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoregulated Water Pump</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLE2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark type Oxygen electrode</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autopipette (1 mL)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-70</td>
			<td>Included with Oxy1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small magnetic stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (10 &#956;L)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P9333-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P5655-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M1028-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>E3889-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,&#160; pH 7.4 at 30 &#176;C with 0.3% defatted BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone (4 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>R8875-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate (1 M solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S3674-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP (100 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A5285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin (solution of 8 &#956;g/mL in ethanol)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP electrode</td>
			<td>World Precision Instruments.</td>
			<td>DRIREF-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malonate (0.1 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin (8 &#956;g/mL in ethanol), keep in freezer</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,&#160; pH 7.4 at 30 &#176;C with 0.3% defatted BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring liver mitochondrial oxygen consumption and proton leak kinetics to estimate mitochondrial respiration in holstein dairy cattle

ऑक्सीजन की खपत, प्रोटॉन मकसद बल (PMF) और प्रोटॉन रिसाव mitochondrial श्वसन की माप कर रहे हैं, या कितनी अच्छी तरह mitochondria नध में और फॊध को एटीपी में परिवर्तित करने में सक्षम हैं. चूंकि mitochondria भी ऑक्सीजन का उपयोग करें और कार्बन डाइऑक्साइड और पानी के लिए पोषक तत्व ऑक्सीकरण के लिए प्राथमिक साइट हैं, कैसे कुशलतापूर्वक वे ऑक्सीजन का उपयोग करें और एटीपी का उत्पादन सीधे पोषक तत्व चयापचय, पशु के पोषक तत्वों की आवश्यकताओं की दक्षता से संबंधित है, और पशु का स्वास्थ्य । इस विधि के प्रयोजन के लिए mitochondrial श्वसन, जो विभिंन दवाओं, आहार और mitochondrial चयापचय पर पर्यावरणीय प्रभाव के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की जांच है । परिणाम में शामिल है ऑक्सीजन की खपत के रूप में मापा प्रोटॉन निर्भर श्वसन (राज्य 3) और प्रोटॉन रिसाव निर्भर श्वसन (राज्य 4). राज्य 3/राज्य के अनुपात में 4 श्वसन श्वसन नियंत्रण अनुपात (RCR) के रूप में परिभाषित किया गया है और mitochondrial ऊर्जावान दक्षता का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं । Mitochondrial प्रोटॉन रिसाव एक प्रक्रिया है कि Mitochondrial झिल्ली क्षमता के अपव्यय की अनुमति देता है (एमएमपी) द्वारा uncouplन ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण से ADP एटीपी संश्लेषण की दक्षता कम. mitochondrial सब्सट्रेट और इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला अवरोधकों के साथ ऑक्सीजन और TRMP + संवेदनशील इलेक्ट्रोड राज्य 3 और राज्य 4 श्वसन, mitochondrial झिल्ली PMF (या एटीपी का उत्पादन करने की क्षमता) और प्रोटॉन रिसाव को मापने के लिए उपयोग किया जाता है । इस विधि के लिए सीमाएं है कि जिगर ऊतक के रूप में संभव के रूप में ताजा होना चाहिए और सभी बायोप्सी और परख से कम 10 में प्रदर्शन किया जाना चाहिए एच । यह उन नमूनों की संख्या को सीमित करता है जिंहें एक दिन में किसी एकल व्यक्ति द्वारा लगभग 5 तक संग्रहीत और संसाधित किया जा सकता है । हालांकि, जिगर ऊतक के केवल 1 जी की जरूरत है, इसलिए बड़े जानवरों में, ऐसे दुधारू मवेशी के रूप में, आवश्यक नमूना की मात्रा जिगर के आकार के लिए छोटे रिश्तेदार है और वहाँ कम वसूली समय की जरूरत है.

RCR और प्रोटॉन रिसाव कैनेटीक्स दिखा सकारात्मक परिणाम क्रमशः तालिका 1 और चित्रा 15में दिखाए जाते हैं । इस अध्ययन में7, RCR और प्रोटीन रिसाव कैनेटीक्स Holstein डेयरी गायों मे?...

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Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

यहां, हम mitochondrial ऑक्सीजन की खपत, पोषण ऊर्जावान की एक परिभाषित अवधारणा को मापने के लिए तरीकों का हिस्सा है, और प्रोटॉन रिसाव, एटीपी के mitochondrial पीढ़ी में अक्षमता का प्राथमिक कारण । इन परिणामों के लिए पोषक तत्व उपयोग में खो ऊर्जा के 30% के लिए खाते में मदद mitochondrial समारोह का मूल्यांकन कर सकते हैं ।

मापने जिगर Mitochondrial ऑक्सीजन की खपत और प्रोटॉन रिसाव कैनेटीक्स Holstein डेयरी मवेशियों में Mitochondrial श्वसन अनुमान करने के लिए

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

यह विधि ऊर्जावान क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रश्नों के उत्तर देने में मदद कर सकती है, जैसे माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य, ऊर्जावान दक्षता और ऊर्जा उपयोग। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि अलग-थलग माइटोकॉन्ड्रिया की ऑक्सीजन खपत को सीधे मापा जाता है। परिणाम अन्य इंट्रासेलुलर मेटाबोलिक प्रक्रियाओं के लिए सही करने की आवश्यकता नहीं है।हमने पहली बार डेयरी मवेशियों में इस विधि को आगे बढ़ाने का फैसला किया जब हम इस बात की जांच करना चाहते थे कि माइटोकॉन्ड्रियल दक्षता कैसे प्रभावित होती है। इस विधि का वीडियो प्रदर्शन महत्वपूर्ण है क्योंकि माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव में कदम सीखना मुश्किल है क्योंकि उन्हें सुसंगत और सटीक होने की आवश्यकता है। जितनी जल्दी हो सके जिगर का नमूना गाय से हटा दिया जाता है लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया आइसोलेशन मीडिया में नमूना धोने।कैंची का उपयोग बारीक एक ठंडा बीकर है कि पर्याप्त अलगाव मीडिया शामिल करने के लिए ऊतक नम रखने में ऊतक बारीक कीमा । कीमा बनाया हुआ जिगर को 30 मिलीलीटर ग्लास शीशी में स्थानांतरित करें जिसमें माइटोकॉन्ड्रिया आइसोलेशन मीडिया होता है। एक टेफ्लॉन मूसल जोड़ें जिसमें 0.16 मिलीमीटर की निकासी है और जिसे बर्फ में इनक्यूबेटेड किया गया है और प्रति मिनट चार स्ट्रोक के साथ एक मिनट के लिए 500 आरपीएम पर यकृत के नमूने को समरूप बनाया गया है।इसके बाद, समरूप को माइटोकॉन्ड्रिया आइसोलेशन मीडिया युक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे बर्फ से भरे बीकर में रखें। सेंट्रलाइज समरूप 500 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए। गोली को त्यागें और सुपरनेट को एक ठंडा सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।माइटोकॉन्ड्रियल गोली प्राप्त करने के लिए 10 मिनट के लिए 10, 000 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर परिणामी सुपरनेटेंट को अपकेंद्रित्र करें। फैटी एसिड मुक्त बीएसए के साथ माइटोकॉन्ड्रिया आइसोलेशन मीडिया के 10 मिलीलीटर में गोली को फिर से रीसुस्पेंड और धोएं। इसके बाद 8, 100 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेंट्रलाइज करें।सुपरनैंट को त्यागें और आइसोलेशन मीडिया के 200 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से खर्च करें। ऑक्सीजन की खपत और प्रोटोन रिसाव गतिज परख के लिए उपयोग करने के लिए तैयार होने तक इसे बर्फ पर रखें। मानक के रूप में बीएसए का उपयोग कर निर्माता के निर्देशों के प्रति एक bicinchoninic एसिड किट का उपयोग कर गोली निलंबन की प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें।सबसे पहले, पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित ऑक्सीजन खपत मीडिया बनाएं। ऑक्सीजन की खपत मीडिया को 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें । इसके बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार ऑक्सीग्राफ सिस्टम के लिए श्वसन कक्ष, पंप और ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड स्थापित करें।फिर ऑक्सीजन की खपत मीडिया के एक मिलीलीटर को श्वसन कक्ष में रखें। फिर कक्ष में 0.35 मिलीग्राम माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन जोड़ें। यह सुनिश्चित करने के लिए सख्ती से हिलाएं कि समाधान हवा से संतृप्त हो जाता है और 30 डिग्री सेल्सियस तापमान बनाए रखता है।लगभग पांच मिनट के लिए ऑक्सीजन की खपत रिकॉर्ड। जब ऑक्सीजन की खपत लगातार एक कम सीधी रेखा द्वारा प्रतिनिधित्व हो जाता है, बेसलाइन ऑक्सीजन की खपत के रूप में यह रिकॉर्ड । जटिल एक को बाधित करने के लिए चार-मिलीमोलर रोटेनोन समाधान के 1.25 माइक्रोलीटर जोड़ें, और फिर श्वसन कक्ष में पांच मिलीमोलर के अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए एक मोलर सुसिएट समाधान के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें।यह राज्य चतुर्थ ऑक्सीजन की खपत है। इसके बाद, श्वसन कक्ष में 100 माइक्रोमोलर की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 100-मिलीमोलर एडीपी समाधान का एक माइक्रोलीटर जोड़ें। ऑक्सीजन की खपत लगभग पांच मिनट के लिए कम हो जाएगा और फिर एक सीधी रेखा बन जाएगा ।इस ऑक्सीजन की खपत को राज्य III श्वसन के रूप में रिकॉर्ड करें। पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित श्वसन नियंत्रण अनुपात की गणना करें। फिर श्वसन कक्ष से बाहर समाधान के सभी आकांक्षी।डबल डिविशन्ड पानी से कई बार चैंबर खंगाल डाला। सबसे पहले, इथेनॉल की मात्रा को एक माइक्रोलीटर से कम करने के लिए जोड़े गए इथेनॉल की मात्रा को सीमित करने में इथेनॉल के प्रति मिलीलीटर प्रति मिलीलीटर 80 नैनोग्राम का समाधान तैयार करें। साथ ही इथेनॉल में आठ माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर ओलिगोमाइसिन का घोल तैयार करें।डबल डिओनाइज्ड पानी के साथ कक्ष को अच्छी तरह से धोने के बाद, ऑक्सीजन खपत मीडिया के एक मिलीलीटर को श्वसन कक्ष में रखें और चुंबकीय हलचल बार के साथ सख्ती से हिलाएं। श्वसन कक्ष में 0.35 मिलीग्राम माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन जोड़ें। चैंबर सेटअप में मिथाइल ट्राइफेनाइलफॉफोन-सेंसिटिव इलेक्ट्रोड जोड़ें जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि दूसरा छोर पीएच मीटर से ठीक से जुड़ा हुआ है।कॉम्प्लेक्स I.रिकॉर्ड श्वसन को दो से पांच मिनट के लिए बाधित करने के लिए चार-मिलीमोलर रोटेनोन समाधान के 1.25 माइक्रोलीटर जोड़ें। स्थिर होने पर ऑक्सीजन की खपत मूल्य रिकॉर्ड करें। इसके बाद, एडीपी उपयोग को बाधित करने के लिए ओलिगोमाइसिन समाधान के 0.56 माइक्रोलीटर जोड़ें।श्वसन को लगभग दो से पांच मिनट तक रिकॉर्ड करें। स्थिर होने पर ऑक्सीजन की खपत मूल्य रिकॉर्ड करें। फिर माइटोकॉन्ड्रियल इनर झिल्ली में पीएच ढाल को समाप्त करने के लिए 80 नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर नाइजरिन समाधान के 0.112 माइक्रोलीटर जोड़ें।दो से पांच मिनट के लिए रिकॉर्ड श्वसन और ऑक्सीजन की खपत मूल्य ध्यान दें जब यह स्थिर हो जाता है । एक मानक वक्र तैयार करना शुरू करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल इनक्यूबेशन में 10 मिलीमोलर मिथाइल ट्रिपफेनाइलफोकोनियम समाधान के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें। 2.5 की कुल एकाग्रता तक इस अतिरिक्त चार अतिरिक्त बार दोहराएं।माइक्रोमोलर को जोड़ा गया है। इसके बाद, श्वसन शुरू करने के लिए कक्ष में एक मोलर सुसिएट समाधान के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें। श्वसन रिकॉर्ड जब तक एक स्थिर ट्रेस प्राप्त किया है।फिर पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रणाली को टिट्रेट करने के लिए मैलोनेट जोड़ें। इस अध्ययन में, आरसीआर और प्रोटोन रिसाव काइनेटिक्स को होल्स्टीन डेयरी गायों के दूध में मापा जाता है ७० दिन बाद डेयरी गायों को 28 दिनों के लिए तांबे, जस्ता और मैंगनीज के अलग स्तर के साथ खिलाया गया था । राज्य चतुर्थ श्वसन मैंगनीज के कम स्तर को देखते हुए गायों में सबसे अधिक देखा जाता है, अभी तक नियंत्रण गायों में सबसे कम है, यह दर्शाता है कि मैंगनीज प्रोटोन रिसाव पर निर्भर श्वसन को कम करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है ।हेपेटिक प्रोटॉन रिसाव पर निर्भर श्वसन के विश्लेषण से पता चलता है कि यह श्वसन कम मैंगनीज के साथ इलाज गायों में सबसे बड़ा है, और नियंत्रण गायों में सबसे कम है । ये परिणाम इस बात की पुष्टि करते हैं कि कम मैंगनीज समूह में सबसे बड़ी राज्य चतुर्थ श्वसन है जबकि नियंत्रण समूह में सबसे कम है। जबकि उच्च आरएफआई बैल की तुलना में कम आरएफआई बैल से पैदा हुए एंगस स्टीलर्स में फ़ीड दक्षता अधिक है, यह माइटोकॉन्ड्रियल आरसीआर या प्रोटोन रिसाव काइनेटिक्स में परिलक्षित नहीं हुआ था।इस प्रक्रिया को करते समय माइटोकॉन्ड्रिया को संसाधित करते समय सभी शीशियों और बीकर्स को बर्फ पर रखना महत्वपूर्ण है। इसके विकास के बाद इस तकनीक ने डेयरी पोषण के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए आहार दक्षता और जिगर में माइटोकॉन्ड्रिया कार्य में माइटोकॉन्ड्रिया दक्षता की भूमिका का पता लगाने का मार्ग प्रशस्त किया। यह न भूलें कि रोटेनोन के साथ काम करना खतरनाक हो सकता है, और इस प्रक्रिया को करते समय दस्ताने पहनने, आंखों की सुरक्षा और उचित पीपीई जैसी सावधानियां हमेशा ली जानी चाहिए।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

पाड़ Liposomes का उपयोग लिपिड-समीपस्थ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पुनर्गठित करने<em&gt; इन विट्रो</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

अलग Mitochondria और प्रसंस्कृत कोशिकाओं में Mitochondrial कैल्शियम आमद का विश्लेषण

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

ऊतक की न्यूनतम मात्रा का उपयोग Drosophila के Permeabilized फाइबर में Mitochondrial ऑक्सीजन की खपत का मापन

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

मापने और पूरे मक्खी प्रमुख क्षेत्रों में ऑक्सीजन की खपत दर की व्याख्या

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

बोने की संतानों से पहले जमे हुए कार्डियक ऊतक में माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर कॉम्प्लेक्स को मापना: व्यायाम-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जेटिक्स परिवर्तनों का आकलन करने के लिए एक मॉडल

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए संश्लेषण और वितरण की उच्च-थ्रूपुट छवि-आधारित परिमाणीकरण

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

स्तनधारियों में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को मापने के लिए ऑक्सीजन-स्वतंत्र परख

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

माइटोकॉन्ड्रियल संपर्क साइटों को अलग करने के लिए एक बेहतर तरीका

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Analyzing Mitochondrial Physiology and Bioenergetics in Fruit Flies

Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry

Exploring Mitochondrial Function and Chemical Toxicity Using Drosophila melanogaster (Video) | JoVE

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर PINK1B9-अशक्त उत्परिवर्ती में उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का विश्लेषण करना

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy ...