Name: measuring liver mitochondrial oxygen consumption and proton leak kinetics to estimate mitochondrial respiration in holstein dairy cattle
Uploaded: 2018-11-30T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle at JoVE.com

이 연구 센터를 통해 Alltech 및 USDA 해치 자금 음식 동물 건강에 UC 데이비스 수의 학부의 지원 한다.

모든 메서드, 프로토콜 및 여기서 설명 하는 연구 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 캘리포니아 대학, 데이비스 승인 되었다.
1. 홀스타인 낙농 암소에서 간 생 검을 얻기
참고: 간 생 검은 허용한 수 의사에 의해 수행 되어야 한다. 간 생 검 젖소는 유제품 사이트에 수행할 수 있습니다. 일반적으로 젖을 계속 젖이 젖소 그리고 우유 식량 공급 절차 전후...

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K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bioenergetic+health+index:+a+new+concept+in+mitochondrial+translational+research.">The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research.</a> Clinical Science. 127, 367-373 (2014).</li></ol>

프로토콜에서 가장 중요 한 포인트는 대표 간 조직 샘플을 얻기 이며 생 후 즉시 미토 콘 드리 아의 격리를 시작. 호흡 측정에 변이 실험실으로 암소에서 짧은 전송 시간으로 인해 낮은 (표 1). 전송 시간을 줄이기 위해, 작은 실험실 세워졌다는 유제품의 사무실에서 그리고 각 미토 콘 드리 아 생의 10 분 안에 고립 됐다 있도록 수집으로 간 샘플 사무실 실험실에 기반 했다. 설치 및 사?...

미토 콘 드리 아 스트레스에 매우 민감합니다 그리고 그들의 세포질 환경 다양 한 대사 질환에 기여할 수 있다. 산소 소비와 양성자 누출 미토 콘 드리 아에는 미토 콘 드리 아 건강의 지표입니다. 산소 소비와 양성자 누출 없이 RCR을 사용 하 여이 종이 견적 미토 콘 드 리아 에너지 효율에 설명 된 방법을 기반으로 합니다. 이러한 결과 영양소 사용률1에서 손실 에너지의 30%에 대 한 계정 수 있습니다. 산소 소비와 양성자 누출에 변화는 신진 대사 질환에 기여 하 고 감소 에너지 효율에서 결과 미토 콘 드 리아 기능 장애를 식별할 수 있습니다. 이러한 방법 또한 미토 콘 드리 아 호흡에 다른 처리의 효과 검사를 사용할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아 산소 소비와 양성자 누출 속도 측정의 전반적인 목표는 미토 콘 드리 아 기능 및 에너지 효율 평가입니다.
간 미토 콘 드 리아 기능 장애 젖소에 여러 가지 질병으로 연결 되었습니다. 수 유 초기에 에너지 적자를 직면 하는 때 지질과 탄수화물 연료 전환 세포질 물질 대사 수 숫자 셀2에 미토 콘 드리 아의 기능에 의해 좌우 된다. 에너지와 증가 β-산화에 대 한 증가 수요에 적응 하는 미토 콘 드리 아의 능력에 결함이 인슐린 저항와 관련 된 세포내 지질의 축적으로 이어질 수 있습니다 그리고 젖소 초 유에에서 지방 간의 형성으로 이어질 수 있습니다. 미토 콘 드리 아, 케 톤 체 생산 및 사용의 사이트로 젖소3ketosis에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아 또는 미토 콘 드 리아 기능 장애의 부족 주변에 연료 가용성에 영향을 미칠 것이 고 산소 소비 또는 RCR 변화에 반영.
염증 반응의 미토 콘 드리 아 산소 소비 변화입니다. 7-하루-오래 된 브로 일러에 감염 된 Eimeria 맥시 마 와 제어 그룹4그룹에 무작위로 지정 되었다. Coccidiosis 도전 받아야 하지 않았다 broilers 양성자 누출 및 높은 RCR 간 미토 콘 드리 아 증가 양성자 누출에 의해 면역도 전에 대응을 나타내는 낮은 산소 소비를 했다. 양성자 누출 동안 및 반응성 산소 종 생산 미토 콘 드 리아 멤브레인 부전의 상징으로 간주 한 번 했다 고 에너지 효율, 해로운 지금 알려져 있다 미토 콘 드리 아5 으로 단백질과 칼슘의 가져오기에 대 한 중요 하다는 것 열1의 세대에 대 한.
호흡기 체인에서 전자 누출에 게 미토 콘 드리 아 반응 산소 종 생산 및 산화 손상에 취약 미토 콘 드 리아 멤브레인 단백질, 지질 및 미토 콘 드리 아 DNA. 미토 콘 드리 아 나이, 손상 더 미토 콘 드리 아 대사6 에 더 큰 민감성 질병에 암소의 부전을 일으키는 mtDNA를 특히 누적 될 수 있습니다. 실제로, 많은 가축 동물 보충 항 산화 기능을 강화 하는 Cu, Zn와 Mn 등의 상부를 먹인 다. 그러나, 높은 수준의 Cu, Zn와 Mn 우유 생산 감소 유와 양성자 누출 (상태 4 호흡)7인 산소 소비를 증가.
미토 콘 드 리아 기능 가축에 에너지 효율에서의 역할에 대 한 이전 연구는 미토 콘 드리 아 산소 소비와 양성자 누출에 변화에 집중 했다. 젖소에 거의 연구 출판 되었습니다 및 대부분 논문 쇠고기 가축에 미토 콘 드리 아 기능에 잔여 먹이 섭취 (RFI)의 형태로 생산 효율을 비교 합니다. 미토 콘 드리 아 호흡 속도 양모 홀스타인 암소를 젖을 쇠고기 간에서 주 3, 주 4 및 RCR을 측정 하 여 시험 되었다 다양성 소 (앵거스, Brangus와 헤 리)8. 연구원은 성장 또는 쇠고기 가축에 대 한 특성을 짤 미토 콘 드리 아 호흡에 어떤 상관 관계를 찾지 못했습니다 하지만 미토 콘 드리 아 호흡 및 우유 홀스타인 열에 대 한 특성 간의 상관 관계를 보고 했다. 두 연구, RFI 근육 mitochondria9,10에 미토 콘 드리 아 호흡 요금 (3, 4 주와 RCR 상태) 쇠고기 가축에 비교 되었다. 미토 콘 드리 아 호흡 속도 DMI에 대 한 응답에서 변경 하 고 낮은 속도 덜 효율적인 쇠고기 steers와 관련 되었다. 또 다른 연구에서는, 높은 또는 낮은 RFI 불스에서 steers의 RFI 미토 콘 드리 아 호흡 속도 양성자 누출 속도 론 자손11의 두 그룹 사이 비교 되었다. 차이 때문에 이득 얻을 결론 쇠고기 가축에서 미토 콘 드리 아 호흡을 영향 하지 않습니다 확인 했다.
이 논문에서는, 실험 3 항 산화 미네랄 양모 젖소를 먹이에 대 한 응답 RCR에서는 측정 하는 방법 사용 하는 간 검사 중 산소 소비 4 고 3 호흡 및 PMF 상태.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Liver Biopsy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument</td>
			<td>Sontec Instruments Englewood CO</td>
			<td>1103-904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-037-516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture needles</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Included with Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S2896 / S2646</td>
			<td># for handle and blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery towels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-129-6667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>Z168750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-314387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needles (22, 2 1/2)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MJ8881-200342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cow halter</td>
			<td>Tractor Supply Co.</td>
			<td>101966599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabbing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gauze squares (4x4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-246069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical scissors</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>Z265969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clostridia Vaccine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone Scrub</td>
			<td>Aspen Veteterinary Resources</td>
			<td>21260221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>793213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% lidocaine HCl (10-15 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation of Mitochondria (liver)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-911-527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Motor</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04369-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04468-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto Pipette (10 mL)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL) with ice</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB100600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microfuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-002-441EW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab102536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>EDS-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (fatty acid free)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A7030-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M4125-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>38796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,&#160; pH 7.4 at 4 &#176;C, will last 2 days in refrigerator</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial Oxygen Comsuption</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode</td>
			<td>Hansatech (PP Systems)</td>
			<td>OXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoregulated Water Pump</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLE2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark type Oxygen electrode</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autopipette (1 mL)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-70</td>
			<td>Included with Oxy1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small magnetic stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (10 &#956;L)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P9333-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P5655-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M1028-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>E3889-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,&#160; pH 7.4 at 30 &#176;C with 0.3% defatted BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone (4 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>R8875-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate (1 M solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S3674-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP (100 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A5285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin (solution of 8 &#956;g/mL in ethanol)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP electrode</td>
			<td>World Precision Instruments.</td>
			<td>DRIREF-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malonate (0.1 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin (8 &#956;g/mL in ethanol), keep in freezer</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,&#160; pH 7.4 at 30 &#176;C with 0.3% defatted BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring liver mitochondrial oxygen consumption and proton leak kinetics to estimate mitochondrial respiration in holstein dairy cattle

산소 소비, 양성자 동기 힘 (PMF) 그리고 양성자 누출 측정의 미토 콘 드리 아 호흡, 또는 얼마나 잘 미토 콘 드리 아 ATP로 NADH와 FADH 변환할 수 있습니다. 미토 콘 드리 아도 산소 사용 및 이산화탄소와 물에 영양분 산화에 대 한 기본 사이트 이기 때문에, 그들이 얼마나 효율적으로 산소를 사용 하 고 직접 ATP를 생산 영양소 대사의 효율성에 관한 동물의 영양소 요구 사항 및 동물의 건강입니다. 이 방법의 목적은 다른 약물, 다이어트와 미토 콘 드리 아 대사에 환경에 미치는 영향의 효과 검사 하는 데 사용할 수 있습니다 미토 콘 드리 아 호흡을 살펴보는 것입니다. 결과 산소 소비를 양성자 종속 호흡 (주 3) 및 양성자 누출 종속 호흡 (주 4)으로 측정 포함 됩니다. 주 3 / 주 4 호흡의 비율 호흡 제어 비율 (RCR)로 정의 되 고 미토 콘 드리 아 에너지 효율을 나타낼 수 있습니다. 미토 콘 드 리아 양성자 누출에서 ADP ATP 합성의 효율을 감소 연결을 푸는 산화 인 산화에 의해 미토 콘 드리 아 막 잠재적인 (MMP)의 소비를 허용 하는 프로세스입니다. 미토 콘 드리 아 기질 및 전자 수송 체인 억제제 산소와 TRMP + 민감한 전극 상태 3 주 4 호흡, 미토 콘 드 리아 멤브레인 PMF (또는 ATP 생산 잠재력)를 측정 하는 데 사용는 양성자 누출. 이 방법에 한계는 간 조직을 최대한 신선한 해야 모든 생 검 및 분석 실험 10 h이 하에서 수행 되어야 합니다. 이 샘플을 수집 하 고 약 5 하루에 한 사람에 의해 처리 수의 수를 제한 합니다. 그러나, 간 조직 1 g만 필요, 그래서 젖소와 같은 큰 동물에 필요한 샘플의 금액은 간 크기에 상대적으로 작은 작은 복구 시간이 필요 합니다.

RCR와 양성자 누출 속도 보여주는 긍정적인 결과 각각 표 1 과 그림 15에 표시 됩니다. 이 연구7, RCR 및 단백질 누출에서 속도 론 측정 되었다 홀스타인 젖소에서 우유에 70 일 후 소는 28 일에 대 한 Cu, Zn와 Mn의 5 가지 레벨의 1을 공급 했다. 주 4, 최대 양성자 누출 종속 호흡, Cu, Mn, Zn (p < 0.1)의 미네랄 섭취에 의해 영?...

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Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

여기, 우리는 미토 콘 드리 아 산소 소비, 영양에 너 지론, 및 양성자 누출, 미토 콘 드리 아에서 ATP 비능률적의 주요 원인의 정의 개념을 측정 하기 위한 방법 공유. 이러한 결과 미토 콘 드리 아 기능을 평가할 수 있도록 영양소 사용률에 에너지의 30%에 대 한 계정 수 있습니다.

홀스타인 젖소에서 미토 콘 드리 아 호흡 추정 간 미토 콘 드리 아 산소 소비와 양성자 누출 속도 론 측정

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

이 방법은 미토콘드리아 건강, 에너지 효율 및 에너지 사용과 같은 에너지 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고립 된 미토콘드리아의 산소 소비가 직접 측정된다는 것입니다. 결과는 다른 세포 내 신진 대사 과정에 대해 수정 할 필요가 없습니다.우리는 먼저 미토콘드리아 효율이 공급 효율성에 미치는 영향을 조사하고 싶었을 때 유제품 가축에서이 방법을 추구하기로 결정했습니다. 이 방법의 비디오 데모는 미토콘드리아 격리의 단계가 일관되고 정확해야 하기 때문에 배우기 어렵기 때문에 중요합니다. 간 샘플을 제거한 후 가능한 한 빨리 소에서 제거된 후 미토콘드리아 격리 매체에서 샘플을 세척하여 적혈구를 제거한다.가위를 사용하여 조직을 미세하게 진정된 비커로 다진데, 이 비커에는 조직을 촉촉하게 유지하기에 충분한 격리 매체가 들어 있습니다. 미토콘드리아 격리 매체를 함유한 30밀리리터 유리 바이알로 다진 간을 옮기다. 0.16 밀리미터의 클리어런스를 가지고 있으며 얼음에서 배양된 테플론 유봉을 넣고 500 RPM에서 분당 4스트로크로 1분 동안 간 샘플을 균질화합니다.그 후, 균주를 미토콘드리아 격리 매체가 들어있는 튜브로 옮기고 얼음으로 가득찬 비커에 넣습니다. 원심분리기는 G 500회, 섭씨 4도에서 10분간 동종합니다. 펠릿을 버리고 상체를 차가운 원심분리기 튜브로 옮춥니다.미토콘드리아 펠릿을 얻기 위해 10, 000배, 섭씨 4도에서 10분간 생성된 상체원분리. 지방산이 없는 BSA를 사용하여 미토콘드리아 격리 매체의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 세척하십시오. 그런 다음 원심 분리기는 8, 100 배 G, 섭씨 4도에서 10 분 동안.상체를 버리고 격리 매체의 200 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 산소 소비와 양성자 누출 운동 분석에 사용할 준비가 될 때까지 얼음에 이것을 놓습니다. BSA를 사용하여 제조업체의 지침당 bicinchoninicacid 산 키트를 사용하여 펠릿 현탁액의 단백질 농도를 결정합니다.먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 산소 소비 미디어를 만듭니다. 산소 소비 매체를 섭씨 30도에서 배양합니다. 다음으로, 제조업체의 지시에 따라 옥시그래프 시스템에 대한 호흡챔버, 펌프 및 산소 전극을 설정한다.그런 다음 산소 소비 매체 의 1 밀리리터를 호흡 실에 놓습니다. 그런 다음 챔버에 미토콘드리아 단백질0.35 밀리그램을 추가합니다. 용액이 공기로 포화되고 섭씨 30도의 온도를 유지하기 위해 적극적으로 저어줍니다.약 5분 동안 산소 소비를 기록합니다. 산소 소비가 감소하는 직선으로 일정하게 표시되면 이를 기준산소 소비로 기록하십시오. 복잡한 용액을 억제하기 위해 4 밀리 마일러 로테네 용액의 1.25 마이크로 리터를 추가 한 다음 1 개의 어금니 간편 한 용액의 5 마이크로 리터를 추가하여 호흡실에서 간결한 5 밀리머의 최종 농도에 도달하십시오.이것은 상태 IV 산소 소비. 그 후, 100밀리머 ADP 용액의 마이크로리터 1개를 추가하여 호흡실에서 100마이크로몰러의 최종 농도에 도달한다. 산소 소비는 약 5 분 동안 감소하고 직선이 될 것입니다.상태 III 호흡으로이 산소 소비를 기록합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 호흡 제어 비율을 계산합니다. 그런 다음 호흡 실에서 모든 솔루션을 흡인합니다.이중 탈이온된 물로 챔버를 여러 번 헹구는 다. 먼저, 에탄올에서 나이지리아의 밀리리터당 80나노그램의 용액을 준비하여 1편 미만의 마이크로리터에 첨가된 에탄올의 양을 제한한다. 또한, 에탄올에서 밀리리터 올리고마이신 당 8 마이크로그램의 용액을 준비한다.이중 산화물로 챔버를 철저히 헹구고 산소 소비 매체 1밀리리터를 호흡실에 넣고 자기 교반 바에 힘차게 저어줍니다. 호흡 챔버에 미토콘드리아 단백질0.35 밀리그램을 추가합니다. 메틸 트리페닐포스포늄에 민감한 전극을 챔버 셋업에 추가하여 다른 쪽 끝이 pH 미터에 제대로 연결되어 있는지 확인합니다.복합 I.레코드 2 ~5 분 동안 호흡을 억제하기 위해 4 밀리 머 롤러 로테네 솔루션의 1.25 마이크로 리터를 추가합니다. 산소 소비 값을 일정하게 되면 기록합니다. 다음으로, ADP 활용도를 저해하기 위해 올리고마이신 용액의 0.56 마이크로리터를 추가합니다.호흡을 약 2~5분 동안 기록합니다. 산소 소비 값을 일정하게 되면 기록합니다. 그런 다음 밀리리터 니제르리시틴 용액당 80 나노그램의 0.112 마이크로리터를 추가하여 미토콘드리아 내막을 가로지르는 pH 그라데이션을 폐지한다.2~5분 동안 호흡을 기록하고 일정해질 때 산소 소비 값을 기록합니다. 표준 곡선을 준비하기 시작하기 위해 미토콘드리아 인큐베이션에 10 밀리머메틸 메틸 트리헤닐 포스포늄 용액 5개소소기를 첨가한다. 총 농도가 2.5일 때까지 이 추가를 4회 더 반복합니다.마이크로몰러가 추가되었습니다. 그 후, 호흡을 시작하기 위해 챔버에 하나의 어금니 간결한 용액의 5 개의 마이크로 리터를 추가합니다. 안정적인 추적이 이루어질 때까지 호흡을 기록합니다.그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 시스템을 적티레이에 말로나테를 추가합니다. 이 연구에서 RCR 및 양성자 누출 운동학은 젖소가 28 일 동안 구리, 아연 및 망간의 다른 수준으로 공급 된 후 70 일 후에 홀스타인 낙농 소의 우유에서 측정됩니다. 상태 IV 호흡은 망간의 낮은 수준을 주어진 소에서 가장 높은 것으로 볼 수 있습니다, 아직 제어 소에서 가장 낮은, 망간 양성자 누출 의존 호흡을 최소화에 중요한 역할을 나타냅니다.간 간 누출 의존호흡의 분석은 이 호흡이 낮은 망간으로 취급된 소에서 가장 크고, 통제소에서 가장 낮다는 것을 보여줍니다. 이러한 결과는 낮은 망간 그룹이 가장 큰 상태 IV 호흡을 가지고 있음을 확인하며 대조군은 가장 낮다. 높은 RFI 황소보다 낮은 RFI 황소에서 태어난 앵거스 조인에서 사료 효율이 높지만, 이것은 미토콘드리아 RCR 또는 양성자 누출 운동학에 반영되지 않았습니다.이 절차를 수행하는 동안 미토콘드리아를 처리하는 동안 얼음에 모든 바이알과 비커를 유지하는 것이 중요합니다. 개발 후이 기술은 간에서 공급 효율과 미토콘드리아 기능에 미토콘드리아 효율의 역할을 탐구하는 유제품 영양 분야의 연구자들을위한 길을 열었습니다. 로테네톤으로 일하는 것은 위험할 수 있으며, 장갑, 눈 보호 및 적절한 PPE 착용과 같은 예방 조치는 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 칼슘 유입의 분석

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

조직의 최소 금액을 사용 하 여 초파리의 Permeabilized 섬유에 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

측정 및 해석의 전체 산소 소비 속도 비행 머리 세그먼트

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

소우의 자손에서 이전에 냉동 된 심장 조직에서 미토콘드리아 전자 전송 복합체 측정 : 운동 유발 미토콘드리아 생물 에너지 변화를 평가하는 모델

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

미토콘드리아 DNA 합성 및 분포의 고처리량 이미지 기반 정량화

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

미토콘드리아 접촉 부위를 분리하는 개선된 방법

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Analyzing Mitochondrial Physiology and Bioenergetics in Fruit Flies

Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry

Exploring Mitochondrial Function and Chemical Toxicity Using Drosophila melanogaster (Video) | JoVE

고분해능 호흡 측정법을 사용한 초파리 멜라노가스터 PINK1B9-Null 돌연변이의 미토콘드리아 기능 분석

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy ...