Name: measuring liver mitochondrial oxygen consumption and proton leak kinetics to estimate mitochondrial respiration in holstein dairy cattle
Uploaded: 2018-11-30T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av Alltech og USDA Luke midler gjennom Center for mat dyr sunnhet på UC Davis skolen av Veterinary-medisin.

Alle metoder, protokollen og studier beskrevet her ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of California, Davis.
1. få en lever biopsi fra en Holstein melkekyr
Merk: En leveren biopsi bør utføres av en med lisens veterinarian. Leveren biopsies kan utføres på meieri området der kyrne er plassert. Ammende mjølkekyr kan fortsette å bli melket normalt og melk trenger ikke å bli trukket fra matforsyningen før eller ett...

<ol>
	<li>Brand, M. D., Divakaruni, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology. 26, 192-205 (2011).</li><li>Stephenson, E. J., Hawley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+in+metabolic+health:+A+genetic+and+environmental+tug+of+war.">Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).</li><li>Bartlett, K., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+B+oxidation.">Mitochondrial B oxidation.</a> European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).</li><li>Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+Consumption,+Respiratory+Control+Ratio+(RCR)+and+Mitochondrial+Proton+Leak+of+broilers+with+and+without+growth+enhancing+levels+of+minerals+supplementation+challenged+with+Eimeria+maxima+(Ei).">Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei).</a> Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).</li><li>Wallace, D. C., Fan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics,+epigenetics,+mitochondrial+genetics.">Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics.</a> Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).</li><li>Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+mitochondrial+bioenergetics+and+cardiolipin+in+aging.">Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging.</a> Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).</li><li>Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+mitochondrial+oxygen+consumption+and+efficiency+of+milk+production+in+lactating+Holstein+cows+supplemented+with+Copper,+Manganese+and+Zinc.">Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc.</a> Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).</li><li>Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+metabolism+and+performance+of+cattle.">Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle.</a> Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).</li><li>Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+mitochondrial+function+and+residual+feed+intake+in+Angus+steers.">The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers.</a> Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).</li><li>Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+residual+feed+intake+and+hepatic+mitochondrial+function+in+growing+beef+cattle.">Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle.</a> Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).</li><li>Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+liver+mitochondrial+respiration+and+proton+leak+kinetics+in+low+and+high+RFI+steers+from+two+lineages+of+RFI+Angus+bulls.">Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls.</a> ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).</li><li>Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+oxidants+in+biological+systems:+The+superoxide+theory+of+oxygen+toxicity.">Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity.</a> Free Radicals in Biology and Medicine. , 186-187 (1989).</li><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nutrient Requirements of Dairy Cattle. , (2001).</li><li>Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+energy+intake,+energy+expenditure,+and+aging.">Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging.</a> Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).</li><li>Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+control+of+immunity:+beyond+ATP.">Mitochondrial control of immunity: beyond ATP.</a> Nature. 17, 608-620 (2017).</li><li>Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+assays+of+respiratory+chain+complex+activity.">Biochemical assays of respiratory chain complex activity.</a> Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).</li><li>Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milk+yield+differences+between+1x+and+4x+milking+are+associated+with+changes+in+mammary+mitochondrial+number+and+milk+protein+gene+expression,+but+not+mammary+cell+apoptosis+or+SOCS+gene+expression.">Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression.</a> Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).</li><li>Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+high-fat+feeding+on+metabolic+efficiency+and+mitochondrial+oxidative+capacity+in+adult+rats.">Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats.</a> British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).</li><li>Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SirT1+regulates+energy+metabolism+and+response+to+caloric+restriction+in+mice.">SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice.</a> PloS One. 3 (3), e1759 (2008).</li><li>Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+dietary+lipid+composition+on+liver+mitochondria+from+mice+following+1+month+of+calorie+restriction.">The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction.</a> Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).</li><li>Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bioenergetic+health+index:+a+new+concept+in+mitochondrial+translational+research.">The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research.</a> Clinical Science. 127, 367-373 (2014).</li></ol>

Det mest kritiske punktet i protokollen er å få en representant leveren Vevsprøve og begynner isolering av mitokondrier så snart som mulig etter biopsi. Variasjon i åndedrett målinger er lav (tabell 1) på grunn av en kort tid fra kua til laboratoriet. For å redusere transporttid, lite laboratorium ble satt opp på kontoret til meieriet, og lever prøver ble kjørt til office laboratoriet som hver ble samlet inn slik at mitokondrier ble isolert i 10 min av biopsi. Oppsett og testing av åndedrett ...

Mitokondrier er svært følsom for stress og mobilnettet miljøet kan bidra til en rekke metabolske sykdommer. Oksygenforbruk og proton lekkasje i mitokondrier er indikatorer mitokondrier helse. Metodene som er beskrevet i dette papir estimat mitokondrie energieffektiviteten med RCR basert på oksygenforbruk med og uten proton lekkasje. Disse resultatene kan utgjør 30% av energien går tapt i næringsstoffer utnyttelse1. Endringer i oksygen forbruk og proton lekkasjen kan identifisere mitokondrie dysfunksjon som bidrar til metabolsk sykdom og resulterer i redusert energieffektivitet. Disse metodene kan også brukes til å undersøke effekten av ulike behandlinger på mitokondrie åndedrett. Det overordnede målet med måle mitokondrie oksygenforbruk og proton lekkasje kinetics er å vurdere mitokondrie funksjon og energisk effektivitet.
Hepatic mitokondrie dysfunksjon er tilknyttet flere sykdommer i melkeku. Muligheten av cellenes stoffskifte å bytte mellom karbohydrater og lipid brensel Når møtt med en energi underskudd i tidlig amming er påvirket av antall og funksjon av mitokondrier i celle2. Feil i mitokondrier evnen til å tilpasse seg en økt etterspørsel etter energi og økt β-oksidasjon kan føre til opphopning av intracellulær lipid assosiert med insulinresistens og kan føre til dannelse av fettlever i tidlig amming mjølkekyr. Mitochondria, kan som stedet for keton kroppen produksjon og bruk, spille en nøkkelrolle i ketosis i mjølkekyr3. Manglende mitokondrier eller mitokondrie dysfunksjon vil påvirke drivstoff tilgjengelighet til periferien og gjenspeiles endringer i oksygenforbruk eller RCR.
Mitokondrielt oksygen forbruk endringer i respons til betennelse. Syv dager gamle slaktekylling ble randomisert til en gruppe infisert med Eimeria maxima og en kontroll gruppe4. Slaktekylling som ikke gjennomførte coccidiosis utfordring hadde lavere oksygenforbruk proton lekkasje og høyere RCR indikerer at leveren mitokondrier svare på en immun utfordring ved økende proton lekkasje. Mens proton lekkasje og reaktive oksygen arter produksjon ble en gang betraktet som et tegn på mitokondrie membran dysfunksjon og skadelig for energisk effektivitet, nå det er kjent at det er viktig for import av proteiner og kalsium i mitokondrier5 , og for generering av varme1.
Elektron lekkasje fra åndedretts kjeden gjør mitochondria reaktive oksygen arter produksjon og oksidative skader mitokondrie membran proteiner, lipider og Mitokondrielt DNA. Som mitokondrier alder, skade kan akkumulere spesielt til mtDNA forårsaker ytterligere dysfunksjon i mitokondrie metabolisme6 og større mottakelighet av kua sykdommen. I praksis fôres mange husdyr dyr høye nivåer av kosttilskudd som Cu, Zn og Mn å øke antioksidant-funksjonen. Men fôring høye nivåer av Cu, Zn og Mn redusert melk produksjon og økte oksygenopptak på grunn av proton lekkasje (staten 4 åndedrett)7.
Tidligere forskning rollen mitokondrie funksjon i energieffektiviteten i storfe har fokusert på endringer i mitokondrie oksygenforbruk og proton lekkasje. Svært få studier har blitt publisert i melkeku og de fleste avisene sammenligne effektivitet i form av gjenværende fôrinntak (RFI) mitokondrie funksjonen i storfe. Variasjon i mitokondrie åndedrett priser ble undersøkt av måle staten 3, staten 4 og RCR i lever fra både ammende Holstein kyr og ammende storfekjøtt kyr (Angus, Brangus og Hereford)8. Forskerne fant ikke noen sammenheng i mitokondrie åndedrett med vekst eller melking trekk for storfe, men rapporterte en sammenheng mellom mitokondrie åndedrett og melking trekk for Holsteins. I to studier, ble RFI sammenlignet i storfe til mitokondrie åndedrett priser (staten 3, staten 4 og RCR) i muskel mitokondrier9,10. Mitokondrielt åndedrett tallene endret svar DMI og lave priser var assosiert med mindre effektiv biff styrer. I en annen studie, RFI av styrer fra høyt eller lavt RFI okser ble sammenlignet med mitokondrie åndedrett priser og proton lekkasje kinetics mellom de to gruppene av avkom11. Det skyldtes forskjeller under vinning bekrefter konklusjonen at få gjør ikke effekten mitokondrie åndedrett i storfe.
I dette papiret, et eksperiment for å undersøke leveren RCR svar på fôring 3 antioksidant mineraler til ammende melkeku illustrerer bruken av metoder for å måle oksygenopptak ved 4 og 3 åndedrett og PMF.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Liver Biopsy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument</td>
			<td>Sontec Instruments Englewood CO</td>
			<td>1103-904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-037-516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture needles</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Included with Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S2896 / S2646</td>
			<td># for handle and blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery towels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-129-6667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>Z168750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-314387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needles (22, 2 1/2)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MJ8881-200342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cow halter</td>
			<td>Tractor Supply Co.</td>
			<td>101966599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabbing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gauze squares (4x4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-246069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical scissors</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>Z265969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clostridia Vaccine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone Scrub</td>
			<td>Aspen Veteterinary Resources</td>
			<td>21260221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>793213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% lidocaine HCl (10-15 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation of Mitochondria (liver)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-911-527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Motor</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04369-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04468-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto Pipette (10 mL)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL) with ice</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB100600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microfuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-002-441EW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab102536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>EDS-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (fatty acid free)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A7030-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M4125-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>38796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,&#160; pH 7.4 at 4 &#176;C, will last 2 days in refrigerator</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial Oxygen Comsuption</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode</td>
			<td>Hansatech (PP Systems)</td>
			<td>OXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoregulated Water Pump</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLE2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark type Oxygen electrode</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autopipette (1 mL)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-70</td>
			<td>Included with Oxy1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small magnetic stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (10 &#956;L)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P9333-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P5655-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M1028-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>E3889-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,&#160; pH 7.4 at 30 &#176;C with 0.3% defatted BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone (4 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>R8875-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate (1 M solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S3674-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP (100 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A5285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin (solution of 8 &#956;g/mL in ethanol)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP electrode</td>
			<td>World Precision Instruments.</td>
			<td>DRIREF-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malonate (0.1 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin (8 &#956;g/mL in ethanol), keep in freezer</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,&#160; pH 7.4 at 30 &#176;C with 0.3% defatted BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring liver mitochondrial oxygen consumption and proton leak kinetics to estimate mitochondrial respiration in holstein dairy cattle

Oksygenforbruk, proton motiv kraft (PMF) og proton lekkasjen er målinger av mitokondrie åndedrett, eller hvor godt mitokondrier er kjøpedyktig konvertere NADH og FADH i ATP. Siden mitochondria er også det primære området for bruk av oksygen og næringsstoffer oksidasjon karbondioksid og vann, hvor effektivt de bruker oksygen og produsere ATP direkte gjelder effektiviteten av metabolisme til næringsstoff, næringsinnhold krav for dyret, og helse av dyret. Formålet med denne metoden er å undersøke mitokondrie åndedrett, som kan brukes til å undersøke virkningene av ulike, dietter og miljømessige effekter på mitokondrie metabolismen. Resultatene omfatter oksygenforbruk målt som proton avhengige åndedrett (staten 3) og proton lekkasje avhengige respirasjon (staten 4). Forholdet mellom staten 3 / stat 4 åndedrett defineres som åndedretts kontroll forhold (RCR) og kan representere mitokondrie energisk effektivitet. Mitokondrielt proton lekkasjen er en prosess der spredning av mitokondrie membran potensial (MMP) ved uncoupling oxidative fosforylering fra ADP redusere effektiviteten av ATP syntese. Oksygen og TRMP + følsom elektroder med mitokondrie underlag og elektronet transport kjeden hemmere brukes til å måle staten 3 og staten 4 åndedrett, mitokondrie membran PMF (eller potensial til å produsere ATP) og proton lekkasje. Begrensningene til denne metoden er at leveren vev må være så frisk som mulig og alle biopsier og analyser må utføres i mindre enn 10 h. Dette begrenser antall eksempler som kan samles inn og behandles av en enkelt person i dag å ca 5. Imidlertid er bare 1 g av leveren vev nødvendig, så store dyr, for eksempel melkeku, mengden sample nødvendig er liten i forhold til leveren størrelse og det er lite utvinning tid nødvendig.

Positive resultater viser RCR og proton lekkasje kinetics er vist i tabell 1 og Figur 15, henholdsvis. I denne studien7, RCR og protein lekkasjen kinetics ble målt i Holstein mjølkekyr på 70 dager i melk etter kyr hadde blitt matet 1 av 5 ulike nivåer av Cu, Zn og Mn i 28 dager. Staten 4, maksimal proton lekkasje-avhengige åndedrett, hadde en tendens til å bli påvirket av mineral inntak av Cu, Mn og Zn (p </...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle at JoVE.com

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Her deler vi metoder for måling mitokondrie oksygenforbruk, en definere begrepet kosttilskudd energi, og proton lekkasje, den primære årsaken til ineffektivitet i mitokondrie generasjon av ATP. Disse resultatene kan utgjør 30% av energien går tapt i næringsstoffer utnyttelse til å vurdere mitokondrie funksjon.

Måle leveren mitokondrie oksygenforbruk og Proton lekkasje Kinetics å anslå mitokondrie åndedrett i Holstein melkeku

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen energiske felt, for eksempel mitokondriehelse, energisk effektivitet og energiforbruk. Den største fordelen med denne teknikken er at oksygenforbruket av isolerte mitokondrier måles direkte. Resultatene trenger ikke å korrigeres for andre intracellulære metabolske prosesser.Vi bestemte oss først for å forfølge denne metoden i melkekyr når vi ønsket å undersøke hvordan mitokondrieeffektivitet påvirker fôreffektiviteten. Videodemonstrasjon av denne metoden er kritisk, da trinnene i mitokondrieisolasjon er vanskelige å lære fordi de må være konsekvente og presise. Så snart som mulig etter at leverprøven er fjernet fra kua vaske prøven i mitokondrier isolasjonsmedier for å fjerne de røde blodlegemene.Ved hjelp av saks fin hakke vevet i et kjølt beger som inneholder nok isolasjonsmedier for å holde vevet fuktig. Overfør hakket lever til et 30-milliliter hetteglass med mitokondrier isolasjonsmedier. Legg til en Teflon pestle som har en klaring på 0,16 millimeter og som har blitt inkubert i is og homogenisere leverprøven ved 500 RPM i ett minutt med fire slag per minutt.Etter dette overfører du homogenatet til et rør som inneholder mitokondrier isolasjonsmedier og plasserer dette i et ispakket beger. Sentrifuge homogenat ved 500 ganger G og fire grader Celsius i 10 minutter. Kast pelleten og overfør supernatanten til et kjølt sentrifugerør.Sentrifuger den resulterende supernatanten ved 10, 000 ganger G og fire grader Celsius i 10 minutter for å få mitokondriepellet. Resuspend og vask pellet i 10 milliliter mitokondrier isolasjonsmedier med fettsyrefri BSA. Deretter sentrifuge på 8, 100 ganger G og fire grader Celsius i 10 minutter.Kast den overnaturlige og resuspend pellet i 200 mikroliter isolasjonsmedier. Legg dette på is til den er klar til bruk til oksygenforbruk og protonlekkasje kinetiske analyser. Bestem proteinkonsentrasjonen av pelletsuspensjonen ved hjelp av et bicinkoninsyresett per produsentens instruksjoner ved hjelp av BSA som standard.Først oppretter du oksygenforbruksmedier som beskrevet i tekstprotokollen. Inkuber oksygenforbruket ved 30 grader Celsius. Deretter setter du opp respirasjonskammeret, pumpen og oksygenelektroden for oksygrafsystemet i henhold til produsentens instruksjoner.Plasser deretter en milliliter oksygenforbruksmedie i respirasjonskammeret. Tilsett deretter 0,35 milligram mitokondrieprotein til kammeret. Rør kraftig for å sikre at løsningen blir mettet med luft og opprettholde en temperatur på 30 grader Celsius.Registrer oksygenforbruket i ca. fem minutter. Når oksygenforbruket blir konstant representert av en avtagende rett linje, registrerer du dette som oksygenforbruket ved baseline. Tilsett 1,25 mikroliter av en fire millimolar rotenonløsning for å hemme kompleks en, og legg deretter til fem mikroliter av en molar succinateløsning for å nå en endelig konsentrasjon på fem millimolar succinate i luftveiene.Dette er tilstand IV oksygenforbruk. Etter dette legger du til en mikroliter av en 100 ml ADP-løsning for å nå en endelig konsentrasjon på 100 mikromos i respirasjonskammeret. Oksygenforbruket vil avta i omtrent fem minutter og vil deretter bli en rett linje.Registrer dette oksygenforbruket som staten III åndedrett. Beregn forholdet mellom åndedrettskontroll som beskrevet i tekstprotokollen. Deretter aspirerer du alle løsningene ut av respirasjonskammeret.Skyll kammeret flere ganger med dobbelt deionisert vann. Først forberede en løsning på 80 nanograms per milliliter nigericin i etanol begrense mengden etanol lagt til mindre enn én mikroliter. Lag også en løsning på åtte mikrogram per milliliter oligomycin i etanol.Etter grundig skylling av kammeret med dobbelt deionisert vann, legg en milliliter oksygenforbruksmediet inn i respirasjonskammeret og rør kraftig med en magnetisk rørestang. Tilsett 0,35 milligram mitokondrieprotein til respirasjonskammeret. Tilsett en metylturhenyfosfoniumfølsom elektrode i kammeroppsettet, og pass på at den andre enden er riktig koblet til en pH-måler.Tilsett 1,25 mikroliter av en fire millimolar rotenonløsning for å hemme Complex I.Record respirasjonen i to til fem minutter. Registrer oksygenforbruksverdien når den blir konstant. Deretter legger du til 0,56 mikroliter av en oligomycinløsning for å hemme ADP-utnyttelsen.Registrer åndedrett i omtrent to til fem minutter. Registrer oksygenforbruksverdien når den blir konstant. Tilsett deretter 0,112 mikroliter av en 80 nanogram per milliliter nigericin-løsning for å avskaffe pH-gradienten over mitokondrie indre membran.Registrer åndedrett i to til fem minutter og noter oksygenforbruksverdien når den blir konstant. Tilsett fem mikroliter på 10 millimolar metylturhenyfosfoniumoppløsning til mitokondrieinkubasjonen for å begynne å forberede en standardkurve. Gjenta dette tillegget fire ekstra ganger til en total konsentrasjon på 2,5.mikromos er lagt til. Etter dette legger du til fem mikroliter av en molar succinate løsning til kammeret for å initiere åndedrett. Registrer åndedrett til et stabilt spor er oppnådd.Deretter legger du til feilretting for å titrere systemet som beskrevet i tekstprotokollen. I denne studien måles RCR og protonlekkasjekinetikk i melken til Holstein melkekyr 70 dager etter at melkekyrne hadde blitt matet med ulike nivåer av kobber, sink og mangan i 28 dager. State IV åndedrett er sett på som den høyeste i kyr gitt lave nivåer av mangan, men er lavest i kontroll kyr, noe som indikerer at mangan spiller en viktig rolle i å minimere proton lekkasjeavhengig åndedrett.Analyse av den leverprotonlekkasjeavhengige åndedrettsspirasjonen viser at denne åndedretten er størst hos kyr behandlet med lav mangan, og den laveste kontrollkyr. Disse resultatene bekrefter at den lave mangangruppen har størst statlig IV-åndedrett, mens kontrollgruppen har lavest. Mens fôreffektivitet er høyere i Angus styrer født av lave RFI okser enn høye RFI okser, Dette ble ikke reflektert i mitokondrie RCR eller proton lekkasje kinetikk.Mens du utfører denne prosedyren er det viktig å holde alle hetteglass og beger på is mens du behandler mitokondriene. Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen meieriernæring for å utforske rollen som mitokondrier effektivitet i fôreffektivitet og mitokondriefunksjon i leveren. Ikke glem at det å arbeide med rotenone kan være farlig, og forholdsregler som bruk av hansker, øyevern og riktig PPE bør alltid tas mens du utfører denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyser av mitokondrie kalsium tilstrømning av isolerte mitokondrier og kultivert celler

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Måling av mitokondrie oksygenforbruk i Permeabilized fiber av Drosophila med minimale mengder vev

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Måling og tolke oksygen forbruk priser helt Fly hodet segmenter

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

Måling av mitokondrieelektronoverføringskomplekser i tidligere frossent hjertevev fra avkom av så: En modell for å vurdere treningsinduserte mitokondriebioenergiendringer

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

High-throughput bildebasert kvantifisering av mitokondriell DNA-syntese og distribusjon

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

Oksygenuavhengige analyser for å måle mitokondriefunksjon hos pattedyr

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

En forbedret metode for å isolere mitokondrielle kontaktsteder

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Analyzing Mitochondrial Physiology and Bioenergetics in Fruit Flies

Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry

Exploring Mitochondrial Function and Chemical Toxicity Using Drosophila melanogaster (Video) | JoVE

Analysere mitokondriell funksjon i en Drosophila melanogaster PINK1B9-null mutant ved bruk av høyoppløselig respirometri

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy ...