Name: measuring liver mitochondrial oxygen consumption and proton leak kinetics to estimate mitochondrial respiration in holstein dairy cattle
Uploaded: 2018-11-30T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada pela Alltech e USDA Hatch fundos através do centro de Sanidade Animal de comida na UC Davis School de medicina veterinária.

Todos os métodos, protocolo e estudos aqui descritos foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade da Califórnia, Davis.
1. a obtenção de uma biópsia do fígado de uma vaca leiteira de Holstein
Nota: Uma biópsia do fígado deve ser realizada por um veterinário licenciado. Biópsias do fígado podem ser executadas no site onde se situam as vacas leiteiro. Vacas leiteiras em lactação podem continuar a s...

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	<li>Brand, M. D., Divakaruni, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology. 26, 192-205 (2011).</li><li>Stephenson, E. J., Hawley, J. 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K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bioenergetic+health+index:+a+new+concept+in+mitochondrial+translational+research.">The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research.</a> Clinical Science. 127, 367-373 (2014).</li></ol>

O ponto mais crítico no protocolo é obter uma amostra representativa de tecido hepático e começando o isolamento da mitocôndria, logo que possível após a biópsia. Variação nas medições de respiração é baixa (tabela 1) devido a um tempo de transporte curto de vaca para laboratório. Para reduzir o tempo de transporte, foi instituído um pequeno laboratório no escritório da leiteria, e amostras de fígado foram levadas para o laboratório de escritório como cada uma foi coletada para que ...

As mitocôndrias são muito sensíveis ao estresse e seu ambiente celular pode contribuir para uma ampla variedade de doenças metabólicas. Consumo de oxigênio e vazamento de prótons na mitocôndria são indicadores de saúde de mitocôndrias. Os métodos descritos neste papel estimativa mitocondrial eficiência de energia usando RCR baseiam no consumo de oxigênio, com e sem vazamento de próton. Estes resultados podem representam 30% da energia perdida na utilização de nutrientes1. Mudanças no consumo e próton vazamento de oxigênio podem identificar a disfunção mitocondrial, o que contribui para doenças metabólicas e resulta em eficiência energética diminuída. Esses métodos também podem ser usados para examinar o efeito de diferentes tratamentos na respiração mitocondrial. O objectivo geral de medição de consumo de oxigênio mitocondrial e cinética de vazamento de próton é para avaliar a função mitocondrial e eficiência energética.
Disfunção mitocondrial hepática tem sido associada com várias doenças no gado leiteiro. A capacidade do metabolismo celular para alternar entre combustíveis carboidrato e lipídios quando confrontados com um déficit de energia no início da lactação é influenciada pelo número e função da mitocôndria na célula2. Defeitos na capacidade das mitocôndrias de adaptar-se a um aumento da demanda de energia e aumento da β-oxidação podem levar ao acúmulo de lipídios intracelulares associados com resistência à insulina e podem levar à formação de esteatose hepática em vacas leiteiras de início da lactação. Mitocôndrias, como local de produção do corpo de cetona e uso, podem desempenhar um papel chave em cetose em vacas leiteiras3. Falta de mitocôndrias ou disfunção mitocondrial afetará a disponibilidade de combustível para a periferia e reflectir-se em mudanças no consumo de oxigênio ou RCR.
Alterações de consumo de oxigênio mitocondrial em resposta à inflamação. Sete dias de idade frangos foram aleatoriamente a um grupo de infectados com maxima de Eimeria e um grupo de controle4. Frangos de corte que não sofreu desafio de coccidiose tinham menor consumo de oxigênio devido ao vazamento de próton e RCR superior indicando que mitocôndrias hepáticas respondem a um desafio imune por crescente fuga de próton. Durante a fuga de próton e reativa produção de espécies de oxigênio foi considerada um sinal de disfunção da membrana mitocondrial e prejudicial para a eficiência energética, agora sabe-se que é importante para a importação de proteínas e cálcio em mitocôndrias5 e para a geração de calor1.
Vazamento de elétrons da cadeia respiratória faz mitocôndrias suscetíveis à produção de espécies reativas de oxigênio e danos oxidativos às proteínas da membrana mitocondrial, lipídios e DNA mitocondrial. Como idade de mitocôndrias, dano pode acumular-se especialmente ao DNA mitocondrial, causando mais de disfunção no metabolismo mitocondrial6 e maior suscetibilidade da vaca a doença. Na prática, muitos animais de pecuária são alimentados com altos níveis de suplementos tais como Cu, Zn e Mn para impulsionar a função antioxidante. No entanto, alimentando a altos níveis de Cu, Zn e Mn diminuição da produção de leite e aumentaram do consumo de oxigênio devido a próton vazamento (respiração estado 4)7.
Pesquisas anteriores sobre o papel da função mitocondrial em eficiência energética em gado centrou-se sobre as mudanças no consumo de oxigênio mitocondrial e vazamento de próton. Poucos estudos foram publicados no gado leiteiro e a maioria dos jornais comparam a eficiência de produção sob a forma de consumo de ração residual (RFI) para a função mitocondrial em bovinos de corte. Variabilidade na respiração mitocondrial taxas foram examinadas através da medição o estado 3, estado 4 e RCR em fígados de carne de vaca em lactação e vacas em lactação de Holstein vacas (Angus, Brangus e Hereford)8. Os pesquisadores não encontrou qualquer correlação na respiração mitocondrial com crescimento ou ordenha traços dos bovinos, mas fizeram relatório uma correlação entre a respiração mitocondrial e traços para Holsteins de ordenha. Em dois estudos, RFI foi comparado em bovinos de corte para taxas de respiração mitocondrial (estado 3, estado 4 e RCR) no músculo mitocôndrias9,10. Taxas de respiração mitocondrial alterada em resposta a DMI e taxas baixas foram associadas com novilhos de carne menos eficientes. Em outro estudo, RFI de novilhos de touros de alta ou baixos RFI foram comparados com as taxas de respiração mitocondrial e cinética de vazamento de protões entre os dois grupos de descendência11. As diferenças foram devido ao ganho confirmando a conclusão de que a ganhar faz não respiração mitocondrial impacto em bovinos de corte.
Neste trabalho, um experimento para examinar o fígado RCR em resposta à alimentação 3 minerais antioxidante para gado de leite em lactação ilustra o uso de métodos para medir consumo de oxigênio durante 4 do estado e estado 3 respiração e PMF.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Liver Biopsy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument</td>
			<td>Sontec Instruments Englewood CO</td>
			<td>1103-904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-037-516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture needles</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Included with Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S2896 / S2646</td>
			<td># for handle and blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery towels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-129-6667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>Z168750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-314387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needles (22, 2 1/2)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MJ8881-200342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cow halter</td>
			<td>Tractor Supply Co.</td>
			<td>101966599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabbing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gauze squares (4x4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-246069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical scissors</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>Z265969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clostridia Vaccine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone Scrub</td>
			<td>Aspen Veteterinary Resources</td>
			<td>21260221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>793213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% lidocaine HCl (10-15 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation of Mitochondria (liver)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-911-527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Motor</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04369-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04468-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto Pipette (10 mL)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL) with ice</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB100600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microfuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-002-441EW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab102536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>EDS-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (fatty acid free)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A7030-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M4125-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>38796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,&#160; pH 7.4 at 4 &#176;C, will last 2 days in refrigerator</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial Oxygen Comsuption</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode</td>
			<td>Hansatech (PP Systems)</td>
			<td>OXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoregulated Water Pump</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLE2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark type Oxygen electrode</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autopipette (1 mL)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-70</td>
			<td>Included with Oxy1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small magnetic stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (10 &#956;L)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P9333-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P5655-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M1028-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>E3889-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,&#160; pH 7.4 at 30 &#176;C with 0.3% defatted BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone (4 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>R8875-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate (1 M solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S3674-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP (100 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A5285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin (solution of 8 &#956;g/mL in ethanol)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP electrode</td>
			<td>World Precision Instruments.</td>
			<td>DRIREF-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malonate (0.1 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin (8 &#956;g/mL in ethanol), keep in freezer</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,&#160; pH 7.4 at 30 &#176;C with 0.3% defatted BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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measuring liver mitochondrial oxygen consumption and proton leak kinetics to estimate mitochondrial respiration in holstein dairy cattle

Consumo de oxigênio, prótons força (PMF) e vazamento de próton são medidas da respiração mitocondrial, ou quão bem as mitocôndrias são capazes de converter o NADH e DANIII em ATP. Desde que as mitocôndrias são também o local principal para o uso de oxigênio e nutriente oxidação de dióxido de carbono e água, quanto à eficácia, eles usam o oxigênio e produzem ATP diretamente se relaciona com a eficiência do metabolismo de nutrientes, as necessidades de nutrientes do animal, e saúde do animal. A finalidade desse método é examinar a respiração mitocondrial, que pode ser usada para examinar os efeitos das diferentes drogas, dietas e os efeitos ambientais sobre o metabolismo mitocondrial. Os resultados incluem o consumo de oxigênio, medido como respiração dependente de próton (estado 3) e respiração dependente do vazamento próton (estado 4). A relação da respiração estado 4 3 / estado é definida como índice de controlo respiratório (ICR) e pode representar a eficiência energética mitocondrial. Vazamento de próton mitocondrial é um processo que permite a dissipação do potencial de membrana mitocondrial (MMP) desacoplamento fosforilação oxidativa do ADP, diminuindo a eficiência da síntese de ATP. Oxigênio e TRMP + eletrodos sensíveis com substratos mitocondriais e inibidores da cadeia de transporte de elétrons são usados para medir o estado 3 e 4 do estado respiração, membrana mitocondrial PMF (ou o potencial para produzir ATP) e vazamento de próton. Limitações para este método são que o tecido do fígado deve ser tão fresco quanto possível e todas as biópsias e ensaios devem ser realizados em menos de 10 h. Isso limita o número de amostras que podem ser recolhidos e tratados por uma única pessoa de um dia para aproximadamente 5. No entanto, é necessário apenas 1 g de tecido hepático, então em grandes animais, como gado leiteiro, a quantidade de amostra necessária é pequena em relação ao tamanho do fígado e há pouco tempo de recuperação necessário.

Resultados positivos, mostrando a cinética de vazamento RCR e prótons são mostrados na tabela 1 e Figura 15, respectivamente. No presente estudo7, RCR e proteína vazamento cinética foram medidos em vacas leiteiras Holstein em 70 dias no leite depois que as vacas tinham sido alimentadas 1 dos 5 níveis diferentes de Cu, Zn e Mn por 28 dias. Estado 4, respiração de vazamento-dependente de próton máximo, tinha um...

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Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Aqui, nós compartilhamos métodos de medição do consumo de oxigênio mitocondrial, um definição conceito de nutricional energética e vazamento de prótons, a principal causa de ineficiência na geração mitocondrial de ATP. Estes resultados podem representam 30% da energia perdida na utilização de nutrientes para ajudar a avaliar a função mitocondrial.

Medição de consumo de oxigênio mitocondrial hepática e cinética de vazamento de protões para estimar a respiração mitocondrial no gado leiteiro de Holstein

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo energético, como saúde mitocondrial, eficiência energética e uso de energia. A principal vantagem dessa técnica é que o consumo de oxigênio de mitocôndrias isoladas é medido diretamente. Os resultados não precisam ser corrigidos para outros processos metabólicos intracelulares.Decidimos primeiro buscar esse método no gado leiteiro quando queríamos examinar como a eficiência mitocondrial impacta a eficiência alimentar. A demonstração em vídeo deste método é fundamental, pois os passos do isolamento mitocondrial são difíceis de aprender porque precisam ser consistentes e precisos. O mais rápido possível depois que a amostra hepática é removida da vaca lave a amostra na mídia de isolamento das mitocôndrias para remover os glóbulos vermelhos.Usando uma tesoura finamente pica o tecido em um béquer resfriado que contém mídia de isolamento suficiente para manter o tecido úmido. Transfira o fígado picado para um frasco de vidro de 30 mililitros contendo mídia de isolamento de mitocôndrias. Adicione um pilão de Teflon que tenha uma folga de 0,16 milímetros e que tenha sido incubado em gelo e homogeneize a amostra hepática a 500 RPM por um minuto com quatro golpes por minuto.Depois disso, transfira o homogeneado para um tubo contendo mídia de isolamento mitocôndria e coloque-o em um béquer embalado no gelo. Centrífuga homogeneiza a 500 vezes G e 4 graus Celsius por 10 minutos. Descarte a pelota e transfira o supernatante para um tubo de centrífuga refrigerado.Centrifugar o supernante resultante a 10.000 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos para obter a pelota mitocondrial. Resuspend e lave a pelota em 10 mililitros de mídia de isolamento de mitocôndrias com BSA livre de ácidos graxos. Em seguida, centrífuga a 8,100 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos.Descarte o supernatante e resuspenja a pelota em 200 microliters de mídia de isolamento. Coloque isso no gelo até estar pronto para usar para o consumo de oxigênio e ensaios cinéticos de vazamento de prótons. Determine a concentração proteica da suspensão da pelota usando um kit de ácido bicinchonínico por instruções do fabricante usando BSA como padrão.Primeiro, crie mídia de consumo de oxigênio conforme descrito no protocolo de texto. Incubar a mídia de consumo de oxigênio a 30 graus Celsius. Em seguida, configure a câmara de respiração, bomba e eletrodo de oxigênio para o sistema de oxígrafo de acordo com as instruções do fabricante.Em seguida, coloque um mililitro de mídia de consumo de oxigênio na câmara de respiração. Em seguida, adicione 0,35 miligramas de proteína mitocondrial à câmara. Mexa vigorosamente para garantir que a solução fique saturada de ar e mantenha uma temperatura de 30 graus Celsius.Regisso o consumo de oxigênio por aproximadamente cinco minutos. Quando o consumo de oxigênio se torna constante representado por uma linha reta decrescente, regise isso como o consumo de oxigênio na linha de base. Adicione 1,25 microlitres de uma solução rotenona de quatro milimilas para inibir um complexo e, em seguida, adicione cinco microliters de uma solução de succinita molar para alcançar uma concentração final de cinco milimilas de succinato na câmara respiratória.Isto é consumo de oxigênio iv estadual. Depois disso, adicione um microliter de uma solução ADP de 100 milimões para atingir uma concentração final de 100 micromolares na câmara de respiração. O consumo de oxigênio diminuirá por aproximadamente cinco minutos e, em seguida, se tornará uma linha reta.Regisso consumo de oxigênio como o estado III respiração. Calcule a razão de controle respiratório conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, aspire todas as soluções para fora da câmara de respiração.Enxágüe a câmara várias vezes com água deionizada dupla. Primeiro, prepare uma solução de 80 nanogramas por mililitro de nigericin no etanol limitando a quantidade de etanol adicionada a menos de um microliter. Além disso, prepare uma solução de oito microgramas por oligomicina mililitro no etanol.Depois de enxaguar completamente a câmara com água deionizada dupla, coloque um mililitro da mídia de consumo de oxigênio na câmara de respiração e mexa vigorosamente com uma barra de agitação magnética. Adicione 0,35 miligramas de proteína mitocondrial à câmara de respiração. Adicione um eletrodo sensível ao triphenylphosphonium à configuração da câmara certificando-se de que a outra extremidade esteja adequadamente conectada a um medidor de pH.Adicione 1,25 microliters de uma solução rotenona de quatro milimonas para inibir o Complexo I.Grave a respiração por dois a cinco minutos. Regissue o valor de consumo de oxigênio quando se tornar constante. Em seguida, adicione 0,56 microliters de uma solução de oligomicina para inibir a utilização de ADP.Regisso o tempo por cerca de dois a cinco minutos. Regissue o valor de consumo de oxigênio quando se tornar constante. Em seguida, adicione 0,112 microliters de uma solução de 80 nanogramas por mililitro nigericin para abolir o gradiente de pH através da membrana interna mitocondrial.Regissão a respiração por dois a cinco minutos e observe o valor de consumo de oxigênio quando ele se torna constante. Adicione cinco microliters de 10 milimolars de solução de triphenylphosphonium de metila à incubação mitocondrial para começar a preparar uma curva padrão. Repita esta adição quatro vezes adicionais até uma concentração total de 2,5.micromolar foi adicionado. Depois disso, adicione cinco microliters de uma solução de succinita molar à câmara para iniciar a respiração. Regisso a respiração até que um traço estável seja alcançado.Em seguida, adicione malonato para titular o sistema conforme descrito no protocolo de texto. Neste estudo, a cinética de vazamento de RCR e prótons é medida no leite de vacas leiteiras holstein 70 dias após as vacas leiteiras terem sido alimentadas com diferentes níveis de cobre, zinco e manganês por 28 dias. A respiração do Estado IV é vista como a mais alta em vacas, dado baixos níveis de manganês, mas é mais baixa nas vacas de controle, indicando que o manganês desempenha um papel importante na minimização da respiração dependente de vazamento de prótons.A análise da respiração hepática dependente de vazamento de prótons revela que essa respiração é maior em vacas tratadas com baixo manganês, e a mais baixa em vacas de controle. Esses resultados confirmam que o grupo de baixo manganês tem a maior respiração iv estadual, enquanto o grupo controle tem o menor. Embora a eficiência alimentar seja maior em bois Angus nascidos de touros de RFI baixos do que touros RFI altos, isso não se refletiu no RCR mitocondrial ou na cinética de vazamento de prótons.Ao realizar este procedimento é importante manter todos os frascos e béquers no gelo enquanto processam as mitocôndrias. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de nutrição leiteira explorarem o papel da eficiência das mitocôndrias na eficiência alimentar e na função mitocondrial no fígado. Não se esqueça que trabalhar com rotenone pode ser perigoso, e precauções como usar luvas, proteção ocular e EPI adequado devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Bioquímica

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Análises de influxo de cálcio mitocondrial em mitocôndrias isoladas e células cultivadas

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Medição do consumo de oxigênio mitocondrial nas fibras Permeabilized da drosófila usando quantidades mínimas de tecido

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Medindo e interpretando a taxas de consumo de oxigênio em toda a cabeça segmentos de voar

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

Medindo complexos de transferência de elétrons mitocondrial em tecido cardíaco previamente congelado da prole da porca: um modelo para avaliar alterações bioenergetics mitocondrial induzidas pelo exercício

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Quantificação baseada em imagens de alto rendimento da síntese e distribuição do DNA mitocondrial

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

Ensaios Independentes de Oxigênio para Medir a Função Mitocondrial em Mamíferos

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

Um método aprimorado para isolar locais de contato mitocondrial

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Analyzing Mitochondrial Physiology and Bioenergetics in Fruit Flies

Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry

Exploring Mitochondrial Function and Chemical Toxicity Using Drosophila melanogaster (Video) | JoVE

Analisando a função mitocondrial em um mutanteB9-nulo de Drosophila melanogaster PINK1 usando respirometria de alta resolução

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy ...