Name: measuring liver mitochondrial oxygen consumption and proton leak kinetics to estimate mitochondrial respiration in holstein dairy cattle
Uploaded: 2018-11-30T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle at JoVE.com

Esta investigación fue apoyada por Alltech y la USDA Portilla fondos a través del centro para alimento Animal Health en UC Davis escuela de medicina veterinaria.

Todos los métodos, protocolo y estudios descritos aquí fueron aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de California, Davis.
1. obtención de una biopsia del hígado de una vaca lechera Holstein
Nota: Debe realizarse una biopsia del hígado por un veterinario con licencia. Las biopsias del hígado se pueden realizar en el sitio de lácteo donde se encuentran las vacas. Las vacas lecheras lactantes pueden continuar norm...

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	<li>Brand, M. D., Divakaruni, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology. 26, 192-205 (2011).</li><li>Stephenson, E. J., Hawley, J. 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K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bioenergetic+health+index:+a+new+concept+in+mitochondrial+translational+research.">The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research.</a> Clinical Science. 127, 367-373 (2014).</li></ol>

El punto más crítico en el protocolo es obtener una muestra representativa de tejido hepático y empezando el aislamiento de las mitocondrias tan pronto como sea posible después de la biopsia. Variación en las mediciones de la respiración es baja (tabla 1) debido a un tiempo de transporte corto de la vaca a laboratorio. Para reducir el tiempo de transporte, se estableció un pequeño laboratorio en la oficina de la lechería, y las muestras de hígado fueron conducidas al laboratorio de la oficina c...

Las mitocondrias son muy sensibles al estrés y su entorno celular puede contribuir a una amplia variedad de enfermedades metabólicas. Consumo de oxígeno y escape de protones en la mitocondria son indicadores de la salud de las mitocondrias. Los métodos descritos en este documento estimación mitocondrial eficiencia usando RCR basan en el consumo de oxígeno con y sin fuga de protones. Estos resultados pueden representan 30% de la energía perdida en la utilización de nutrientes1. Cambios en la fuga de oxígeno consumo y protón pueden identificar la disfunción mitocondrial que contribuye a la enfermedad metabólica y resultados en eficiencia energética disminuida. Estos métodos pueden utilizarse también para examinar el efecto de diferentes tratamientos sobre la respiración mitocondrial. El objetivo de medir consumo de oxígeno mitocondrial y la cinética de pérdida de protón es evaluar la función mitocondrial y la eficiencia energética.
Disfunción mitocondrial hepática se ha asociado con varias enfermedades en el ganado lechero. La capacidad de metabolismo celular para cambiar entre los combustibles hidratos de carbono y lípidos frente a un déficit de energía en la lactancia temprana está influenciada por el número y función de mitocondrias en la célula2. Defectos en la capacidad de adaptarse a una mayor demanda de energía y aumento de la β-oxidación de las mitocondrias pueden conducir a la acumulación de lípidos intracelulares asociados con resistencia a la insulina y pueden conducir a la formación de hígado graso en vacas primera lactancia. Las mitocondrias, como el sitio de producción del cuerpo de la cetona y el uso, pueden jugar un papel clave en cetosis en vacas lecheras3. La falta de mitocondrias o disfunción mitocondrial afectará la disponibilidad de combustible a la periferia y se refleja en cambios en el consumo de oxígeno o RCR.
Cambios de consumo de oxígeno mitocondrial en respuesta a la inflamación. Pollos de siete días de edad fueron asignados aleatoriamente a un grupo de infectados con Eimeria maxima y un grupo de control4. Pollos que no se someten a desafío de coccidiosis tenían menor consumo de oxígeno debido a la pérdida de protón y RCR superior indicando que las mitocondrias hepáticas responden a un reto inmunológico por creciente fuga de protones. Escape de protones y reactiva producción de especies de oxígeno una vez era considerado un signo de disfunción de la membrana mitocondrial y perjudicial para la eficiencia energética, ahora se sabe que es importante para la importación de proteínas y calcio en la mitocondria5 y para la generación de calor1.
Escape de electrones de la cadena respiratoria hace mitocondrias susceptibles a la producción de especies reactivas del oxígeno y el daño oxidativo a las proteínas de la membrana mitocondrial, lípidos y ADN mitocondrial. Medida que envejecen las mitocondrias, se puede acumular daño especialmente a mtDNA causando más disfunción en el metabolismo mitocondrial6 y una mayor susceptibilidad de la vaca a la enfermedad. En la práctica, muchos animales de ganado son alimentados con altos niveles de suplementos tales como Cu, Zn y Mn para impulsar la función antioxidante. Sin embargo, alimentando altos niveles de Cu, Zn y Mn disminuyeron la producción de leche y mayor consumo de oxígeno debido a la fuga (estado 4 respiración) de protones7.
Investigación previa sobre el papel de la función mitocondrial en la eficiencia energética en el ganado bovino se ha centrado en cambios en el consumo de oxígeno mitocondrial y la fuga de protones. Muy pocos estudios han sido publicados en ganado lechero y mayoría de los papeles compara la eficacia de la producción en la forma de consumo de alimento residual (RFI) para la función mitocondrial en ganado de carne. Variabilidad en la respiración mitocondrial, las tasas fueron examinadas mediante la medición de estado 3 Estado 4 y RCR en hígados de vacas Holstein y de carne lactantes vacas (Angus, Brangus y Hereford)8. Los investigadores no encontraron ninguna correlación en la respiración mitocondrial con crecimiento o rasgos para ganado de ordeño pero presentaron una correlación entre la respiración mitocondrial y ordeño rasgos para vacas Holstein. En dos estudios, RFI se comparó en bovinos para carne (estado 3 Estado 4 y RCR) de las tasas de respiración mitocondrial en músculo mitocondrias9,10. Cambiaron las tasas de respiración mitocondrial en respuesta a DMI y tarifas fueron asociados con novillos de carne de res menos eficientes. En otro estudio, RFI de novillos de toros altas o bajas RFI se compararon con las tasas de respiración mitocondrial y cinética de pérdida de protones entre los dos grupos de progenie11. Las diferencias fueron por aumento confirmando la conclusión de que ganar hace respiración mitocondrial de no impacto en bovinos para carne.
En este papel, un experimento examinar hígado RCR en respuesta a la alimentación de vacas lecheras lactantes 3 minerales antioxidantes ilustra el uso de métodos para medir el consumo de oxígeno durante 4 y estado 3 la respiración y la fuerza motriz protónica.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Liver Biopsy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument</td>
			<td>Sontec Instruments Englewood CO</td>
			<td>1103-904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-037-516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture needles</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Included with Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S2896 / S2646</td>
			<td># for handle and blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery towels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-129-6667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>Z168750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-314387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needles (22, 2 1/2)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MJ8881-200342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cow halter</td>
			<td>Tractor Supply Co.</td>
			<td>101966599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabbing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gauze squares (4x4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-246069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical scissors</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>Z265969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clostridia Vaccine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone Scrub</td>
			<td>Aspen Veteterinary Resources</td>
			<td>21260221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>793213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% lidocaine HCl (10-15 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation of Mitochondria (liver)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-911-527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Motor</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04369-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04468-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto Pipette (10 mL)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL) with ice</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB100600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microfuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-002-441EW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab102536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>EDS-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (fatty acid free)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A7030-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M4125-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>38796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,&#160; pH 7.4 at 4 &#176;C, will last 2 days in refrigerator</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial Oxygen Comsuption</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode</td>
			<td>Hansatech (PP Systems)</td>
			<td>OXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoregulated Water Pump</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLE2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark type Oxygen electrode</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autopipette (1 mL)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-70</td>
			<td>Included with Oxy1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small magnetic stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (10 &#956;L)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P9333-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P5655-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M1028-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>E3889-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,&#160; pH 7.4 at 30 &#176;C with 0.3% defatted BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone (4 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>R8875-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate (1 M solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S3674-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP (100 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A5285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin (solution of 8 &#956;g/mL in ethanol)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP electrode</td>
			<td>World Precision Instruments.</td>
			<td>DRIREF-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malonate (0.1 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin (8 &#956;g/mL in ethanol), keep in freezer</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,&#160; pH 7.4 at 30 &#176;C with 0.3% defatted BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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measuring liver mitochondrial oxygen consumption and proton leak kinetics to estimate mitochondrial respiration in holstein dairy cattle

Consumo de oxígeno, fuerza de motivo del protón (PMF) y fuga de protones son las medidas de la respiración mitocondrial, o bien las mitocondrias son capaces de convertir los NADH y FADH en ATP. Puesto que las mitocondrias son el sitio primario para el uso de oxígeno y nutrientes oxidación a dióxido de carbono y agua, sobre la eficacia que utilizan oxígeno y producen ATP directamente se relaciona con la eficiencia del metabolismo de nutrientes, necesidades de nutrientes del animal, y salud del animal. El propósito de este método es examinar la respiración mitocondrial, que puede utilizarse para examinar los efectos de diferentes fármacos, dietas y efectos ambientales sobre el metabolismo mitocondrial. Los resultados incluyen el consumo de oxígeno medido como respiración dependiente de protones (estado 3) y respiración dependiente de fuga de protones (estado 4). La relación de la respiración del estado 3 / Estado 4 se define como el cociente del control respiratorio (RCR) y puede representar eficiencia energética mitocondrial. Escape de protones mitocondrial es un proceso que permite la disipación del potencial de membrana mitocondrial (MMP) por desacoplar la fosforilación oxidativa de ADP disminuye la eficiencia de síntesis de ATP. Oxígeno y TRMP + electrodos sensibles con sustratos mitocondriales e inhibidores de la cadena de transporte de electrones se utilizan para medir el estado 3 y estado 4 respiración, membrana mitocondrial PMF (o el potencial para producir ATP) y fuga de protones. Limitaciones a este método son que el tejido del hígado debe ser tan fresco como sea posible y todas las biopsias y los análisis deben realizarse en menos de 10 h. Esto limita el número de muestras que pueden ser recogidos y procesados por una sola persona en un día a unos 5. Sin embargo, es necesario sólo 1 g de tejido hepático, por lo que en grandes animales, como vacas lecheras, la cantidad de muestra necesaria es pequeña en relación con el tamaño del hígado y hay poco tiempo de recuperación necesario.

Resultados positivos que muestran cinética de escape RCR y protón se muestran en la tabla 1 y la figura 15, respectivamente. En este estudio7, RCR y proteína fuga cinética se midieron en vacas lecheras Holstein en 70 días en leche después de que las vacas habían sido alimentadas con 1 de 5 diferentes niveles de Cu, Zn y Mn durante 28 días. Estado 4, respiración dependiente de la fuga de protones máximo, tení...

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Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Aquí, compartimos los métodos para medir el consumo de oxígeno mitocondrial, un concepto definitorio de nutrición energética y escape de protones, la principal causa de ineficiencia en generación mitocondrial de ATP. 30% de la energía perdida en la utilización de nutrientes para ayudar a evaluar la función mitocondrial pueden explicar estos resultados.

Medir consumo de oxígeno mitocondrial hepática y la cinética de pérdida de protón para estimar la respiración mitocondrial en el ganado de lechero Holstein

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la energía, como la salud mitocondrial, la eficiencia energética y el uso de energía. La principal ventaja de esta técnica es que el consumo de oxígeno de las mitocondrias aisladas se mide directamente. No es necesario corregir los resultados para otros procesos metabólicos intracelulares.Primero decidimos seguir este método en el ganado lechero cuando queríamos examinar cómo la eficiencia mitocondrial afecta la eficiencia de los piensos. La demostración en vídeo de este método es fundamental, ya que los pasos en el aislamiento mitocondrial son difíciles de aprender porque necesitan ser consistentes y precisos. Tan pronto como sea posible después de que se extraiga la muestra de hígado de la vaca lave la muestra en medios de aislamiento de las mitocondrias para eliminar los glóbulos rojos.Usando tijeras picar finamente el tejido en un vaso de precipitados refrigerado que contiene suficientes medios de aislamiento para mantener el tejido húmedo. Transfiera el hígado picado a un vial de vidrio de 30 mililitros que contenga medios de aislamiento de mitocondrias. Añadir un pestle de teflón que tenga un aclaramiento de 0,16 milímetros y que haya sido incubado en hielo y homogeneice la muestra de hígado a 500 RPM durante un minuto con cuatro golpes por minuto.Después de esto, transfiera el homogeneato a un tubo que contenga medios de aislamiento de las mitocondrias y colóquelo en un vaso de precipitados lleno de hielo. Centrifugar homogeneizar a 500 veces G y cuatro grados celsius durante 10 minutos. Deseche el pellet y transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga refrigerada.Centrifugar el sobrenadante resultante a 10.000 veces G y cuatro grados Celsius durante 10 minutos para obtener el pellet mitocondrial. Resuspender y lavar el pellet en 10 mililitros de medios de aislamiento de mitocondrias con BSA libre de ácidos grasos. Luego centrifugar a 8, 100 veces G y cuatro grados Celsius durante 10 minutos.Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 microlitros de medios de aislamiento. Coloque esto sobre hielo hasta que esté listo para usar para el consumo de oxígeno y los ensayos cinéticos con fugas de protones. Determinar la concentración proteica de la suspensión de pellets utilizando un kit de ácido bicinchoninic según las instrucciones del fabricante utilizando BSA como estándar.En primer lugar, cree medios de consumo de oxígeno como se describe en el protocolo de texto. Incubar los medios de consumo de oxígeno a 30 grados centígrados. A continuación, configure la cámara de respiración, la bomba y el electrodo de oxígeno para el sistema de oxigrafía de acuerdo con las instrucciones del fabricante.A continuación, coloque un mililitro de medios de consumo de oxígeno en la cámara de respiración. Luego agregue 0,35 miligramos de proteína mitocondrial a la cámara. Revuelva vigorosamente para asegurarse de que la solución se satura con aire y mantenga una temperatura de 30 grados centígrados.Registre el consumo de oxígeno durante aproximadamente cinco minutos. Cuando el consumo de oxígeno se convierte en constante representado por una línea recta decreciente, registre esto como el consumo de oxígeno basal. Añadir 1,25 microlitros de una solución de rotenona de cuatro mililitrolares para inhibir la solución compleja, y luego añadir cinco microlitros de una solución de succinato molar para alcanzar una concentración final de cinco succinatos mililolares en la cámara respiratoria.Este es el consumo de oxígeno del estado IV. Después de esto, añadir un microlitro de una solución ADP de 100 mililitros para alcanzar una concentración final de 100 micromolares en la cámara de respiración. El consumo de oxígeno disminuirá durante aproximadamente cinco minutos y luego se convertirá en una línea recta.Registre este consumo de oxígeno como la respiración del estado III. Calcular la relación de control respiratorio como se describe en el protocolo de texto. A continuación, aspirar todas las soluciones fuera de la cámara de respiración.Enjuague la cámara varias veces con agua desionizada doble. En primer lugar, preparar una solución de 80 nanogramos por mililitro de nigericin en etanol limitando la cantidad de etanol añadido a menos de un microlitro. Además, preparar una solución de ocho microgramos por mililitro de oligomicina en etanol.Después de enjuagar a fondo la cámara con agua desionizada doble, coloque un mililitro de los medios de consumo de oxígeno en la cámara de respiración y revuelva vigorosamente con una barra de agitación magnética. Añadir 0,35 miligramos de proteína mitocondrial a la cámara de respiración. Agregue un electrodo sensible al triphenylphosphonium metilo a la configuración de la cámara asegurándose de que el otro extremo esté conectado correctamente a un medidor de pH.Añadir 1,25 microlitros de una solución de rotenona de cuatro mililitrolares para inhibir el Complejo I.Grabar la respiración durante dos a cinco minutos. Registre el valor de consumo de oxígeno cuando se vuelva constante. A continuación, agregue 0,56 microlitros de una solución de oligomicina para inhibir la utilización de ADP.Registre la respiración durante unos dos a cinco minutos. Registre el valor de consumo de oxígeno cuando se vuelva constante. A continuación, agregue 0,112 microlitros de una solución de 80 nanogramos por mililitro de nigericiina para abolir el gradiente de pH a través de la membrana interna mitocondrial.Registre la respiración durante dos a cinco minutos y observe el valor de consumo de oxígeno cuando se vuelve constante. Añadir cinco microlitros de 10 mililitros de solución de metil triphenylphosphonium a la incubación mitocondrial para comenzar a preparar una curva estándar. Repita esta adición cuatro veces adicionales hasta una concentración total de 2,5.micromolar ha sido añadido. Después de esto, agregue cinco microlitros de una solución de succinato molar a la cámara para iniciar la respiración. Registre la respiración hasta que se logre un rastro estable.A continuación, agregue malonato para valorar el sistema como se describe en el protocolo de texto. En este estudio, la cinética de fugas de protón y RCR se mide en la leche de vacas lecheras Holstein 70 días después de que las vacas lecheras se hubieran alimentado con diferentes niveles de cobre, zinc y manganeso durante 28 días. La respiración del Estado IV se considera la más alta en las vacas dados bajos niveles de manganeso, sin embargo, es más baja en las vacas de control, lo que indica que el manganeso juega un papel importante en la minimización de la respiración dependiente de la fuga de protones.El análisis de la respiración dependiente de la fuga de protones hepáticos revela que esta respiración es mayor en vacas tratadas con manganeso bajo, y la más baja en vacas de control. Estos resultados confirman que el grupo de manganeso bajo tiene la mayor respiración de estado IV mientras que el grupo de control tiene la más baja. Si bien la eficiencia de alimentación es mayor en los novillos Angus nacidos de toros RFI bajos que los toros RFI altos, esto no se refleció en el RCR mitocondrial o en la cinética de fugas de protones.Durante la realización de este procedimiento es importante mantener todos los viales y vasos en el hielo mientras se procesa la mitocondria. Después de su desarrollo esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la nutrición láctea exploraran el papel de la eficiencia de las mitocondrias en la eficiencia de los piensos y la función mitocondrial en el hígado. No olvide que trabajar con rotenona puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como usar guantes, protección para los ojos y EPP adecuada durante la realización de este procedimiento.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Investigación

Bioquímica

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Análisis de la afluencia del calcio mitocondrial en las mitocondrias aisladas y células cultivadas

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Medición de consumo de oxígeno mitocondrial en las fibras Permeabilized de Drosophila utilizando cantidades mínimas de tejido

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Medición e interpretación de las tasas de consumo de oxígeno en su totalidad operan segmentos de cabeza

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

Medición de complejos de transferencia de electrones mitocondriales en tejido cardíaco previamente congelado de la descendencia de cerda: un modelo para evaluar los cambios bioenergéticos mitocondriales inducidos por el ejercicio

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Cuantificación basada en imágenes de alto rendimiento de la síntesis y distribución del ADN mitocondrial

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

Ensayos independientes del oxígeno para medir la función mitocondrial en mamíferos

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

Un método mejorado para aislar los sitios de contacto mitocondrial

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Analyzing Mitochondrial Physiology and Bioenergetics in Fruit Flies

Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry

Exploring Mitochondrial Function and Chemical Toxicity Using Drosophila melanogaster (Video) | JoVE

Análisis de la función mitocondrial en un mutante PINK1B9-nulo de Drosophila melanogaster mediante respirometría de alta resolución

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy ...