Name: measuring liver mitochondrial oxygen consumption and proton leak kinetics to estimate mitochondrial respiration in holstein dairy cattle
Uploaded: 2018-11-30T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle at JoVE.com

Bu araştırma, gıda hayvan sağlığı, UC Davis Veteriner Tıp Fakültesi için merkezi aracılığıyla Alltech ve USDA kapak fon tarafından desteklenmiştir.

Tüm yöntemleri, protokolü ve burada açıklanan çalışmaları Davis kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Kaliforniya Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. alma karaciğer biyopsisi bir Holstein süt ineği
Not: Karaciğer biyopsisi lisanslı bir veteriner tarafından gerçekleştirilmelidir. Karaciğer biyopsi inekler konumlandırıldığı sitenin süt gerçekleştirilebilir. Laktasyondaki süt inekleri normalde Sağılan devam edebilir ...

<ol>
	<li>Brand, M. D., Divakaruni, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology. 26, 192-205 (2011).</li><li>Stephenson, E. J., Hawley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+in+metabolic+health:+A+genetic+and+environmental+tug+of+war.">Mitochondrial function in metabolic health: A genetic and environmental tug of war.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840, 1285-1294 (2014).</li><li>Bartlett, K., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+B+oxidation.">Mitochondrial B oxidation.</a> European Journal of Biochemistry. 271, 462-469 (2004).</li><li>Acetoze, G., Kurzbard, R., Klasing, K. C., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+Consumption,+Respiratory+Control+Ratio+(RCR)+and+Mitochondrial+Proton+Leak+of+broilers+with+and+without+growth+enhancing+levels+of+minerals+supplementation+challenged+with+Eimeria+maxima+(Ei).">Oxygen Consumption, Respiratory Control Ratio (RCR) and Mitochondrial Proton Leak of broilers with and without growth enhancing levels of minerals supplementation challenged with Eimeria maxima (Ei).</a> Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition. 101, e210-e215 (2016).</li><li>Wallace, D. C., Fan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics,+epigenetics,+mitochondrial+genetics.">Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics.</a> Mitochondrion. 10, 12-31 (2010).</li><li>Paradies, G., Petrosillo, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress,+mitochondrial+bioenergetics+and+cardiolipin+in+aging.">Oxidative stress, mitochondrial bioenergetics and cardiolipin in aging.</a> Free Radicals in Biology and Medicine. 48, 1286-1295 (2010).</li><li>Acetoze, G., Champagne, J., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+mitochondrial+oxygen+consumption+and+efficiency+of+milk+production+in+lactating+Holstein+cows+supplemented+with+Copper,+Manganese+and+Zinc.">Liver mitochondrial oxygen consumption and efficiency of milk production in lactating Holstein cows supplemented with Copper, Manganese and Zinc.</a> Journal of Animal Physiology Animal Nutrition. 102, e787-e797 (2017).</li><li>Brown, D. R., DeNise, S. K., McDaniel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+metabolism+and+performance+of+cattle.">Mitochondrial respiratory metabolism and performance of cattle.</a> Journal of Animal Science. 66, 1347-1354 (1988).</li><li>Golden, M. S., Keisler, J. W., H, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+mitochondrial+function+and+residual+feed+intake+in+Angus+steers.">The relationship between mitochondrial function and residual feed intake in Angus steers.</a> Journal of Animal Science. 84, 861-865 (2006).</li><li>Lancaster, P. A., Carstens, G. E., Michal, J. J., Brennan, K. M., Johnson, K. A., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+residual+feed+intake+and+hepatic+mitochondrial+function+in+growing+beef+cattle.">Relationships between residual feed intake and hepatic mitochondrial function in growing beef cattle.</a> Journal of Animal Science. 92, 3134-3141 (2014).</li><li>Acetoze, G., Weber, K. L., Ramsey, J. J., Rossow, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+liver+mitochondrial+respiration+and+proton+leak+kinetics+in+low+and+high+RFI+steers+from+two+lineages+of+RFI+Angus+bulls.">Relationship between liver mitochondrial respiration and proton leak kinetics in low and high RFI steers from two lineages of RFI Angus bulls.</a> ISRN Vet Sci. 2015 (194014), (2015).</li><li>Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+oxidants+in+biological+systems:+The+superoxide+theory+of+oxygen+toxicity.">Protection against oxidants in biological systems: The superoxide theory of oxygen toxicity.</a> Free Radicals in Biology and Medicine. , 186-187 (1989).</li><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nutrient Requirements of Dairy Cattle. , (2001).</li><li>Ramsey, J. J., Harper, M. E., Weindruch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+energy+intake,+energy+expenditure,+and+aging.">Restriction of energy intake, energy expenditure, and aging.</a> Free Radical Biology and Medicine. 29, 946-968 (2000).</li><li>Mehta, M. M., Weinberg, S. E., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+control+of+immunity:+beyond+ATP.">Mitochondrial control of immunity: beyond ATP.</a> Nature. 17, 608-620 (2017).</li><li>Kirby, D. M., Thorburn, D. R., Turnbull, D. M., Taylor, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+assays+of+respiratory+chain+complex+activity.">Biochemical assays of respiratory chain complex activity.</a> Methods in Cell Biology. 80, 93-119 (2007).</li><li>Alex, A. P., Collier, J. L., Hadsell, D. L., Collier, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milk+yield+differences+between+1x+and+4x+milking+are+associated+with+changes+in+mammary+mitochondrial+number+and+milk+protein+gene+expression,+but+not+mammary+cell+apoptosis+or+SOCS+gene+expression.">Milk yield differences between 1x and 4x milking are associated with changes in mammary mitochondrial number and milk protein gene expression, but not mammary cell apoptosis or SOCS gene expression.</a> Journal of Dairy Science. 98, 4439-4448 (2015).</li><li>Lossa, S., Lionetti, L., Mollica, M. P., Crescenzo, R., Botta, M., Barletta, A., Liverini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+high-fat+feeding+on+metabolic+efficiency+and+mitochondrial+oxidative+capacity+in+adult+rats.">Effect of high-fat feeding on metabolic efficiency and mitochondrial oxidative capacity in adult rats.</a> British Journal of Nutrition. 90, 953-960 (2003).</li><li>Boily, G., Seifert, E. L., Bevilacqua, L., He, X. H., Sabourin, G., Estey, C., Moffat, C., Crawford, S., Saliba, S., Jardine, K., Xuan, J., Evans, M., Harper, M. E., McBurney, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SirT1+regulates+energy+metabolism+and+response+to+caloric+restriction+in+mice.">SirT1 regulates energy metabolism and response to caloric restriction in mice.</a> PloS One. 3 (3), e1759 (2008).</li><li>Chen, Y., Hagopian, K., Bibus, D., Villaba, J. M., Lopez-Lluch, G., Navas, P., Kim, K., McDonald, R. B., Ramsey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+dietary+lipid+composition+on+liver+mitochondria+from+mice+following+1+month+of+calorie+restriction.">The influence of dietary lipid composition on liver mitochondria from mice following 1 month of calorie restriction.</a> Bioscience Reports. 33, 83-95 (2013).</li><li>Chacko, B. K., Kramer, P. A., Ravi, S., Benavides, G. A., Mitchell, T., Dranka, B. P., Ferrick, D., Singal, A. K., Ballinger, S. W., Bailey, S. M., Hardy, R. W., Zhang, J., Zhi, D., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bioenergetic+health+index:+a+new+concept+in+mitochondrial+translational+research.">The bioenergetic health index: a new concept in mitochondrial translational research.</a> Clinical Science. 127, 367-373 (2014).</li></ol>

En kritik nokta protokolündeki temsilcisi karaciğer doku örneği alma ve mitokondri yalıtım en kısa zamanda biyopsi sonra başlangıcı. Solunum ölçüleri içinde çeşididir inek laboratuvar bir kısa ulaşım zaman nedeniyle düşük (Tablo 1). Taşıma süresini azaltmak için küçük bir laboratuvar süt ofiste kurulmuştur ve mitokondri biyopsi 10 dk içinde izole böylece her toplanan gibi karaciğer örnekleri için office laboratuvar sürüldüler. Kurulum ve proton degradeler kayıt far...

Mitokondri stres çok duyarlıdır ve hücresel çevreleri çok çeşitli metabolik hastalıklar katkıda bulunabilir. Oksijen tüketimi ve mitokondri proton sızıntısı mitokondri sağlık göstergeleri vardır. Bu kağıt tahmin mitokondrial enerji verimliliğinde oksijen tüketimi ve proton sızıntısı olmayan temel RCR kullanarak açıklanan yöntemleri. Bu sonuçlar besin kullanımı1' kayıp enerjinin % 30 için hesap. Oksijen tüketimi ve proton sızıntı değişiklikleri için metabolik hastalık katkıda bulunur ve azalan enerji verimliliği sonuçları mitokondrial disfonksiyon tanımlayabilirsiniz. Bu yöntemler aynı zamanda mitokondrial solunum üzerinde farklı tedaviler etkisini incelemek için kullanılabilir. Mitokondrial oksijen tüketimi ve proton sızıntı kinetik ölçme genel mitokondriyal işlev ve enerjik etkinliğini değerlendirmek için hedeftir.
Hepatik mitokondrial disfonksiyon süt sığır çeşitli hastalıklar ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Hücresel metabolizma erken emzirme bir enerji açığı ile karşı karşıya zaman karbonhidrat ve lipid yakıtlar arasında geçiş yapma yeteneği sayısı ve mitokondri2hücre işlevi etkilenir. Mitokondri enerji ve artan β-oksidasyon için artan bir talep uyum yeteneği kusurları insülin direnci ile ilişkili hücre içi lipid birikimi yol açabilir ve erken emzirme süt ineklerin yağlı karaciğer oluşumuna yol açabilir. Mitokondri, keton vücut üretim ve kullanımı, site olarak ketozis süt inekleri3önemli bir rol oynayabilir. Mitokondri veya mitokondrial disfonksiyon eksikliği yakıt durumu çevre etkileyecek ve oksijen tüketimi veya RCR değişiklikleri yansıması.
Mitokondrial oksijen tüketimi değişiklikleri yanıt olarak inflamasyon. Yedi günlük eski yumurtlayanlar rastgele Eimeria maxima ve kontrol grubu4ile enfekte bir gruba ayrıldı. Coccidiosis meydan geçmesi değil yumurtlayanlar proton sızıntı ve daha yüksek RCR karaciğer mitokondri artan proton sızıntısı tarafından bir bağışıklık sınamasına yanıt belirten nedeniyle daha az oksijen tüketimi vardı. Proton sızıntı ve reaktif oksijen türleri üretim bir kez mitokondri zar disfonksiyon belirtisi olarak kabul edildi ve enerjik verimliliği için zararlı, şimdi bu protein ve kalsiyum içe mitokondri5 aktarmak için önemlidir Bilindiği ve ısı1nesil için.
Solunum zinciri elektron sızıntı mitokondri reaktif oksijen türleri üretim ve oksidatif hasar mitokondri zar proteinleri, lipidler ve mitokondriyal DNA getirir; Mitokondri yaşlandıkça, hasar için özellikle daha fazla mitokondriyal metabolizma6 ve daha fazla duyarlılık inek hastalığı disfonksiyon neden mtDNA birikir. Pratikte, çok hayvancılık hayvan takviyeleri Cu, Zn ve Mn antioksidan işlevi artırmak için gibi yüksek düzeyde beslenir. Ancak, Cu yüksek düzeyde besleme, Zn ve Mn süt üretimi azalmıştır ve oksijen tüketimi proton sızıntısı (devlet 4 solunum)7nedeniyle arttı.
Sığır enerji verimliliği mitokondriyal işlevde rolünü önceki araştırma mitokondrial oksijen tüketimi ve proton sızıntı değişiklikler üzerinde odaklanan. Çok az sayıda çalışmalar süt sığır yayınlanmış ve üretim verimliliği sığır mitokondriyal işlev artık yem alımı (RFI) şeklinde en kartları karşılaştırın. Mitokondrial solunum oranları emzikli Holstein inek ve emzikli sığır ciğeri state 3, devlet 4 ve RCR ölçerek incelenmiş değişkenliği (Angus, Brangus ve Hereford)8inekler. Araştırmacılar herhangi bir korelasyon büyüme veya özellikleri sığır için sağım mitokondrial solunum bulamadık ama mitokondrial solunum ve özellikleri Holsteins için sağım arasında bir ilişki rapor vermedi. İki çalışmalarda, RFI sığır mitokondrial solunum oranları (state 3, devlet 4 ve RCR) kas mitokondri9,10' karşılaştırıldı. DMI cevaben mitokondrial solunum oranları değişti ve düşük oranları daha az verimli sığır eti steers ile ilişkili bulunmuştur. Başka bir çalışmada, yüksek veya düşük RFI bulls gelen ederek RFI mitokondrial solunum oranları ve proton sızıntı kinetik Döl11iki grubu ile karşılaştırıldığında. Kazanç kazanç sonuç içinde sığır mitokondrial solunum etkisi yapar teyit nedeniyle farklılıklar vardı.
Bu kağıt, RCR 3 antioksidan mineral laktasyondaki süt sığır besleme yanıt ölçmek için yöntemleri kullanılışını karaciğer inceleyerek bir deney sırasında oksijen tüketimi 4 devlet ve devlet 3 solunum ve PMF.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Liver Biopsy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schackelford-Courtney bovine liver biopsy instrument</td>
			<td>Sontec Instruments Englewood CO</td>
			<td>1103-904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-037-516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture needles</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Included with Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S2896 / S2646</td>
			<td># for handle and blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery towels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-129-6667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>Z168750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-314387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needles (22, 2 1/2)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MJ8881-200342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cow halter</td>
			<td>Tractor Supply Co.</td>
			<td>101966599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabbing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton gauze squares (4x4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-246069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical scissors</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>Z265969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clostridia Vaccine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver biopsy antibiotics excenel 2 cc/100 lbs for 3 days</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providone Scrub</td>
			<td>Aspen Veteterinary Resources</td>
			<td>21260221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>793213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine hydrochloride 100 mg/mL IV at 0.010-0.015 mg/kg bodyweight</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% lidocaine HCl (10-15 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mg/kg IV injection of flunixin meglumine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Veterinarian</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation of Mitochondria (liver)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton vial 30 mL with a Teflon pestle of 0.16 mm clearance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-911-527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Motor</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04369-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Probe</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-04468-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto Pipette (10 mL)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker (500 mL) with ice</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB100600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated microfuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75-002-441EW3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab102536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>EDS-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (fatty acid free)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A7030-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M4125-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>38796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Use to create mitochondria isolation media: 220 mM mannitol, 70 mM sucrose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, and 0.1% (w/v) fatty acid free BSA,&#160; pH 7.4 at 4 &#176;C, will last 2 days in refrigerator</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial Oxygen Comsuption</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph Setup + Clark type oxygen electrode</td>
			<td>Hansatech (PP Systems)</td>
			<td>OXY1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoregulated Water Pump</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLE2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clark type Oxygen electrode</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autopipette (1 mL)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-70</td>
			<td>Included with Oxy1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small magnetic stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette (10 &#956;L)</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>SK-21600-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P9333-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P5655-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M1028-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>E3889-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Use to make mitochondrial oxygen consumption media: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,&#160; pH 7.4 at 30 &#176;C with 0.3% defatted BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone (4 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>R8875-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate (1 M solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S3674-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADP (100 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A5285-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin (solution of 8 &#956;g/mL in ethanol)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP electrode</td>
			<td>World Precision Instruments.</td>
			<td>DRIREF-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals-solutions do not need to be fresh but they do need to be kept in a freezer between runs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malonate (0.1 mM solution)</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin (8 &#956;g/mL in ethanol), keep in freezer</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin (80 ng/mL in ethanol), keep in freezer</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TPMP solution: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes and 1 mM EGTA,&#160; pH 7.4 at 30 &#176;C with 0.3% defatted BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring liver mitochondrial oxygen consumption and proton leak kinetics to estimate mitochondrial respiration in holstein dairy cattle

Oksijen tüketimi, proton sebep kuvvet (PMF) ve proton sızıntı mitokondriyal solunum veya ne kadar iyi mitokondri NADH ve FADH ATP dönüştürmek mümkün ölçülerini vardır. Nasıl verimli oksijen kullanımı ve doğrudan ATP üretmek mitokondri de oksijen ve karbon dioksit ve su besin oksidasyon birincil site olduğundan, besin metabolizma, verimliliği ile ilgilidir hayvanın besin gereksinimleri ve hayvan sağlık. Bu yöntemin amacı farklı ilaçlar, diyetler ve mitokondriyal metabolizma üzerindeki çevresel etkileri etkilerini incelemek için kullanılan mitokondrial solunum incelemektir. Sonuçları proton bağlı solunum (durum 3) ve proton sızıntı bağımlı solunum (devlet 4) ölçülen oksijen tüketimi içerir. Devlet 3 / devlet 4 Solunum oranı solunum denetim oranı (RCR) tanımlanır ve mitokondrial enerjik verimliliği temsil edebilir. Mitokondrial proton sızıntı ADP ATP sentezi verimliliğini azalan dan uncoupling Oksidatif fosforilasyon tarafından mitokondri zar potansiyel (MMP) dağılımı sağlar bir süreç var. Oksijen ve TRMP + Hassas elektrotlar mitokondrial yüzeylerde ve elektron taşıma zinciri inhibitörleri ile durum 3 ve devlet 4 solunum, mitokondri zar PMF (veya ATP üretmek için potansiyel) ölçmek için kullanılır ve proton sızıntısı. Bu yöntem için kısıtlamaları karaciğer dokusu gibi taze olmalı ve tüm biyopsi ve deneyleri az 10 h içinde gerçekleştirilmesi gerekir vardır. Bu toplanan ve bir günde yaklaşık 5 için tek bir kişi tarafından işlenen örneklerin sayısını sınırlar. Ancak, yalnızca 1 g karaciğer doku, bu yüzden örnek gerekli miktarda süt sığır gibi büyük hayvanlarda karaciğer boyutuna göre küçük ve küçük kurtarma zaman gerekli gereklidir.

RCR ve proton sızıntı kinetik gösteren olumlu sonuçları Tablo 1 ve Şekil 15, sırasıyla gösterilir. Bu çalışmada7, RCR ve protein sızıntısı kinetik ölçülen Holstein Süt ineklerin süt 70 gün, inekler 28 gün boyunca 1, Cu, Zn ve Mn 5 farklı seviyelerde beslenen sonra. Devlet 4, en fazla proton sızıntı bağlı solunum, Cu, Mn ve Zn (p < 0,1) mineral alımını tarafından etkilenmiş gi...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle at JoVE.com

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Burada, mitokondrial oksijen tüketimi, beslenme enerji bilimi ve proton sızıntı, verimsizlik birincil nedeni mitokondriyal ATP nesil belirleyici bir kavram ölçme yöntemleri paylaşmak. Bu sonuçlar besin kullanımı mitokondriyal işlev değerlendirmek yardımcı olmak için kayıp enerjinin % 30 için hesap.

Karaciğer mitokondrial oksijen tüketimi ve Proton sızıntı kinetik Holstein süt sığır mitokondrial solunum tahmin etmek için ölçme

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Bu yöntem, mitokondriyal sağlık, enerji verimliliği ve enerji kullanımı gibi enerji alanında anahtar soruların cevapyardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı izole mitokondri oksijen tüketimi doğrudan ölçülür olmasıdır. Diğer hücre içi metabolik süreçler için sonuçların düzeltilmesi gerekmez.Mitokondriyal verimliliğin yem verimliliğini nasıl etkilediğini incelemek istediğimizde ilk olarak süt sığırlarında bu yöntemi sürdürmeye karar verdik. Mitokondriyal izolasyondaki adımların anlaşılması zor olduğundan, tutarlı ve kesin olmaları gerektiğinden, bu yöntemin video gösterimi çok önemlidir. Karaciğer örneği kaldırıldıktan sonra en kısa sürede kırmızı kan hücrelerini kaldırmak için mitokondri izolasyon medya örnek yıkayın.Makas kullanarak ince doku nemli tutmak için yeterli izolasyon ortamı içeren bir soğutulmuş kabıiçine doku kıyma. Kıyılmış karaciğeri mitokondri izolasyon uğrama içeren 30 mililitrelik cam şişeye aktarın. 0.16 milimetre lik bir açıklığa sahip ve buzda kuluçkaya yatan bir Teflon haşere ekleyin ve dakikada dört vuruşla bir dakika boyunca 500 RPM'de karaciğer örneğini homojenize edin.Bundan sonra, mitokondri izolasyon ortamı içeren bir tüp için homojen aktarın ve bir buz dolu kabın içine yerleştirin. Santrifüj 500 kez G ve 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede homojen. Pelet atın ve soğutulmuş bir santrifüj tüp için supernatant aktarın.Mitokondriyal pelet elde etmek için 10, 000 kez G ve dört derece santigrat 10 dakika sonuçlanan supernatant santrifüj. Yağ asidiiçermeyen BSA ile 10 mililitre mitokondri izolasyon medyasında peleti yeniden askıya alın ve yıkayın. Sonra 8, 100 kez G ve 10 dakika boyunca 4 santigrat derece santrifüj.Supernatant atın ve izolasyon medya 200 mikrolitre pelet resuspend. Oksijen tüketimi ve proton sızıntı kinetik tahliller için kullanıma hazır olana kadar buz bu yerleştirin. Standart olarak BSA kullanarak üreticinin talimatları başına bir bicinchoninic asit kiti kullanarak pelet süspansiyon protein konsantrasyonu belirleyin.İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi oksijen tüketim ortamı oluşturun. Oksijen tüketim ortamını 30 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, üreticinin talimatlarına göre oksigraf sistemi için solunum odası, pompa ve oksijen elektrotunu ayarlayın.Daha sonra solunum odasına bir mililitre oksijen tüketimi ortamı yerleştirin. Sonra haznemine 0.35 miligram mitokondriyal protein ekleyin. Çözeltinin havayla doymasını sağlamak ve 30 santigrat derecelik bir sıcaklığı korumak için şiddetle karıştırın.Oksijen tüketimini yaklaşık beş dakika kaydedin. Oksijen tüketimi azalan düz bir çizgi ile sabit hale geldiğinde, bunu temel oksijen tüketimi olarak kaydedin. Karmaşık bir inhibe etmek için dört milimolar rotenon çözeltisi 1.25 mikrolitre ekleyin, ve sonra solunum odasında beş milimolar succinate son konsantrasyonulaşmak için bir azı succinate çözeltisi beş mikrolitre ekleyin.Bu durum IV oksijen tüketimidir. Bundan sonra, solunum odasında 100 mikromolar nihai konsantrasyonulaşmak için 100 milimolar ADP çözeltisi bir mikrolitre ekleyin. Oksijen tüketimi yaklaşık beş dakika azalacak ve daha sonra düz bir çizgi haline gelecektir.Bu oksijen tüketimini durum III solunumu olarak kaydedin. Metin protokolünde belirtildiği gibi solunum kontrol oranını hesaplayın. Daha sonra tüm çözeltileri solunum odasından aspire edin.Odayı birkaç kez çift deiyonize suyla durulayın. İlk olarak, bir mikrolitreden daha az eklenen etanol miktarını sınırlayan etanol de nigericin mililitre başına 80 nanogram bir çözüm hazırlamak. Ayrıca, etanol mililitre oligomisin başına sekiz mikrogram bir çözüm hazırlamak.Odayı çift deiyonize suyla iyice duruladıktan sonra, oksijen tüketim ortamının bir mililitresini solunum odasına yerleştirin ve manyetik bir karıştırma çubuğuyla şiddetle karıştırın. Solunum odasına 0.35 miligram mitokondriyal protein ekleyin. Diğer ucunun bir pH metreye düzgün bir şekilde bağlı olduğundan emin olmak için oda kurulumuna metil trifenilfosfonyum duyarlı elektrot ekleyin.Kompleks I.Record solunumu iki ila beş dakika boyunca inhibe etmek için dört milimolar rotenon çözeltisinin 1,25 mikrolitresini ekleyin. Sabit olduğunda oksijen tüketim değerini kaydedin. Daha sonra, ADP kullanımını inhibe etmek için bir oligomisin çözeltisi 0.56 mikrolitre ekleyin.Solunumu yaklaşık 2-5 dakika kaydedin. Sabit olduğunda oksijen tüketim değerini kaydedin. Sonra mitokondriyal iç membran boyunca pH gradyanı kaldırmak için mililitre nigericin çözeltisi başına 80 nanogram 0.112 mikrolitre ekleyin.Solunumu 2-5 dakika kaydedin ve sabit olduğunda oksijen tüketim değerine dikkat edin. Standart bir eğri hazırlamaya başlamak için mitokondriyal kuluçkaya beş mikrolitre 10 milimolar metil trifenifosfonyum çözeltisi ekleyin. Toplam 2,5 konsantrasyona kadar bu eklemeyi dört kez daha tekrarlayın.mikromolar eklenmiştir. Bundan sonra, solunum başlatmak için odasına bir azı çözeltisi çözeltisi beş mikrolitre ekleyin. Kararlı bir iz elde edilene kadar solunumu kaydedin.Daha sonra metin protokolünde belirtildiği gibi sistemi titre etmek için malonate ekleyin. Bu çalışmada, RCR ve proton kaçak kinetik süt 70 gün sonra süt bakır, çinko ve manganez farklı düzeylerde 28 gün beslendi sonra süt ölçülür. Devlet IV solunum manganez düşük düzeyde verilen en yüksek olarak görülür, henüz kontrol en düşük, manganez proton sızıntıbağımlı solunum en aza indirmek önemli bir rol oynadığını gösteren.Hepatik proton sızıntıya bağımlı solunum analizi, bu solunumun düşük manganez ile tedavi edilen en yüksek, kontrol ise en düşük olduğunu ortaya koymaktadır. Bu sonuçlar düşük manganez grubunun en büyük durum IV solunumuna sahip olduğunu, kontrol grubunun ise en düşük olduğunu doğrulamaktadır. Düşük RFI boğalarından doğan Angus'larda yem verimi yüksek RFI boğalarına göre daha yüksek olsa da, bu mitokondriyal RCR'ye veya proton sızıntısı kinetiklerine yansımadı.Bu işlemi gerçekleştirirken mitokondriyi işlerken tüm şişeleri ve gagaları buzda tutmak önemlidir. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra süt ürünleri beslenmesi alanında araştırmacıların karaciğerde yem verimliliği ve mitokondriyal fonksiyondaki mitokondri verimliliğinin rolünü keşfetmelerinin önünü açmıştır. Rotenon ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu işlemi gerçekleştirirken eldiven takmak, göz koruması ve uygun PPE gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Mitokondrial kalsiyum akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri analizleri

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Doku çok az miktarda kullanarak Drosophila Permeabilized liflerinin mitokondrial oksijen harcama ölçme noktalar

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Ölçme ve oksijen Tüketim oranları tamamen yorumlama kafa kesimleri sinek

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Measuring Mitochondrial Electron Transfer Complexes in Previously Frozen Cardiac Tissue from the Offspring of Sow: A Model to Assess Exercise-Induced Mitochondrial Bioenergetics Changes

Daha Önce Dondurulmuş Kardiyak Dokudaki Mitokondriyal Elektron Transfer Komplekslerinin Sow'un Yavrularından Ölçülmesi: Egzersize Bağlı Mitokondriyal Biyoenergetik Değişikliklerini Değerlendirmek için Bir Model

The mitochondrial electron transfer complex (ETC) profile is modified in the heart tissue of the offspring born to an exercised sow. The hypothesis ...

High-Throughput Quantification of the Synthesis and Distribution of mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution (Video) | JoVE 

Mitokondriyal DNA Sentezi ve Dağılımının Yüksek Verimli Görüntü Tabanlı Nicelleştirilmesi

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals (Video) | JoVE 

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

Mitokondriyal Temas Bölgelerini İzole Etmek için Geliştirilmiş Bir Yöntem

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Analyzing Mitochondrial Physiology and Bioenergetics in Fruit Flies

Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry

Exploring Mitochondrial Function and Chemical Toxicity Using Drosophila melanogaster (Video) | JoVE

Yüksek Çözünürlüklü Respirometri Kullanarak Bir Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutantında Mitokondriyal Fonksiyonun Analizi

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy ...