Name: isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays
Uploaded: 2018-09-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays at JoVE.com

وقد أعدت هذه المخطوطة مع التمويل من شعبة العلوم الكيميائية وعلوم الأرض، والعلوم البيولوجية، مكتب 408 من علوم الطاقة الأساسية "إدارة الطاقة الأمريكية" عن طريق المنح دي-SC0017035

1-المواد الأولى
<ol><li>نقع حوالي 55 غ البازلاء لمدة 3 ساعات في 400 مل ماء المقطر ومن ثم تبذر في علبة بلاستيكية (35 سم × 20 سم × 6 سم) في التربة مغطاة بطبقة رقيقة من الفيرميكوليت.</li>
	<li>تنمو في علبة البازلاء عند 20 درجة مئوية تحت الضوء/الظلام (50 µE/م2ق) ح 12/12 دورة 9 إلى 15 يوما.</li>
	<li>تعد الركيزة البروتي?...

<ol>
	<li>Ellis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+protein+synthesis:+principles+and+problems.">Chloroplast protein synthesis: principles and problems.</a> Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).</li><li>Li, H. -. m., Chiu, C. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+transport+into+chloroplasts.">Protein transport into chloroplasts.</a> Annual review of plant biology. 61, (2010).</li><li>Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-specific+energy+requirements+for+protein+transport+across+or+into+thylakoid+membranes.+Two+lumenal+proteins+are+transported+in+the+absence+of+ATP.">Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).</li><li>Skalitzky, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastids+contain+a+second+sec+translocase+system+with+essential+functions.">Plastids contain a second sec translocase system with essential functions.</a> Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).</li><li>Dabney-Smith, C., Storm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plastid Biology. , 271-289 (2014).</li><li>Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+&amp;#34;assisted&amp;#34;+and+&amp;#34;spontaneous&amp;#34;+mechanisms+for+the+insertion+of+polytopic+chlorophyll-binding+proteins+into+the+thylakoid+membrane.">Distinct &amp;#34;assisted&amp;#34; and &amp;#34;spontaneous&amp;#34; mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).</li><li>Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. h. l. o. r. o. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChloroP,+a+neural+network-based+method+for+predicting+chloroplast+transit+peptides+and+their+cleavage+sites.">ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites.</a> Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).</li><li>Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locating+proteins+in+the+cell+using+TargetP,+SignalP+and+related+tools.">Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools.</a> Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).</li><li>Ling, Q., Jarvis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants.">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).</li><li>Lo, S. M., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Photosynthesis Research Protocols. , 139-157 (2011).</li><li>Vernon, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+chlorophylls+and+pheophytins+in+plant+extracts.">Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts.</a> Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).</li><li>Knott, T. G., Robinson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secA+inhibitor,+azide,+reversibly+blocks+the+translocation+of+a+subset+of+proteins+across+the+chloroplast+thylakoid+membrane.">The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).</li><li>Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SecA+homolog+in+protein+transport+within+chloroplasts:+evidence+for+endosymbiont-derived+sorting.">SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting.</a> Science. 266 (5186), 796-798 (1994).</li><li>Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+cDNA+for+pea+chloroplast+SecA+Evolutionary+conservation+of+the+bacterial-type+SecA-dependent+protein+transport+within+chloroplasts.">Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts.</a> FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).</li><li>Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-assisted+post-translational+transport+of+plastidic+type+I+signal+peptidase+1.">Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).</li><li>Luirink, J., Sinning, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRP-mediated+protein+targeting:+structure+and+function+revisited.">SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).</li><li>Yuan, J., Henry, R., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+factor+plays+an+essential+role+in+protein+integration+into+thylakoids+that+cannot+be+replaced+by+unfolding+or+by+heat+shock+protein.">Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein.</a> Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).</li><li>Tjalsma, H., van Dijl, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+consensus+prediction+of+protein+retention+in+a+bacterial+membrane.">Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane.</a> Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).</li><li>Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Facile+Reporter+System+for+the+Experimental+Identification+of+Twin-Arginine+Translocation+(Tat)+Signal+Peptides+from+All+Kingdoms+of+Life.">A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life.</a> Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).</li><li>Yuan, J., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastocyanin+and+the+33-kDa+subunit+of+the+oxygen-evolving+complex+are+transported+into+thylakoids+with+similar+requirements+as+predicted+from+pathway+specificity.">Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).</li><li>Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., B&#252;chel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transversal+and+lateral+exciton+energy+transfer+in+grana+thylakoids+of+spinach.">Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach.</a> Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).</li><li>Frielingsdorf, S., Jakob, M., Kl&#246;sgen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+pool+of+TatA+promotes+Tat-dependent+protein+transport+across+the+thylakoid+membrane.">A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).</li><li>Tu, C. -. J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+FtsY,+chloroplast+signal+recognition+particle,+and+GTP+are+required+to+reconstitute+the+soluble+phase+of+light-harvesting+chlorophyll+protein+transport+into+thylakoid+membranes.">Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).</li></ol>

عزل بلاستيدات الخضراء وثايلاكويد
يمكن أن يؤدي إلى الكسر المفرط في بلاستيدات الخضراء الفقراء العزل ومن ثم ثايلاكويد الفقيرة تسفر عن بعد الانفصال في التدرج. فمن الأفضل مجانسة الأنسجة المقطوع بلطف بضمان أن جميع المواد هي غارقة قبل المزج والنبض في 15 ثانية دورات حتى تجانس تماما. ...

يجب أن يكون ترانسلوكاتيد ما يقرب من جميع البروتينية الآلية المسؤولة عن وظيفة بلاستيدات الخضراء المناسبة من سيتوسول1. في المغلفات بلاستيدات الخضراء، يتم استيراد ركائز البروتين من خلال ترانسلوكون الغشاء الخارجي (TOC) وترانسلوكون من الغشاء الداخلي (عرة)2. مواصلة استهداف ثايلاكويد غشاء والتجويف يحدث خلال إزفاء (كتات) ارجينين التوأم3و الافرازية (cpSec1)4، إشارة اعتراف الجسيمات (كبسرب)5ومسارات الإدراج التلقائي6 . طريقة لعزل عالية الغلة المعايشة النشطة فسيولوجيا والأغشية ثايلاكويد ضروري لقياس علم الطاقة وحركية الحدث إزفاء، فهم آليات النقل المتنوعة في كل مسار، وتعريب بروتين معين الركيزة لمصلحة أي من المقصورات متميزة ستة من بلاستيدات الخضراء.
عزل أغشية من بلاستيدات الخضراء عروض أفضل التجريبية السيطرة على العوامل البيئية (مثل تركيزات الملح والركيزة، ووجود ATP/غتب، وظروف الأس الهيدروجيني) التي تؤثر على قياس النقل علم الطاقة و حركية. هذه البيئة في المختبر يفسح المجال لاستكشاف تفاصيل إزفاء آليا لنفس الأسباب. وباﻹضافة إلى ذلك، بينما تحسنت البرمجيات التنبؤية لتعريب بروتينات بلاستيدات الخضراء7،8، في المختبر فحوصات النقل توفر طريقة أسرع لتأكيد عبر فحوصات الفلورسنت المستندة إلى الفحص المجهري أن تتطلب علامة نيون وراثيا مرمزة، تحول النباتات و/أو أجسام مضادة محددة. نقدم هنا، بروتوكولات للعزلة بلاستيدات الخضراء وثايلاكويد من البازلاء (بيسوم بسام)، وكذلك لفحوصات النقل الأمثل لكل من المسارات إزفاء ثايلاكويد المعتمدة على الطاقة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1936px;" width="1936">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Pisum sativum seeds</td>
			<td style="width:252px;">Seedway LLC, Hall, NY</td>
			<td style="width:292px;">8686 - Little Marvel</td>
			<td style="width:1068px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, Gibbstown, NJ</td>
			<td>475855-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">80% Acetone</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blender with sharpened blades</td>
			<td>Waring Commercial</td>
			<td>BB155S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polytron 10-35</td>
			<td>Fischer Sci</td>
			<td>13-874-617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>GE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beckman J2-MC with JA 20 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>8043-30-1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall RC-5B with HB-4 rotor</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>8327-30-1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>12/3/83</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM MgATP in 1xIB</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>74804-12-9</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermolysin in 1xIB (2mg/mL)</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>9073-78-3</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K-Tricine</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorbitol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>50-70-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manganese Chloride</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>13446-34-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays

الجبيلة هي العضيات في النباتات الخضراء المسؤولة عن القيام بالعديد من الأيضية الأساسية، أبرزها عملية التمثيل الضوئي. ضمن المعايشة، النظام غشاء ثايلاكويد يضم جميع أصباغ التمثيل الضوئي ومجمعات مركز رد الفعل، ومعظم حاملات الإلكترون، وهي مسؤولة عن توليف ATP تعتمد على الضوء. أكثر من 90% بروتينات بلاستيدات الخضراء المشفرة في النواة ومترجمة في سيتوسول واستيرادها فيما بعد إلى بلاستيدات الخضراء. زيادة البروتين النقل إلى أو عبر غشاء ثايلاكويد يستخدم واحد من أربعة مسارات إزفاء. هنا، يمكننا وصف أسلوب عالية الغلة لعزل ثيلاكويدس النقل المختصة من البازلاء (بيسوم Pisum)، جنبا إلى جنب مع فحوصات النقل خلال الثلاث تعتمد على الطاقة كبتات و cpSec1، وكبسرب بوساطة مسارات. هذه الأساليب تمكن التجارب المتصلة بالتعريب البروتين ثايلاكويد وعلم الطاقة النقل آليات إزفاء البروتين عبر الأغشية البيولوجية.

لقياس كمية الركازة نقلها بنجاح، فإنه مفيد لتشمل الممرات "إدخال النسبة المئوية" واحد أو أكثر. واستخدمت البيانات المعروضة أدناه، 10% من رد فعل النقل النهائي دون ثيلاكويدس. هذا "إدخال النسبة المئوية" كما يساعد على تصور حجم الركيزة السلائف. النسبة المئوية تمثل كمية محددة ومعرو...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays at JoVE.com

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

عزل ثيلاكويدس النشطة فسيولوجيا واستخدامها في فحوصات البروتين الطاقة تعتمد على النقل

نقدم بروتوكولات هنا لعزل عالية الغلة من ثيلاكويدس النشطة فسيولوجيا وفحوصات البروتين النقل بلاستيدات الخضراء التوأم ارجينين إزفاء (كتات)، الافرازية (cpSec1)، وإشارة التعرف على مسارات الجسيمات (كبسرب).

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بآليات وحيوية نقل البروتين عبر أغشية البلاستيك الكلوري، وكذلك موقع البروتينات داخل البلاستيدات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية لاستهداف البروتين الثيلاكويد هو أنه يسمح للسيطرة الكاملة على بيئة الثيلاكويد أثناء النقل، بما في ذلك درجة الحرارة، ودرجة الحرارة، والظروف الأيونية، وتركيزات السلائف. تبدأ من خلال نقع ما يقرب من 55 غراما من البازلاء في 400 ملليلتر من الماء المقطر لمدة ثلاث ساعات.زرع البازلاء المنقوعة في صينية بلاستيكية في التربة ، مغطاة بطبقة رقيقة من الفرميكوليت ، وتنمو لمدة تسعة إلى 15 يومًا كما هو موضح في بروتوكول النص. في يوم عزل البلاستبلاست، إعداد تدرج كثافة مستمرة عن طريق الطرد المركزي خليط من 15 ملليلتر من بيركول و 15 ملليلتر من 2xGB العازلة في 15 ملليلتر بولي كربونات أنابيب أجهزة الطرد المركزي عالية السرعة في 30، 900 غم في دوار زاوية ثابتة لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية مع الفرامل قبالة. ثم حصاد ما يقرب من 25 غراما من تسعة إلى 15 يوم براعم البازلاء القديمة.إضافتها إلى 95 ملليلتر من المخزن المؤقت البارد 1xGB في خلاط مبرد، مع شفرات شحذ. وتجانس. تصفية هذا الخليط من خلال ما لا يقل عن طبقتين من القماش الجبن، وضعت في قمع على الكلاك المبردة.الطرد المركزي الترشيح باستخدام 15 ملليلتر البولي الطرد المركزي أنبوب في الدوار دلو يتأرجح في 3، 000 gs لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. تجاهل supernatant واستخدام فرشاة الطلاء لإعادة بلطف بيليه في ملليلتر واحد من 1xGB. بعد أن استخدام ماصة وضعية زجاجية لطبقة بعناية تعليق الشاشة على رأس التدرج Percoll.الطرد المركزي في الدوار دلو يتأرجح في 8، 000 gs لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية مع الفرامل قبالة. باستخدام ماصة الموقف مرة أخرى بعناية نقل الفرقة الخضراء السفلى التي تحتوي على chloroplasts سليمة في أنبوب جديد البولي 50 ملليلتر وإضافة 30 ملليلتر من العازلة 1xIB. الطرد المركزي الأنبوب في الدوار دلو يتأرجح في 1، 800 غم لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.بعد التخلص من زان، resuspend بلطف بيليه في ملليلتر واحد من 1xIB مع فرشاة الطلاء. غسل في 30 ملليلتر من 1xIB والطرد المركزي مرة أخرى في ظل نفس الظروف. إعادة تعليق بيليه بعد الطرد المركزي النهائي في ملليلتر واحد من 1xIB.لتحديد تركيز الكلورو فيريل، اخلط 10 ميكرولترات من رأب الكلور المُعاد إعاده بالكامل مع خمسة ملليلترات من الأسيتون بنسبة 80٪. قم بالتصفية من خلال ورقة فلتر سميكة 180 ميكرومتر بحجم 11 ميكرومتر ثم حدد تركيز الكلوروفير بواسطة مقياس الطيف. تخفيف خليط الكلوروبلاست إلى مليغرام واحد لكل ملليلتر باستخدام 1xIB الباردة.لبدء عزل thylakoids عندما استخراج stromal ليست ضرورية، مثل cpTat النقل، والبلاستيدات الكلورية سليمة في 1.5 ملليلتر أنابيب في دوار دلو يتأرجح في 1، 000 غم في أربع درجات مئوية لمدة ست دقائق. بعد ذلك، والتخلص من افرط و resuspend بيليه في العازلة تحلل تحلل هابية الطنين لتحقيق واحد ملليغرام لكل ملليلتر مع ميكروبيبيت. احتضان على الجليد في الظلام مع خلط عرضية لمدة 10 دقائق.لاستعادة ثيلوفويد، جهاز طرد مركزي في دوار دلو يتأرجح في 3، 200 غرام في أربع درجات مئوية لمدة ثماني دقائق. غسل thylokoids مرتين عن طريق resuspending بيليه مع ملليلتر واحد إلى اثنين من العازلة تحلل ثم الطرد المركزي في ظل نفس الظروف. بعد الطرد المركزي النهائي، resuspend بيليه، في ملليلتر واحد من العازلة 1xIB وتحديد تركيز الكلوروفير في thylokoids معزولة باستخدام مقياس الطيفي كما ثبت سابقا.للمسارات التي تتطلب استخراج السترومال الانتعاش مثل CPSec1 وCPSRP eliquate 600 microliters من الكلوروبلاست المعزولة في الدوار دلو يتأرجح والطرد المركزي في 1، 000 غم لمدة ست دقائق في أربع درجات مئوية. بالنسبة للتحلل من البلاستيك، نعلق بيليه مع 600 ميكرولترات من عازلة التحلل الهابوينك. احتضان على الجليد في الظلام لمدة 10 دقائق مع خلط عرضية.ثم الطرد المركزي الأنابيب في الدوار دلو يتأرجح في 3، 200 غم لمدة ثماني دقائق في أربع درجات مئوية. لحفظ ستروما، نقل الأخضر الفاتح إلى صفراء فائقة إلى أنبوب جديد جهاز طرد مركزي صغير وإضافة حجم مساو من 2x الخام السترومال العازلة. لغسل ثيلوفويدات، إضافة مجلدين من العازلة التحلل والطرد المركزي في 3، 200 gs لمدة ثماني دقائق في أربع درجات مئوية.Resuspend بيليه في 1xIB لتحقيق تركيز الكلورو واحد ملليغرام لكل ملليلتر وتوضع جانبا على الجليد لاستخدامها في وقت لاحق في المقايسات النقل. إزالة الأغشية المتبقية من ستروما الخام عن طريق الطرد المركزي stroma الخام المخفف في دوار زاوية ثابتة في 42، 000 gs لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. ثم جمع 95٪ من حجم من كل أنبوب مع التأكد من عدم إزعاج بيليه الأخضر الأصفر صغيرة، مع الإشارة إلى حجم مأخوذة من كل أنبوب.لإعداد استخراج السترومال المركزة، تجمع اكثف التي تم جمعها. ثم استخدام أربعة ملليلتر 30 كيلودالتون الجزيئية الوزن قطع التركيز التركيز على استخراج خمس أضعاف. لمقايسة cpTat نقل في أنبوب 1.5 ملليلتر على الجليد مزيج thylokoids المعزولة إلى تركيز الكلورو النهائي من 0.33 ملليغرام لكل ملليلتر، خمسة ملليمولار ATP أعدت في 1xIB، وثمانية DTT millimolar أعدت في 1xIB.لبدء النقل، أدخل البروتين تحتية إلى مزيج النقل. إجراء رد الفعل عن طريق إلقاء الضوء على التعليق مع 80 إلى 100 ميكروينشتاين في الثانية الواحدة من الإشعاع النشط الضوئي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لوقف رد فعل النقل، تمييع تعليق ثمانية أضعاف مع الجليد البارد 1xIB.جهاز طرد مركزي في 3،200 gs في جهاز طرد مركزي صغير لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية لاستعادة thylokoids. بعد التخلص من المابير، resuspend بيليه في 120 ميكرولترات من الجليد البارد 1xIB. لمقايسة مسارات CPSec1 أو PSRP مزيج ما يلي في أنبوب 1.5 ملليلتر على الجليد.Thylakoids إلى تركيز الكلوروفير النهائي من 0.33 ملليغرام لكل ملليلتر، 0.83 ملليغرام لكل ملليلتر كلوروفير مكافئات من مستخلص السترومال، وخمسة المليمولار ATP أعدت في 1xIB. جلب رد فعل يصل إلى حجم المطلوب مع الجليد البارد 1xIB واحتضان على الجليد لمدة 10 دقائق. لبدء النقل إدخال 10٪ حجم من قبل حجم البروتين الركيزة لهذا المزيج النقل.تضيء مع 80 إلى 100 ميكروينشتاينس في المتر المربع في الثانية من الإشعاع النشط الضوئي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لوقف رد الفعل، وتمييع تعليق ثمانية أضعاف مع الجليد البارد 1xIB. جهاز طرد مركزي في 3، 200gs في جهاز طرد مركزي صغير لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.بعد التخلص من المابير، resuspend بيليه في 120 ميكرولترات من الجليد البارد 1xIB. لإزالة الركيزة المتبقية التي لم يتم نقلها، هضم البروتين الخارجي بإضافة ستة ميكرولترات من اثنين ملليغرام لكل ملليلتر ثيرملليسين و 10 ملليمولار كلوريد الكالسيوم في 1xIB. احتضان رد فعل البروتياز هذا على الجليد لمدة 40 دقيقة.إخماد البروتياز من خلال مضاعفة حجم مع 25 ملليمولار EDTA في 1xIB. جهاز طرد مركزي في 3،200 gs في جهاز طرد مركزي صغير لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية لاستعادة thylokoids. بعد إزالة supernatant، تعافى ريسوسيبوسيد thylokoids في 120 ميكرولترات من خمسة EDTA الوليمولار في 1xIB، ونقلها إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر.بعد الطرد المركزي مرة أخرى في 3، 200 gs في جهاز طرد مركزي صغير لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية، والتخلص من افرط وإعادة تعليق بيليه في حجم مناسب من عازلة عينة laemmli، تستكمل مع 10 ملليمولار EDTA. ضع العينات في حمام مائي مغلي لمدة 10 دقائق. تابع لتحليل العينات حسب صفحة SDS.نقل iOE17 البروتين من خلال المسار cpTat أدى إلى تحول حجم من اثنين إلى ثلاثة كيلودالتون بين الركيزة المقدمة والشكل ناضجة معالجتها. ويرجع ذلك إلى انشقاق الببتيد إشارة المحطة n تشير إلى نقل cpTat ناجحة. العلاج thermolysin يترك فقط نقل بنجاح وبالتالي proteus مقاومة الفرقة ناضجة.وأدى نقل السلائف OE33 عبر مسار CPSec1 إلى تحول في الحجم في الركيزة الناضجة، وحماية البروتيوس للركيزة المنقولة. أدى إدخال سلائف LHCP في الغشاء الثيريلوكيد عبر مسار cpSRP ، الذي تم تقييمه من خلال هضم الثيرموسين إلى تحول في الحجم من 1.5 إلى كيلودالتونين. وأشار هذا الإدراج الغشاء الناجح, كما يحمي الغشاء غير نظيفة من ناضجة LHCP المنتج من تحلل proteolysis كاملة.بعد مشاهدة هذا الفيديو يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل thylokoids ومقايسة المرونة من خلال cpTat الطاقة تعتمد ، cpSec 1 ومسارات cpSRP. مرة واحدة يتقن هذه التقنية يمكن القيام به في ثلاث إلى أربع ساعات عندما يؤديها بشكل صحيح. على الرغم من أن لا يتضح في هذا الفيديو ونحن عموما إبقاء الأضواء العلوية قبالة في المختبر عند عزل والعمل مع البلاستيك الضوئي النشطة والثيلاكويدات.أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم الحفاظ على الكلوروبلاست المعزولة والثيلاكويدات عند أربع درجات مئوية. تذكر أن تُعيد عملية البلاستيدات بالكلورات برفق في البداية. تجنب إزعاج تدرج Procoll بعد الخطوة الأولى من التفكير.بالإضافة إلى ذلك، يمكن إعداد عينة الإدخال في النسبة المئوية بالتوازي مع تفاعلات النقل وتشغيلها على نفس الجل لتقدير النقل الركيزة. لا تنسوا أن العمل مع الركائز المشعة يتطلب التعامل مع الضمير والمعدات الشخصية المناسبة. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال استهداف البروتين لاستكشاف حيوية ، والحركيات والآليات الفريدة التي تحكم نقل البروتين عبر الأغشية الثايلاكويد.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

وسيلة فعالة لعزل الحمض النووي الريبي العالية النقاء من بذور للاستخدام في التحليل الكمي Transcriptome على

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

توليف 1،2-Azaborines وإعداد مجمعات البروتين مع T4 الليزوزيم المسوخ

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

تحليل سوبيركومبلكسس من سلسلة النقل الإلكترون الميتوكوندريا مع الكهربائي الأصلي، في هلام فحوصات، والكهرباء

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

وصف SP0092 الركيزة-ملزمة-بروتين النقل الكربوهيدرات البيوكيميائية والهيكلية

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

والعزلة وقياسات الجهاز التنفسي من الميتوكوندريا من التمويل نبات

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

سبليت-بيويد-تحليل البروتين مجمعات البروتين محددة السياق في بيئتها الخلوية الأصلية

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

استخدام البروتينات الانصهار المؤتلف في منصة فحص حوزتي فلورسنت وما ريناتوريشن في جل

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

في كل مكان في المختبر واختبارات الديوبيكيتيمنت النيوكليوسوم

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

تطبيق قياس التداخل الحيوي (BLI) لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في النسخ

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...