Name: isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays
Uploaded: 2018-09-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays at JoVE.com

Dette håndskrift blev udarbejdet med finansiering af Division af kemiske videnskaber, Geosciences og biovidenskab, 408 Office af energi Grundvidenskab af os Department of Energy gennem Grant DE-SC0017035

1. indledende materialer
<ol><li>Suge ca. 55 g ærter i 3 timer i 400 mL destilleret vand, og derefter soen i en plastik bakke (35 cm x 20 cm x 6 cm) i jorden dækket med tynde lag af vermiculit.</li>
	<li>Vokse bakke ærter ved 20 ° C under 12/12 h lys/mørke (50 µE/m2s) cyklus for 9-15 dage.</li>
	<li>Forberede protein substrat efter en foretrukne metode. Bemærk: Vi har forberedt protein substrater ved hjælp af en række forskellige metoder, herunder 1) in vitro- transskription fra renset p...

<ol>
	<li>Ellis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+protein+synthesis:+principles+and+problems.">Chloroplast protein synthesis: principles and problems.</a> Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).</li><li>Li, H. -. m., Chiu, C. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+transport+into+chloroplasts.">Protein transport into chloroplasts.</a> Annual review of plant biology. 61, (2010).</li><li>Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-specific+energy+requirements+for+protein+transport+across+or+into+thylakoid+membranes.+Two+lumenal+proteins+are+transported+in+the+absence+of+ATP.">Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).</li><li>Skalitzky, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastids+contain+a+second+sec+translocase+system+with+essential+functions.">Plastids contain a second sec translocase system with essential functions.</a> Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).</li><li>Dabney-Smith, C., Storm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plastid Biology. , 271-289 (2014).</li><li>Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+&amp;#34;assisted&amp;#34;+and+&amp;#34;spontaneous&amp;#34;+mechanisms+for+the+insertion+of+polytopic+chlorophyll-binding+proteins+into+the+thylakoid+membrane.">Distinct &amp;#34;assisted&amp;#34; and &amp;#34;spontaneous&amp;#34; mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).</li><li>Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. h. l. o. r. o. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChloroP,+a+neural+network-based+method+for+predicting+chloroplast+transit+peptides+and+their+cleavage+sites.">ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites.</a> Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).</li><li>Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locating+proteins+in+the+cell+using+TargetP,+SignalP+and+related+tools.">Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools.</a> Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).</li><li>Ling, Q., Jarvis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants.">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).</li><li>Lo, S. M., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Photosynthesis Research Protocols. , 139-157 (2011).</li><li>Vernon, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+chlorophylls+and+pheophytins+in+plant+extracts.">Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts.</a> Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).</li><li>Knott, T. G., Robinson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secA+inhibitor,+azide,+reversibly+blocks+the+translocation+of+a+subset+of+proteins+across+the+chloroplast+thylakoid+membrane.">The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).</li><li>Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SecA+homolog+in+protein+transport+within+chloroplasts:+evidence+for+endosymbiont-derived+sorting.">SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting.</a> Science. 266 (5186), 796-798 (1994).</li><li>Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+cDNA+for+pea+chloroplast+SecA+Evolutionary+conservation+of+the+bacterial-type+SecA-dependent+protein+transport+within+chloroplasts.">Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts.</a> FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).</li><li>Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-assisted+post-translational+transport+of+plastidic+type+I+signal+peptidase+1.">Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).</li><li>Luirink, J., Sinning, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRP-mediated+protein+targeting:+structure+and+function+revisited.">SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).</li><li>Yuan, J., Henry, R., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+factor+plays+an+essential+role+in+protein+integration+into+thylakoids+that+cannot+be+replaced+by+unfolding+or+by+heat+shock+protein.">Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein.</a> Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).</li><li>Tjalsma, H., van Dijl, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+consensus+prediction+of+protein+retention+in+a+bacterial+membrane.">Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane.</a> Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).</li><li>Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Facile+Reporter+System+for+the+Experimental+Identification+of+Twin-Arginine+Translocation+(Tat)+Signal+Peptides+from+All+Kingdoms+of+Life.">A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life.</a> Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).</li><li>Yuan, J., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastocyanin+and+the+33-kDa+subunit+of+the+oxygen-evolving+complex+are+transported+into+thylakoids+with+similar+requirements+as+predicted+from+pathway+specificity.">Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).</li><li>Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., B&#252;chel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transversal+and+lateral+exciton+energy+transfer+in+grana+thylakoids+of+spinach.">Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach.</a> Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).</li><li>Frielingsdorf, S., Jakob, M., Kl&#246;sgen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+pool+of+TatA+promotes+Tat-dependent+protein+transport+across+the+thylakoid+membrane.">A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).</li><li>Tu, C. -. J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+FtsY,+chloroplast+signal+recognition+particle,+and+GTP+are+required+to+reconstitute+the+soluble+phase+of+light-harvesting+chlorophyll+protein+transport+into+thylakoid+membranes.">Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).</li></ol>

Grønkorn og tylakoid isolation
Overdreven brud kan resultere i dårlig grønkorn isolation og dermed dårlig tylakoid udbytte efter separation i farveforløbet. Det er bedst at homogenisere de høstede væv forsigtigt ved at sikre, at alt materiale er neddykket før blanding og pulserende i 15 s cykler indtil fuldt homogeniseret. Hvis det er nødvendigt, bruge flere kortere runder af blanding med mindre væv i hver runde.
Køle alle materialer, der kommer i kontakt me...

Næsten alle de proteinholdige maskiner ansvarlig for korrekt grønkorn funktion skal omplantes fra cytosol1. På grønkorn konvolutter, er protein substrater importeret gennem translocon af den ydre membran (TOC) og translocon i den indre membran (TIC)2. Yderligere målretning til tylakoid sker membran og lumen gennem twin arginin translokation (cpTat)3, sekretorisk (cpSec1)4, signal anerkendelse partikel (cpSRP)5og spontane indsættelse veje6 . En metode til højtydende isolering af fysiologisk aktive grønkorn og tylakoid membraner er nødvendigt at måle energetik og kinetik af en translokation begivenhed, at forstå de forskellige transportmekanismer på hver vej og lokalisere en bestemt protein substrater af interesse for nogen af de seks særskilte rum af chlorplasttransitpeptidsekvensen.
Isolering af membraner fra chlorplasttransitpeptidsekvensen tilbyder bedre eksperimentelle kontrol over miljømæssige faktorer (såsom salt og substrat koncentrationer, tilstedeværelsen af ATP/GTP og pH betingelser), der påvirker målingen af transport energetik og kinetik. Denne in vitro- miljø egner sig til udforskning af mekaniske detaljer af translokation af de samme grunde. Desuden, mens intelligent software til lokalisering af grønkorn proteiner har forbedret7,8, giver in vitro- transport assays en hurtigere metode til bekræftelse over mikroskopi-baserede fluorescerende assays kræve en genetisk kodet fluorescerende tag, plante transformation og/eller specifikke antistoffer. Vi præsenterer her, protokoller for grønkorn og tylakoid isolering fra ærter (Pisum sativum) samt for transport assays optimeret til hver af de energi-afhængige tylakoid translokation veje.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1936px;" width="1936">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Pisum sativum seeds</td>
			<td style="width:252px;">Seedway LLC, Hall, NY</td>
			<td style="width:292px;">8686 - Little Marvel</td>
			<td style="width:1068px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, Gibbstown, NJ</td>
			<td>475855-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">80% Acetone</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blender with sharpened blades</td>
			<td>Waring Commercial</td>
			<td>BB155S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polytron 10-35</td>
			<td>Fischer Sci</td>
			<td>13-874-617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>GE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beckman J2-MC with JA 20 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>8043-30-1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall RC-5B with HB-4 rotor</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>8327-30-1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>12/3/83</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM MgATP in 1xIB</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>74804-12-9</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermolysin in 1xIB (2mg/mL)</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>9073-78-3</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K-Tricine</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorbitol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>50-70-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manganese Chloride</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>13446-34-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays

Kloroplaster er organelles i grønne planter forestår mange væsentlige stofskifteveje, især fotosyntese. I grønkornene, tylakoid membran system huse alle de fotosyntetiske pigmenter, reaktion center komplekser og de fleste af elektron luftfartsselskaber, og er ansvarlig for lys-afhængige ATPsyntesen. Over 90% af grønkorn proteiner er kodet i kernen, oversat i cytosol og efterfølgende importeres til chlorplasttransitpeptidsekvensen. Yderligere protein transport ind eller tylakoidmembranen udnytter en af fire translokation veje. Her, beskriver vi en højtydende metode til isolation af transport-kompetente tylakoiderne fra ærter (Pisum sativum), sammen med transport assays gennem tre energiafhængige cpTat, cpSec1 og cpSRP-medieret veje. Disse metoder aktiverer eksperimenter vedrørende tylakoid protein lokalisering, transport energetik og mekanismer for protein translokation over biologiske membraner.

For at måle mængden af substratet med held transporteres, er det nyttigt at inkludere en eller flere "procent input" baner. For data præsenteret nedenfor, blev 10% af den endelige transport reaktion uden tylakoiderne brugt. Denne "procent input" hjælper også til at visualisere størrelsen af forløber substrat. Procentdelen er en kendt, defineret substrat som at sammenligne transporteres substrat mod og kan skaleres op eller ned som nødvendige hjælp i første omgang forberedt prote...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays at JoVE.com

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering af fysiologisk aktive tylakoiderne og deres anvendelse i energiafhængige Protein Transport Assays

Vi præsenterer protokoller heri til højtydende isolation af fysiologisk aktive tylakoiderne og protein transport assays til grønkorn twin arginin translokation (cpTat), sekretorisk (cpSec1) og signal anerkendelse partikel (cpSRP) veje.

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål vedrørende mekanismer og energiske af protein transport på tværs af kloroplast membraner, samt placeringen af proteiner i plastider. Den største fordel ved denne teknik til thylakoid protein målretning er, at det giver mulighed for fuldstændig kontrol af thylakoid miljø under transport, herunder temperatur, pH, ioniske forhold, og prækursor koncentrationer. Begynd med at dyppe ca. 55 gram ærter i 400 milliliter destilleret vand i tre timer.Så de gennemblødte ærter i en plastikbakke i jorden, dækket med et tyndt lag vermiculit, og vokse i ni til 15 dage som beskrevet i tekstprotokollen. På kloroplastisolationens dag forberedes en kontinuerlig tæthedsgradient ved at centrifugere en blanding af 15 milliliter Percoll og 15 milliliter 2xGB-buffer i et 15 milliliter polycarbonat højhastighedscentrifugerør ved 30, 900 g i en fast vinkelrotor i 30 minutter ved fire grader Celsius med bremsen slukket. Så høst cirka 25 gram ni til 15 dage gamle ært skud.Tilføj dem til 95 milliliter kold 1xGB buffer i en kølet blender, med skærpede knive. Og homogenisere. Denne blanding filtreres gennem mindst to lag osteklud, placeret i en tragt over et kølet bægerglas.Centrifuge filtratet ved hjælp af et 15 milliliter polycarbonatcentrifugerør i en svingende skovrotor ved 3.000 g i fem minutter ved fire grader Celsius. Kassér supernatanten og brug en pensel til forsigtigt at opslænne pellet i en milliliter 1xGB. Efter at bruge et glas kropsholdning pipette til omhyggeligt lag skærmen suspension på toppen af Percoll gradient.Centrifuge det i en svingende spand rotor på 8, 000 gs i 10 minutter ved fire grader Celsius med bremsen slukket. Ved hjælp af en arbejdsstillingspipette overføres forsigtigt det nederste grønne bånd, der indeholder intakte kloroplaster, til et friskt 50 milliliter polycarbonatrør og tilsættes 30 milliliter 1xIB-buffer. Centrifuge røret i en svingende spand rotor ved 1, 800 gs i fem minutter ved fire grader Celsius.Efter udsmid af supernatanten skal pellets forsigtigt resuspendere pellet i en milliliter 1xIB med en pensel. Vaskes i 30 milliliter 1xIB og centrifugere under samme betingelser. Pelletpend pellets efter den endelige centrifugering i en milliliter 1xIB.For at bestemme klorofylkoncentrationen blandes 10 mikroliter fuldt opslængede kloroplaster med fem milliliter 80% acetone. Gennem et 180 mikrometer tykt filterpapir med 11 mikrometer porestørrelse og bestemmes derefter klorofylkoncentrationen ved spektrofotometer. Chloroplastblandingen fortyndes til et milligram pr. milliliter med koldt 1xIB.For at begynde at isolere thylakoider, når stromal ekstrakt ikke er nødvendigt, såsom cpTat transport, centrifuge intakt kloroplaster i 1,5 milliliter rør i en svingende spand rotor ved 1, 000 g ved fire grader Celsius i seks minutter. Derefter kasseres supernatanten og opslæm pellet i hypotonisk lysis buffer for at opnå en milligram pr. milliliter med en mikropipette. Inkuber på is i mørke med lejlighedsvis blanding i 10 minutter.For at inddrive thylokoider, centrifuge i en svingende spand rotor ved 3, 200 gs ved fire grader Celsius i otte minutter. Skjoldbruskkirtlerne vaskes to gange ved at opslænke pellet med en til to milliliter lysisbuffer og derefter centrifugering under de samme betingelser. Efter den endelige centrifugering opsuspenrede pellet'en i en milliliter 1xIB-buffer og bestemmes klorofylkoncentrationen i isolerede thylokoider ved hjælp af et spektrofotometer som tidligere påvist.For veje, der kræver stromale ekstrakt opsving såsom CPSec1 og CPSRP eliquate 600 mikroliter af isolerede kloroplaster i en svingende spand rotor og centrifuge ved 1, 000 gs i seks minutter ved fire grader Celsius. Til chlorplastlysis suspenderer vi pellet med 600 mikroliter hypotonisk lysisbuffer. Inkuber på is i mørke i 10 minutter med lejlighedsvis blanding.Derefter centrifuge rørene i en svingende spand rotor på 3, 200 gs i otte minutter ved fire grader Celsius. For at gemme stroma, overføre den lysegrønne til gul supernatant til en ny mikro centrifuge rør og tilføje et tilsvarende volumen på 2x rå stromale buffer. At vaske thylokoider, tilføje to mængder lysis buffer og centrifuge ved 3, 200 gs i otte minutter ved fire grader Celsius.Pelletsuspendrer pelletet i 1xIB for at opnå klorofylkoncentration på 1 mg pr. milliliter og der er afsat på is til senere brug i transportanalyser. Resterende membraner fjernes fra rå stroma ved centrifugering af den fortyndede rå stroma i en fast vinkelrotor ved 42.000 g i 30 minutter ved fire grader Celsius. Derefter indsamles 95% af volumen fra hvert rør og sørg for ikke at forstyrre den lille gule grønne pellet, mens du noteretr for volumen taget fra hvert rør.For at forberede den koncentrerede stromale ekstrakt, pool de indsamlede supernatants. Brug derefter en 4 milliliter 30 kilodalton molekylvægt cut-off koncentrator til at koncentrere ekstraktet fem gange. At analysere cpTat transport i en 1,5 milliliter rør på is blandes de isolerede thylokoider til en endelig klorofyl koncentration på 0,33 mg pr milliliter, fem millimolar ATP fremstillet i 1xIB, og otte millimolar DTT fremstillet i 1xIB.For at starte transporten skal der indføres substratprotein i transportblandingen. Udbet reaktionen ved at belyse suspensionen med 80 til 100 mikroeinstein pr. kvadratmeter pr. sekund af fotosyntetisk aktiv stråling i 10 minutter ved stuetemperatur. For at stoppe transportreaktionen fortyndes suspensionen otte gange med iskold 1xIB.Centrifuge ved 3, 200 g i en mikrocentrifuge i fem minutter ved fire grader Celsius for at inddrive thylokoider. Efter udsmid af supernatanten skal pelletsen resuspendere pellet i 120 mikroliter iskold 1xIB. At analysere CPSec1 eller PSRP veje blande følgende i en 1,5 milliliter rør på is.Thylakoider til en endelig klorofylkoncentration på 0,33 mg/milliliter, 0,83 mg/milliliter klorofylækvivalenter af stromalt ekstrakt og fem millimolar ATP fremstillet i 1xIB. Bring reaktionen op på det ønskede volumen med iskold 1xIB og inkuber på is i 10 minutter. For at starte transporten indføre 10% volumen i volumen af substrat protein til denne transport mix.Belys med 80 til 100 mikroeinstein per kvadratmeter per sekund af fotosyntetisk aktiv stråling i 10 minutter ved stuetemperatur. For at stoppe reaktionen fortyndes suspensionen otte gange med iskold 1xIB. Centrifuge på 3, 200gs i en mikro centrifuge i fem minutter ved fire grader Celsius.Efter udsmid af supernatanten skal pelletsen resuspendere pellet i 120 mikroliter iskold 1xIB. For at fjerne restunderlag, der ikke er blevet transporteret, fordøjes eksternt protein ved at tilsætte seks mikroliter på to milligram pr. milliliter termolysin og 10 millimolar calciumchlorid i 1xIB. Inkuber denne proteasereaktion på is i 40 minutter.Sluk protease ved at fordoble volumen med 25 millimolar EDTA i 1xIB. Centrifuge ved 3, 200 g i en mikrocentrifuge i fem minutter ved fire grader Celsius for at inddrive thylokoider. Efter fjernelse af supernatant, resuspend genvundet thylokoider i 120 mikroliter af fem milimolar EDTA i 1xIB, og overføre til en ny 1,5 milliliter rør.Efter centrifugering igen ved 3, 200 g i en mikrocentrifuge i fem minutter ved fire grader Celsius kasseres supernatanten og genanvende pellet i et passende volumen af laemmli prøvebuffer, suppleret med 10 millimolar EDTA. Prøverne hældes i et kogende vandbad i 10 minutter. Fortsæt med at analysere eksemplerne efter SDS-side.Transport af iOE17 protein gennem cpTat-vejen resulterede i et størrelsesskift på to til tre kilodaltons mellem det indførte substrat og den modne forarbejdede form. Dette skyldes spaltning af n terminal signal peptid angiver en vellykket cpTat transport. Thermolysin behandling efterlader kun den vellykkede transporterede og derfor proteus resistente modne bånd.Transport af OE33 forløber gennem CPSec1 vej, resulterede i en størrelse skift i den modne substrat, og proteus beskyttelse af det transporterede substrat. Indsættelse af LHCP forløber i thylokoid membran via cpSRP vej, evalueret gennem thermolysin fordøjelsen førte til en størrelse skift på 1,5 til to kilodaltons. Dette indikerede vellykket membranindføring, da membranen beskytter det uoverdrede af modne LHCP nedbrydningsprodukt mod komplet proteolyse.Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan man isolere thylokoider og assay tranportivity gennem den energiafhængige cpTat, cpSec 1 og cpSRP veje. Når mestrer denne teknik kan gøres i tre til fire timer, når de udføres korrekt. Selvom det ikke er illustreret i denne video, holder vi generelt luftlysene slukket i laboratoriet, når vi isolerer og arbejder med fotosyntetisk aktive kloroplaster og thylakoider.Mens du forsøger denne procedure er det vigtigt at holde isoleret kloroplast og thylakoider på fire grader Celsius. Husk at resuspend chloroplaster forsigtigt i begyndelsen. Undgå at forstyrre Procoll-gradienten efter det første centrifucationtrin.Derudover kan procent input prøve fremstilles parallelt med transport reaktioner og køre på samme gel til at vurdere substrat transport. Glem ikke, at arbejde med radioaktive substrater kræver samvittighedsfuld håndtering og korrekt PPE. Efter det udvikling, denne teknik banede vejen for forskere inden for protein målretning at udforske de energiske, kinetik og unikke mekanismer, der regulerer protein transport på tværs af thylakoid membraner.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metode til isolering af stærkt Renset RNA fra Frø til brug i Kvantitative Transkriptomet Analysis

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Syntese af 1,2-Azaborines og udarbejdelsen af ​​deres proteinkomplekser med T4 lysozym Mutants

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analyse af superkomplekser af den mitokondrieelektron transportkæde med indfødte elektroforese, in-gel analyser og elektrolysering

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiske og strukturel karakterisering af kulhydrat Transport substrat-bindende-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation og respiratoriske målinger af mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteom analyse af kontekst-specifik proteinkomplekser i deres Native cellulære miljø

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Brug af rekombinant Fusion proteiner i et fluorescerende Protease Assay Platform og deres i-gel genopretning

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse af proteinfoldning, Transport og nedbrydning i levende celler af radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

In vitro-allestedsnærværende og Deubiquitinationassays af Nukleosomale histoner

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anvendelse af Biolayer interferometri (BLI) til undersøgelse af protein-protein interaktioner i transkriptionen

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...