Name: isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays
Uploaded: 2018-09-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays at JoVE.com

Dit manuscript was bereid met financiering door de Division of Chemical Sciences, Geowetenschappen en Biosciences, 408 Office van de basiswetenschappen van de energie van het ons ministerie van energie door middel van Grant DE-SC0017035

1. initiële materialen
<ol><li>Geniet van ongeveer 55 gram erwten voor 3 uur in 400 mL gedestilleerd water, en dan zaaien in een kunststof dienblad (35 cm x 20 cm x 6 cm) in bodem bedekt met een dun laagje vermiculiet.</li>
	<li>Groeien de lade van erwten bij 20 ° C onder de 12/12 h (50 µE/m2s) licht/donker cyclus voor 9 tot 15 dagen.</li>
	<li>Eiwit substraat volgens een voorkeur voor te bereiden. Opmerking: Wij hebben bereid proteïne substraten met behulp van een verscheidenheid van methoden, met in...

<ol>
	<li>Ellis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+protein+synthesis:+principles+and+problems.">Chloroplast protein synthesis: principles and problems.</a> Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).</li><li>Li, H. -. m., Chiu, C. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+transport+into+chloroplasts.">Protein transport into chloroplasts.</a> Annual review of plant biology. 61, (2010).</li><li>Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-specific+energy+requirements+for+protein+transport+across+or+into+thylakoid+membranes.+Two+lumenal+proteins+are+transported+in+the+absence+of+ATP.">Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).</li><li>Skalitzky, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastids+contain+a+second+sec+translocase+system+with+essential+functions.">Plastids contain a second sec translocase system with essential functions.</a> Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).</li><li>Dabney-Smith, C., Storm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plastid Biology. , 271-289 (2014).</li><li>Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+&amp;#34;assisted&amp;#34;+and+&amp;#34;spontaneous&amp;#34;+mechanisms+for+the+insertion+of+polytopic+chlorophyll-binding+proteins+into+the+thylakoid+membrane.">Distinct &amp;#34;assisted&amp;#34; and &amp;#34;spontaneous&amp;#34; mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).</li><li>Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. h. l. o. r. o. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChloroP,+a+neural+network-based+method+for+predicting+chloroplast+transit+peptides+and+their+cleavage+sites.">ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites.</a> Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).</li><li>Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locating+proteins+in+the+cell+using+TargetP,+SignalP+and+related+tools.">Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools.</a> Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).</li><li>Ling, Q., Jarvis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants.">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).</li><li>Lo, S. M., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Photosynthesis Research Protocols. , 139-157 (2011).</li><li>Vernon, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+chlorophylls+and+pheophytins+in+plant+extracts.">Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts.</a> Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).</li><li>Knott, T. G., Robinson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secA+inhibitor,+azide,+reversibly+blocks+the+translocation+of+a+subset+of+proteins+across+the+chloroplast+thylakoid+membrane.">The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).</li><li>Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SecA+homolog+in+protein+transport+within+chloroplasts:+evidence+for+endosymbiont-derived+sorting.">SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting.</a> Science. 266 (5186), 796-798 (1994).</li><li>Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+cDNA+for+pea+chloroplast+SecA+Evolutionary+conservation+of+the+bacterial-type+SecA-dependent+protein+transport+within+chloroplasts.">Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts.</a> FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).</li><li>Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-assisted+post-translational+transport+of+plastidic+type+I+signal+peptidase+1.">Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).</li><li>Luirink, J., Sinning, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRP-mediated+protein+targeting:+structure+and+function+revisited.">SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).</li><li>Yuan, J., Henry, R., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+factor+plays+an+essential+role+in+protein+integration+into+thylakoids+that+cannot+be+replaced+by+unfolding+or+by+heat+shock+protein.">Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein.</a> Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).</li><li>Tjalsma, H., van Dijl, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+consensus+prediction+of+protein+retention+in+a+bacterial+membrane.">Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane.</a> Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).</li><li>Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Facile+Reporter+System+for+the+Experimental+Identification+of+Twin-Arginine+Translocation+(Tat)+Signal+Peptides+from+All+Kingdoms+of+Life.">A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life.</a> Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).</li><li>Yuan, J., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastocyanin+and+the+33-kDa+subunit+of+the+oxygen-evolving+complex+are+transported+into+thylakoids+with+similar+requirements+as+predicted+from+pathway+specificity.">Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).</li><li>Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., B&#252;chel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transversal+and+lateral+exciton+energy+transfer+in+grana+thylakoids+of+spinach.">Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach.</a> Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).</li><li>Frielingsdorf, S., Jakob, M., Kl&#246;sgen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+pool+of+TatA+promotes+Tat-dependent+protein+transport+across+the+thylakoid+membrane.">A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).</li><li>Tu, C. -. J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+FtsY,+chloroplast+signal+recognition+particle,+and+GTP+are+required+to+reconstitute+the+soluble+phase+of+light-harvesting+chlorophyll+protein+transport+into+thylakoid+membranes.">Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).</li></ol>

Chloroplast en thylakoïde isolement
Buitensporige breuk kan resulteren in slechte chloroplast isolatie en dus slechte thylakoïde opbrengst na scheiding in het verloop. Het is best om het homogeniseren van het geoogste weefsel voorzichtig door ervoor te zorgen dat al het materiaal voor het mengen en pulserende in 15 s-cycli totdat volledig gehomogeniseerd wordt ondergedompeld. Gebruik indien nodig meerdere kortere rondes van mengen met minder weefsel in elke ronde.
Al...

Bijna alle van de eiwithoudende machine verantwoordelijk voor goede chloroplast functie moet worden translocated van het cytosol1. Op de chloroplast enveloppen, worden eiwit substraten geïmporteerd door middel van de translocon van het buitenste membraan (TOC) en de translocon van het binnenste membraan (TIC)2. Verder richt aan de thylakoïde membraan en lumen vindt plaats via de twin arginine translocatie (cpTat)3, de secretoire (cpSec1)4, het signaal erkenning deeltje (cpSRP)5en de spontane invoeging trajecten6 . Een methode voor de hoog rendement isolatie van fysiologisch actief chloroplasten en thylakoïde membranen is nodig voor het meten van de energetics en kinetiek van een translocatie-evenement, om te begrijpen van de mechanismen van de divers vervoer in elk traject, en te lokaliseren een bepaalde eiwitten substraat van belang zijn voor een van de zes verschillende compartimenten van de chloroplast.
Het isolement van de membranen van de chloroplast biedt beter experimentele controle over omgevingsfactoren (zoals zout en substraat concentraties, de aanwezigheid van ATP/GTP en pH-omstandigheden) die invloed hebben op de waardering van vervoer energetics en kinetiek. Deze in vitro -omgeving leent zich voor de verkenning van mechanistische details voor translocatie om dezelfde redenen. Bovendien, terwijl Voorspellende software voor lokalisatie van chloroplast eiwitten verbeterd7,8, bieden in vitro vervoer testen een snellere methode voor bevestiging over microscopie gebaseerde fluorescerende testen die vereisen een genetisch gecodeerde fluorescerende tag, plant transformatie en/of specifieke antilichamen. Hier presenteren we protocollen voor chloroplast en thylakoïde isolatie van erwten (Pisum sativum), alsmede voor vervoer assays geoptimaliseerd voor elk van de energie-afhankelijke thylakoïde translocatie trajecten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1936px;" width="1936">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Pisum sativum seeds</td>
			<td style="width:252px;">Seedway LLC, Hall, NY</td>
			<td style="width:292px;">8686 - Little Marvel</td>
			<td style="width:1068px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, Gibbstown, NJ</td>
			<td>475855-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">80% Acetone</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blender with sharpened blades</td>
			<td>Waring Commercial</td>
			<td>BB155S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polytron 10-35</td>
			<td>Fischer Sci</td>
			<td>13-874-617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>GE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beckman J2-MC with JA 20 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>8043-30-1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall RC-5B with HB-4 rotor</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>8327-30-1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>12/3/83</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM MgATP in 1xIB</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>74804-12-9</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermolysin in 1xIB (2mg/mL)</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>9073-78-3</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K-Tricine</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorbitol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>50-70-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manganese Chloride</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>13446-34-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays

Chloroplasten zijn de organellen in groene planten verantwoordelijk voor de uitvoering van talrijke onontbeerlijke metabolische pathways, vooral fotosynthese. Binnen de chloroplasten, het thylakoïde membraan systeem herbergt alle de fotosynthetische pigmenten, reactie center complexen en het merendeel van de elektron-vervoerders, en is verantwoordelijk voor de licht-afhankelijke ATP-synthese. Meer dan 90% van chloroplast eiwitten zijn gecodeerd in de kern, vertaald in het cytosol en vervolgens geïmporteerd in de chloroplast. Verdere eiwit vervoer in of over het membraan thylakoïde maakt gebruik van een van de vier trajecten van de translocatie. Hier beschrijven we een hoog rendement methode voor isolatie van vervoer-bevoegde ze uit erwten (Pisum sativum), samen met vervoer testen door middel van de drie energie-afhankelijke cpTat, cpSec1 en cpSRP-gemedieerde trajecten. Deze methoden kunnen experimenten met betrekking tot thylakoïde eiwit lokalisatie, vervoer energetics en de mechanismen van de translocatie van de eiwitten in biologische membranen.

Om te meten de hoeveelheid substraat met succes vervoerd, is het nuttig om één of meer "percentage input" rijstroken. Voor de gegevens hieronder, werd 10% van de reactie van de uiteindelijke vervoer zonder ze gebruikt. Deze "percentage input" helpt ook om het visualiseren van de grootte van het substraat voorloper. Het percentage vertegenwoordigt van een bekende, omschreven hoeveelheid substraat waarmee op vergelijk vervoerd ondergrond tegen en omhoog of omlaag kan worden geschaald als ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays at JoVE.com

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolatie van fysiologisch actief thylakoiden en hun gebruik in energie-afhankelijke proteÃ¯ne vervoer Assays

Wij presenteren protocollen hierin voor hoog rendement isolatie van fysiologisch actief ze en eiwit vervoer testen voor de chloroplast twin arginine translocatie (cpTat), secretoire (cpSec1) en signaal erkenning deeltje (cpSRP) trajecten.

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot de mechanismen en energetische stoffen van eiwittransport over chloroplast membranen, evenals de locatie van eiwitten binnen plastiden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek voor thylakoïde eiwittargeting is dat het volledige controle over de omgeving van de thylakoïde tijdens het transport mogelijk maakt, inclusief temperatuur, pH, ionische omstandigheden en precursorconcentraties. Begin met het weken van ongeveer 55 gram erwten in 400 milliliter gedestilleerd water gedurende drie uur.Zaai de geweekte erwten in een plastic bak in de grond, bedekt met een dun laagje vermiculiet, en groeien gedurende negen tot 15 dagen zoals beschreven in het tekstprotocol. Bereid op de dag van de chloroplast-isolatie een continu dichtheidsgradiënt voor door een mengsel van 15 milliliter Percoll en 15 milliliter 2xGB buffer in een 15 milliliter polycarbonaat hoge snelheid centrifuge buis te centrifugeren bij 30, 900 gs in een vaste rotorhoek gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius met de rem uit. Oogst dan ongeveer 25 gram van negen tot 15 dagen oude erwt scheuten.Voeg ze toe aan 95 milliliter koude 1xGB buffer in een gekoelde blender, met geslepen messen. En homogeniseren. Filtreer dit mengsel door minimaal twee lagen kaasdoek, geplaatst in een trechter over een gekoeld bekerglas.Centrifugeer het filtraat met behulp van een 15 milliliter polycarbonaatcentrifugebuis in een swingende emmerrotor op 3.000 gs gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en gebruik een penseel om de pellet voorzichtig opnieuw op te hoogten in één milliliter van 1xGB. Gebruik daarna een glazen houding pipet om de schermophanging voorzichtig op de top van de Percoll-helling te leggen.Centrifuge het in een swingende emmer rotor op 8,000 gs gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius met de rem uit. Met behulp van een houding pipet opnieuw zorgvuldig overbrengen van de onderste groene band met intacte chloroplasten in een verse 50 milliliter polycarbonaat buis en voeg 30 milliliter van 1xIB buffer. Centrifuge de buis in een swingende emmerrotor op 1, 800 gs gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Na het weggooien van de supernatant, voorzichtig resuspend de pellet in een milliliter van 1xIB met een penseel. Was in 30 milliliter 1xIB en centrifuge opnieuw onder dezelfde omstandigheden. Resuspend de pellet na de laatste centrifugatie in een milliliter van 1xIB.Om de chlorofylconcentratie te bepalen, meng 10 microliter volledig geresuspendedchloroplasten met vijf milliliter van 80%-aceton. Filtreer door een 180 micrometer dik filterpapier met 11 micrometer poriegrootte en bepaal vervolgens de chlorofylconcentratie met spectrofotometer. Verdun het chloroplastmengsel tot één milligram per milliliter met koude 1xIB.Om te beginnen met het isoleren van de thylakoïden wanneer stromal extract niet nodig is, zoals cpTat transport, centrifuge intacte chloroplasten in 1,5 milliliter buizen in een swingende emmer rotor op 1, 000 gs bij vier graden Celsius gedurende zes minuten. Daarna, gooi de supernatant en resuspend de pellet in hypotonische lyse buffer om een milligram per milliliter te bereiken met een micropipet. Incubeer op ijs in het donker met af en toe mengen gedurende 10 minuten.Om thylokoïden terug te krijgen, centrifuge in een swingende emmerrotor op 3, 200 gs bij vier graden Celsius gedurende acht minuten. Was de thylokoïden twee maal door de pellet opnieuw uit te stellen met één tot twee milliliter lysisbuffer en vervolgens onder dezelfde omstandigheden te centrifugeren. Na de laatste centrifugatie, resuspend de pellet, in een milliliter van 1xIB buffer en bepalen van de chlorofyl concentratie in geïsoleerde thylokoïden met behulp van een spectrofotometer zoals eerder aangetoond.Voor trajecten die stromale extractterugwinning vereisen, zoals CPSec1 en CPSRP, 600 microliter van geïsoleerde chloroplasten in een swingende emmerrotor en centrifuge op 1.000 gs gedurende zes minuten bij vier graden Celsius. Voor chloroplast lyse schorten we de pellet op met 600 microliters hypotonische lysebuffer. Incubeer op ijs in het donker gedurende 10 minuten met af en toe mengen.Dan centrifugeren de buizen in een swingende emmer rotor op 3, 200 gs gedurende acht minuten op vier graden Celsius. Om de stroma te redden, breng het lichtgroen naar gele supernatant naar een nieuwe micro centrifuge buis en voeg een gelijk volume van 2x ruwe stromal buffer. Om thylokoïden te wassen, voeg twee volumes lysebuffer en centrifuge toe op 3, 200 gs gedurende acht minuten bij vier graden Celsius.Resuspend de pellet in 1xIB om chlorofyl concentratie van een milligram per milliliter te bereiken en gereserveerd op ijs voor later gebruik in het vervoer testen. Verwijder restmembranen uit ruwe stroma door de verdunde ruwe stroma in een vaste hoekrotor van 42.000 gs gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius te centrifugeren. Verzamel vervolgens 95% van het volume van elke buis om ervoor te zorgen dat de kleine geelgroene pellet niet wordt verstoord, terwijl het volume van elke buis wordt opgevangen.Om het geconcentreerde stromale extract voor te bereiden, pool de verzamelde supernatants. Gebruik vervolgens een vier milliliter 30 kilodalton moleculair gewicht cut-off concentrator om het extract vijf keer te concentreren. Om te testen het cpTat-transport in een buis van 1,5 milliliter op ijs meng de geïsoleerde thylokoïden tot een uiteindelijke chlorofylconcentratie van 0,33 milligram per milliliter, vijf millimolar ATP bereid in 1xIB en acht millimolar DTT bereid in 1xIB.Om het transport te starten, introduceert u substraateiwit in de transportmix. Voer de reactie door het verlichten van de schorsing met 80 tot 100 microeinsteins per vierkante meter per seconde van fotosynthetisch actieve straling gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Om de transportreactie te stoppen, verdun de vering acht maal met ijskoude 1xIB.Centrifuge bij 3, 200 gs in een microcentrifuge gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius om thylokoïden te herstellen. Na het weggooien van de supernatant, resuspend de pellet in 120 microliters van ijskoud 1xIB. Om te testen de CPSec1 of PSRP trajecten mengen de volgende in een 1,5 milliliter buis op ijs.Thylakoïden tot een uiteindelijke chlorofylconcentratie van 0,33 milligram per milliliter, 0,83 milligram per milliliter chlorofylequivalenten van stromal extract en vijf millimolar ATP bereid in 1xIBx. Breng de reactie tot het gewenste volume met ijskoude 1xIB en broed gedurende 10 minuten op het ijs. Om het transport te starten introduceert u 10% volume aan substraateiwit in deze transportmix.Verlicht met 80 tot 100 microeinsteins per vierkante meter per seconde van fotosynthetisch actieve straling gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Om de reactie te stoppen, verdun de vering acht keer met ijskoude 1xIB. Centrifuge op 3, 200gs in een microcentrifuge gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Na het weggooien van de supernatant, resuspend de pellet in 120 microliters van ijskoud 1xIB. Om restsubstraat te verwijderen dat niet is vervoerd, verteer je uitwendige eiwitten door zes microliter van twee milligram per milliliter thermolysine en 10 millimolar calciumchloride in 1xIB toe te voegen. Broed deze protease reactie op ijs gedurende 40 minuten.Blus de protease door het volume te verdubbelen met 25 millimolar EDTA in 1xIB. Centrifuge bij 3, 200 gs in een microcentrifuge gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius om thylokoïden te herstellen. Na het verwijderen van de supernatant, resuspend herstelde thylokoïden in 120 microliter van vijf milimolar EDTA in 1xIB, en over te dragen aan een nieuwe 1,5 milliliter buis.Na het centrifugeren opnieuw bij 3, 200 gs in een microcentrifuge gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius, gooi je de supernatant weg en verleg je de pellet in een passend volume laemmli monsterbuffer, aangevuld met 10 millimolar EDTA. Plaats de monsters 10 minuten in een kokend waterbad. Ga verder met het analyseren van de monsters op SDS-pagina.Transport van iOE17 eiwit via de cpTat route resulteerde in een grootte verschuiving van twee tot drie kilodaltons tussen het geïntroduceerde substraat en de volwassen verwerkte vorm. Dit is te wijten aan decolleté van het n terminal signaal peptide wat wijst op een succesvolle cpTat transport. Thermolysine behandeling laat alleen de met succes vervoerde en dus proteus resistente volwassen band.Transport van OE33 voorloper via de CPSec1 route, resulteerde in een grootte verschuiving in de volwassen substraat, en proteus bescherming van het getransporteerde substraat. Het inbrengen van LHCP-precursor in het thylokoïde membraan via het cpSRP-traject, geëvalueerd door thermolysin spijsvertering, leidde tot een grootteverschuiving van 1,5 tot twee kilodaltonen. Dit duidde op succesvolle membraaninbrengen, omdat het membraan de ooms van volwassen LHCP afbraakproduct beschermt tegen volledige proteolyse.Na het bekijken van deze video moet je een goed begrip van hoe thylokoids te isoleren en test tranportiviteit door de energie afhankelijke cpTat, cpSec 1 en cpSRP trajecten. Eenmaal onder de knie deze techniek kan worden gedaan in drie tot vier uur wanneer goed uitgevoerd. Hoewel niet geïllustreerd in deze video houden we over het algemeen de overhead lichten uit in het lab bij het isoleren en werken met fotosynthetisch actieve chloroplasten en thylakoïden.Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om geïsoleerde chloroplast en thylakoïden te houden op vier graden Celsius. Vergeet niet om chloroplasten voorzichtig te resuspend in het begin. Vermijd het verstoren van de Procoll gradiënt na de eerste centrifucation stap.Bovendien kan procent invoermonster parallel met de transportreacties worden bereid en op dezelfde gel worden uitgevoerd om het substraattransport te schatten. Vergeet niet, dat het werken met radioactieve substraten vereist gewetensvolle behandeling en een goede PPE. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van eiwittargeting om de energetica, kinetiek en unieke mechanismen voor eiwittransport over thylakoïde membranen te verkennen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Een efficiënte methode voor het isoleren van zeer gezuiverde RNA uit zaden voor gebruik in Quantitative Analysis Transcriptome

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Synthese van 1,2-Azaborines en de voorbereiding van hun eiwitcomplexen met T4 lysozym Mutanten

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analyse van supercomplexen van de Mitochondrial Electron Transport Chain met Native Electrophoresis, In-gel Assays, en Electroelution

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolatie en respiratoire metingen van Mitochondria van Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteoom analyse van Context-specifieke eiwitcomplexen in hun inheemse cellulaire omgeving

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Gebruik van recombinante Fusion eiwitten in een fluorescerende Protease Assay Platform en hun In-gel renaturatie

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse van de vouwing van eiwitten, vervoer en afbraak in levende cellen door radioactieve Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

In vitro Ubiquitination en Deubiquitinisatie assays van Nucleosomale histonen

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Toepassing van Biolayer interferometrie (BLI) voor het bestuderen van eiwit-eiwit interacties in transcriptie

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...