Name: isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays
Uploaded: 2018-09-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays at JoVE.com

Dieses Manuskript wurde mit finanzieller Unterstützung durch die Abteilung von Chemie, Geowissenschaften und Biosciences, 408 Büro der Grundlagenwissenschaften Energie an das US Department of Energy durch Grant DE-SC0017035 vorbereitet

1. erste Materialien
<ol><li>Ca. 55 g Erbsen für 3 Stunden in 400 mL destilliertem Wasser einweichen und dann säen in einem Plastikbehälter (35 cm x 20 cm x 6 cm) im Boden mit dünnen Schicht von Vermiculit bedeckt.</li>
	<li>Wachsen Sie das Tablett mit Erbsen bei 20 ° C unter 12/12 h hell/dunkel (50 µE/m2s)-Zyklus für 9 bis 15 Tage.</li>
	<li>Bereiten Sie Protein Substrat nach eine bevorzugte Methode. Hinweis: Haben wir Protein Substrate mit einer Vielzahl von Methoden, einschließlich 1) in-vi...

<ol>
	<li>Ellis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+protein+synthesis:+principles+and+problems.">Chloroplast protein synthesis: principles and problems.</a> Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).</li><li>Li, H. -. m., Chiu, C. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+transport+into+chloroplasts.">Protein transport into chloroplasts.</a> Annual review of plant biology. 61, (2010).</li><li>Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-specific+energy+requirements+for+protein+transport+across+or+into+thylakoid+membranes.+Two+lumenal+proteins+are+transported+in+the+absence+of+ATP.">Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).</li><li>Skalitzky, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastids+contain+a+second+sec+translocase+system+with+essential+functions.">Plastids contain a second sec translocase system with essential functions.</a> Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).</li><li>Dabney-Smith, C., Storm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plastid Biology. , 271-289 (2014).</li><li>Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+&amp;#34;assisted&amp;#34;+and+&amp;#34;spontaneous&amp;#34;+mechanisms+for+the+insertion+of+polytopic+chlorophyll-binding+proteins+into+the+thylakoid+membrane.">Distinct &amp;#34;assisted&amp;#34; and &amp;#34;spontaneous&amp;#34; mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).</li><li>Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. h. l. o. r. o. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChloroP,+a+neural+network-based+method+for+predicting+chloroplast+transit+peptides+and+their+cleavage+sites.">ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites.</a> Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).</li><li>Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locating+proteins+in+the+cell+using+TargetP,+SignalP+and+related+tools.">Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools.</a> Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).</li><li>Ling, Q., Jarvis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants.">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).</li><li>Lo, S. M., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Photosynthesis Research Protocols. , 139-157 (2011).</li><li>Vernon, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+chlorophylls+and+pheophytins+in+plant+extracts.">Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts.</a> Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).</li><li>Knott, T. G., Robinson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secA+inhibitor,+azide,+reversibly+blocks+the+translocation+of+a+subset+of+proteins+across+the+chloroplast+thylakoid+membrane.">The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).</li><li>Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SecA+homolog+in+protein+transport+within+chloroplasts:+evidence+for+endosymbiont-derived+sorting.">SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting.</a> Science. 266 (5186), 796-798 (1994).</li><li>Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+cDNA+for+pea+chloroplast+SecA+Evolutionary+conservation+of+the+bacterial-type+SecA-dependent+protein+transport+within+chloroplasts.">Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts.</a> FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).</li><li>Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-assisted+post-translational+transport+of+plastidic+type+I+signal+peptidase+1.">Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).</li><li>Luirink, J., Sinning, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRP-mediated+protein+targeting:+structure+and+function+revisited.">SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).</li><li>Yuan, J., Henry, R., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+factor+plays+an+essential+role+in+protein+integration+into+thylakoids+that+cannot+be+replaced+by+unfolding+or+by+heat+shock+protein.">Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein.</a> Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).</li><li>Tjalsma, H., van Dijl, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+consensus+prediction+of+protein+retention+in+a+bacterial+membrane.">Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane.</a> Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).</li><li>Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Facile+Reporter+System+for+the+Experimental+Identification+of+Twin-Arginine+Translocation+(Tat)+Signal+Peptides+from+All+Kingdoms+of+Life.">A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life.</a> Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).</li><li>Yuan, J., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastocyanin+and+the+33-kDa+subunit+of+the+oxygen-evolving+complex+are+transported+into+thylakoids+with+similar+requirements+as+predicted+from+pathway+specificity.">Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).</li><li>Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., B&#252;chel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transversal+and+lateral+exciton+energy+transfer+in+grana+thylakoids+of+spinach.">Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach.</a> Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).</li><li>Frielingsdorf, S., Jakob, M., Kl&#246;sgen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+pool+of+TatA+promotes+Tat-dependent+protein+transport+across+the+thylakoid+membrane.">A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).</li><li>Tu, C. -. J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+FtsY,+chloroplast+signal+recognition+particle,+and+GTP+are+required+to+reconstitute+the+soluble+phase+of+light-harvesting+chlorophyll+protein+transport+into+thylakoid+membranes.">Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).</li></ol>

Chloroplasten und Thylakoidmembran isolation
Übermäßiger Bruch führt in armen Chloroplasten Isolierung und damit schlechte Thylakoidmembran nach Trennung im Verlauf ergeben. Es empfiehlt sich, die geerntete Gewebe sanft zu homogenisieren, indem sichergestellt wird, dass sämtliches Material eingetaucht ist, vor dem Mischen und pulsieren in 15 s Zyklen bis vollständig homogenisiert. Verwenden Sie ggf. mehrere kürzere Runden mit weniger Gewebe in jeder Runde.
Kühl...

Fast alle die proteinhaltige Maschinen verantwortlich für die ordnungsgemäße Chloroplasten Funktion muss aus dem Zytosol1umgesiedelt werden. Die Chloroplasten-Umschläge sind Protein Substrate durch das Translocon der äußeren Membran (TOC) und die Translocon der inneren Membran (TIC)2eingeführt. Weitere Ausrichtung auf die Thylakoidmembran erfolgt Membran und Lumen durch Twin Arginin Translokation (CpTat)3, die sekretorischen (cpSec1)4, Signal Anerkennung Teilchen (CpSRP)5, und die spontane Aufnahme Wege6 . Eine Methode für die High Yield Isolierung der physiologisch aktiven Chloroplasten und der Thylakoidmembran Membranen ist notwendig zur Messung der Energetik und Kinetik einer Translokation Veranstaltung, zu die vielfältigen Transportmechanismen in jeder Weg zu verstehen und zu lokalisieren eine bestimmtes Protein Substrat für eines der sechs verschiedene Fächer der Chloroplasten von Interesse.
Die Isolation der Membranen aus den Chloroplasten bietet bessere experimentelle Kontrolle über Umweltfaktoren (z. B. Salz und Substrat-Konzentrationen, die Anwesenheit von ATP/GTP und pH-Bedingungen), die die Messung der Transport Energetik zu beeinflussen und Kinetik. Dieser in-vitro- Umgebung eignet sich für die Erforschung der mechanistischen Details der Translokation aus den gleichen Gründen. Darüber hinaus während predictive Software für die Lokalisierung der Chloroplasten Proteine7,8verbessert hat, bieten in-vitro- Transport-Assays einer schnelleren Methode zur Bestätigung über Mikroskopie-basierte fluoreszierenden Proben, die erfordern Sie eine genetisch codierte fluoreszierende Tag, Pflanzentransformation und/oder spezifische Antikörper. Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle für Chloroplasten und Thylakoidmembran Isolationen von Erbsen (Pisum Sativum), sowie für Transport-Assays für jeden der die ENERGIEABHÄNGIGE Thylakoidmembran Translokation Wege optimiert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1936px;" width="1936">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Pisum sativum seeds</td>
			<td style="width:252px;">Seedway LLC, Hall, NY</td>
			<td style="width:292px;">8686 - Little Marvel</td>
			<td style="width:1068px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, Gibbstown, NJ</td>
			<td>475855-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">80% Acetone</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blender with sharpened blades</td>
			<td>Waring Commercial</td>
			<td>BB155S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polytron 10-35</td>
			<td>Fischer Sci</td>
			<td>13-874-617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>GE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beckman J2-MC with JA 20 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>8043-30-1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall RC-5B with HB-4 rotor</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>8327-30-1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>12/3/83</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM MgATP in 1xIB</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>74804-12-9</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermolysin in 1xIB (2mg/mL)</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>9073-78-3</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K-Tricine</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorbitol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>50-70-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manganese Chloride</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>13446-34-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays

Chloroplasten sind die Organellen in grünen Pflanzen verantwortlich für zahlreiche wichtige Stoffwechselwege, die vor allem Photosynthese. Innerhalb der Chloroplasten der Thylakoidmembran-Membran-System beherbergt die photosynthetische Pigmente, Reaktion-Zentrum-komplexe und die meisten der Elektron-Träger, und ist verantwortlich für Licht-abhängige ATP-Synthese. Über 90 % der Chloroplasten Proteine sind im Zellkern codiert, übersetzt in die Zellflüssigkeit und anschließend in die Chloroplasten importiert. Protein-Weitertransport in oder über der Thylakoidmembran Membran nutzt eine der vier Translokation Wege. Hier beschreiben wir eine hochverzinsliche Methode zur Isolierung von Transport-kompetente Thylakoids aus Erbsen (Pisum Sativum), zusammen mit Transport-Assays durch drei Energie-abhängige CpTat, cpSec1 und CpSRP-vermittelten Signalwege. Diese Methoden ermöglichen Experimente bezüglich Thylakoidmembran Protein Lokalisierung, Transport-Energetik und die Mechanismen der Protein Translokation über biologische Membranen.

Um erfolgreich transportiert Substratmenge einschätzen zu können, ist es sinnvoll, einen oder mehrere "prozentuale Eingabe" Bahnen gehören. Für die unten dargestellten Daten wurde 10 % des endgültigen Transportreaktion ohne Thylakoids verwendet. Diese "prozentuale Eingabe" hilft auch, um die Größe des Substrats Vorläufer zu visualisieren. Der Prozentsatz ist eine bekannte und definierte Menge an Substrat mit denen zu vergleichen, die transportiert Substrat gegen und kann skaliert ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays at JoVE.com

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und deren Einsatz in Energie-abhängige Protein Transport Assays

Wir präsentieren Protokolle hierin für High Yield Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und Protein Transport Assays für die Chloroplasten Twin Arginin Translokation (CpTat), sekretorische (cpSec1) und Signalwege Anerkennung Teilchen (CpSRP).

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen bezüglich der Mechanismen und Energetik des Proteintransports über Chloroplastmembranen sowie die Lage von Proteinen in Plastiden zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik für Thylakoid-Protein-Targeting ist, dass es eine vollständige Kontrolle der Umgebung des Thylakoids während des Transports ermöglicht, einschließlich Temperatur, pH, ionische Bedingungen und Vorläuferkonzentrationen. Beginnen Sie mit dem Einweichen von etwa 55 Gramm Erbsen in 400 Milliliter destilliertes Wasser für drei Stunden.Die durchnässten Erbsen in einer Plastikschale im Boden säen, mit einer dünnen Schicht Vermiculit bedeckt, und wachsen für neun bis 15 Tage, wie im Textprotokoll beschrieben. Am Tag der Chloroplastenisolierung einen kontinuierlichen Dichtegradienten vorbereiten, indem Sie ein Gemisch aus 15 Milliliter Percoll und 15 Milliliter 2xGB Puffer in einem 15 Milliliter Polykarbonat-Hochgeschwindigkeitszentrifugenrohr bei 30, 900 g in einem festwinkeligen Rotor für 30 Minuten bei vier Grad Celsius mit abbremsendem Abstand zentrifugieren. Dann ernten Sie etwa 25 Gramm von neun bis 15 Tage alten Erbsentrieben.Fügen Sie sie zu 95 Milliliter kalten 1xGB Puffer in einem gekühlten Mixer, mit geschärften Klingen. Und homogenisieren. Filtern Sie diese Mischung durch mindestens zwei Schichten Käsetuch, in einem Trichter über einem gekühlten Becher gelegt.Zentrifugieren Sie das Filtrat mit einem 15 Milliliter Polycarbonat Zentrifugenrohr in einem schwingenden Schaufelrotor bei 3.000 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und verwenden Sie einen Pinsel, um das Pellet vorsichtig in einem Milliliter 1xGB wieder aufzuhängen. Danach verwenden Sie eine GlashaltungPipette, um die Bildschirmaufhängung vorsichtig auf dem Percoll-Gradienten zu schichten.Zentrifugieren Sie ihn in einem schwingenden Schaufelrotor bei 8 000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius mit abbremsender Bremse. Mit einer Haltungspipette wieder vorsichtig das untere grüne Band mit intakten Chloroplasten in ein frisches 50 Milliliter Polycarbonat-Rohr übertragen und 30 Milliliter 1xIB Puffer hinzufügen. Zentrifugieren Sie das Rohr in einem schwingenden Schaufelrotor bei 1 800 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Nach dem Wegwerfen des Überstandes das Pellet vorsichtig in einem Milliliter 1xIB mit einem Pinsel wieder aufsetzen. 30 Milliliter 1xIB und Zentrifuge unter den gleichen Bedingungen wieder einwaschen. Setzen Sie das Pellet nach der letzten Zentrifugation in einem Milliliter 1xIB wieder aus.Um die Chlorophyllkonzentration zu bestimmen, mischen Sie 10 Mikroliter vollständig resuspendierter Chloroplasten mit fünf Millilitern 80%Aceton. Filtern Sie ein 180 Mikrometer dickes Filterpapier mit 11 Mikrometer Porengröße und bestimmen Sie dann die Chlorophyllkonzentration per Spektralphotometer. Das Chloroplastengemisch mit kaltem 1xIB auf ein Milligramm pro Milliliter verdünnen.Um die Thylakoide zu isolieren, wenn stromalextrakt nicht notwendig ist, wie cpTat Transport, Zentrifuge intakte Chloroplasten in 1,5 Milliliter-Rohren in einem schwingenden Schaufelrotor bei 1.000 g bei vier Grad Celsius für sechs Minuten. Danach entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet im hypotonischen Lysepuffer wieder auf, um mit einer Mikropipette ein Milligramm pro Milliliter zu erreichen. Inkubieren Sie auf Eis im Dunkeln mit gelegentlichem Mischen für 10 Minuten.Um Thylokoide zu bergen, zentrieren Sie in einem schwingenden Schaufelrotor bei 3, 200 g bei vier Grad Celsius für acht Minuten. Waschen Sie die Thylokoide zweimal, indem Sie das Pellet mit einem bis zwei MilliliterLysepuffer wieder aufhängen und dann unter den gleichen Bedingungen zentrifugieren. Nach der letzten Zentrifugation das Pellet in einem Milliliter 1xIB-Puffer wieder aufsetzen und die Chlorophyllkonzentration in isolierten Thylokoiden mit einem Spektralphotometer bestimmen, wie zuvor gezeigt.Für Wege, die eine stromale Extraktrückgewinnung erfordern, wie CPSec1 und CPSRP, entsetzen 600 Mikroliter isolierter Chloroplasten in einem schwingenden Schaufelrotor und Zentrifuge bei 1.000 g für sechs Minuten bei vier Grad Celsius. Bei der Chloroplastenlyse setzen wir das Pellet mit 600 Mikroliter hypotonischen Lysepuffer aus. 10 Minuten lang im Dunkeln mit gelegentlichem Mischen auf Eis bebrüten.Dann zentrieren Sie die Rohre in einem schwingenden Schaufelrotor bei 3, 200 g für acht Minuten bei vier Grad Celsius. Um den Stroma zu speichern, übertragen Sie den hellgrünen auf gelben Überstand auf ein neues Mikrozentrifugenrohr und fügen Sie ein gleiches Volumen von 2x rohen Stromalpuffer hinzu. Um Thylokoide zu waschen, fügen Sie zwei Volumina Lysepuffer und Zentrifuge bei 3, 200 g für acht Minuten bei vier Grad Celsius hinzu.Setzen Sie das Pellet in 1xIB wieder auf, um eine Chlorophyllkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter zu erreichen, und legen Sie es für die spätere Verwendung in Transporttests auf Eis beiseite. Restmembranen aus Rohstroma entfernen, indem Sie den verdünnten Rohstroma in einem festen Winkelrotor bei 42 000 g 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrieren. Dann sammeln Sie 95% des Volumens aus jedem Rohr, um sicherzustellen, dass das kleine gelbe grüne Pellet nicht gestört wird, während Sie das Volumen aus jedem Rohr notieren.Um den konzentrierten Stromalextrakt vorzubereiten, bündeln Sie die gesammelten Überstande. Verwenden Sie dann einen vier Milliliter 30 Kilodalton Molekulargewichts-Cut-off-Konzentrator, um den Extrakt fünffach zu konzentrieren. Um den cpTat-Transport in einer 1,5-Milliliter-Röhre auf Eis zu prüfen, mischen Sie die isolierten Thylokoide zu einer endgültigen Chlorophyllkonzentration von 0,33 Milligramm pro Milliliter, fünf Millimolar ATP in 1xIB und acht Millimolaren DTT in 1xIB.Um den Transport zu initiieren, führen Sie Substratprotein in den Transportmix ein. Führen Sie die Reaktion durch Beleuchtung der Suspension mit 80 bis 100 Mikroeinsteinen pro Quadratmeter pro Sekunde photosynthetisch aktiver Strahlung für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Um die Transportreaktion zu stoppen, verdünnen Sie die Suspension achtfach mit eiskaltem 1xIB.Zentrifuge bei 3, 200 g in einer Mikrozentrifuge für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um Thylokoide zurückzugewinnen. Nach dem Wegwerfen des Überstandes das Pellet in 120 Mikrolitereiseis 1xIB wieder aufsetzen. Um die CPSec1- oder PSRP-Wege zu assayen, mischen Sie Folgendes in einer 1,5-Milliliter-Röhre auf Eis.Thylakoide auf eine endgültige Chlorophyllkonzentration von 0,33 Milligramm pro Milliliter, 0,83 Milligramm pro Milliliter Chlorophylläquivalente stromalen Extrakt und fünf Millimolar ATP in 1xIB hergestellt. Bringen Sie die Reaktion auf das gewünschte Volumen mit eiskaltem 1xIB und inkubieren Sie auf Eis für 10 Minuten. Um den Transport zu initiieren, führen Sie 10% Volumenvolumen von Substratprotein in diesen Transportmix ein.Beleuchten Sie mit 80 bis 100 Mikroeinsteinen pro Quadratmeter pro Sekunde photosynthetisch aktiver Strahlung 10 Minuten bei Raumtemperatur. Um die Reaktion zu stoppen, verdünnen Sie die Suspension achtfach mit eiskalt 1xIB. Zentrifuge bei 3, 200g in einer Mikrozentrifuge für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Nach dem Wegwerfen des Überstandes das Pellet in 120 Mikrolitereiseis 1xIB wieder aufsetzen. Um Restsubstrat zu entfernen, das nicht transportiert wurde, verdauen Sie externes Protein, indem Sie sechs Mikroliter mit zwei Milligramm pro Milliliter Thermolysin und 10 Millimolar Calciumchlorid in 1xIB hinzufügen. Inkubieren Sie diese Protease-Reaktion auf Eis für 40 Minuten.Quench die Protease durch Verdoppelung des Volumens mit 25 Millimolar EDTA in 1xIB. Zentrifuge bei 3, 200 g in einer Mikrozentrifuge für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um Thylokoide zurückzugewinnen. Nach dem Entfernen des Überstandes, wiederaufenthalten wiedergewonnene Thylokoide in 120 Mikroliter von fünf milimolaren EDTA in 1xIB, und übertragen sie auf eine neue 1,5 Milliliter-Röhre.Nach der zentrifugieren den Überstand wieder bei 3, 200 g in einer Mikrozentrifuge für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem entsprechenden Volumen laemmli Probenpuffer, ergänzt mit 10 Millimolar EDTA, wieder auf. Legen Sie die Proben 10 Minuten in ein kochendes Wasserbad. Analysieren Sie die Beispiele nach SDS-Seite.Der Transport von iOE17-Protein durch den cpTat-Weg führte zu einer Größenverschiebung von zwei bis drei Kilodaltonen zwischen dem eingeführten Substrat und der ausgereiften verarbeiteten Form. Dies ist auf die Spaltung des n-Klemmensignalpeptids zurückzuführen, das auf einen erfolgreichen cpTat-Transport hinweist. Die Thermolysinbehandlung hinterlässt nur das erfolgreich transportierte und damit proteusresistente reife Band.Der Transport des OE33-Vorläufers durch den CPSec1-Weg führte zu einer Größenverschiebung des ausgereiften Substrats und zum Proteusschutz des transportierten Substrats. Die Einfügung des LHCP-Vorläufers in die Thylokoid-Membran über den cpSRP-Signalweg, der durch Thermolysinverdauung ausgewertet wurde, führte zu einer Größenverschiebung von 1,5 bis zwei Kilodaltonen. Dies deutete auf eine erfolgreiche Membraneinfügung hin, da die Membran das Uncleaved des reifen LHCP-Abbauprodukts vor einer vollständigen Proteolyse schützt.Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Thylokoide isolieren und die Tranportivität durch die energieabhängigen cpTat-, cpSec 1- und cpSRP-Pfade isolieren können. Einmal gemeistert kann diese Technik in drei bis vier Stunden durchgeführt werden, wenn richtig durchgeführt. Obwohl in diesem Video nicht dargestellt, halten wir die Oberlichter im Labor in der Regel aus, wenn wir mit photosynthetisch aktiven Chloroplasten und Thylakoiden arbeiten.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, isolierte Chloroplasten und Thylakoide bei vier Grad Celsius zu halten. Denken Sie daran, Chloroplasten am Anfang sanft wieder auszusetzen. Vermeiden Sie es, den Procoll-Gradienten nach dem ersten Zentriumierungsschritt zu stören.Zusätzlich kann eine prozentuale Eingangsprobe parallel zu den Transportreaktionen vorbereitet werden und auf demselben Gel ausgeführt werden, um den Substrattransport abzuschätzen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit radioaktiven Substraten eine gewissenhafte Handhabung und eine ordnungsgemäße PSA erfordert. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Protein-Targeting, um die Energetik, Kinetik und einzigartige Mechanismen für den Proteintransport über Thylakoid-Membranen zu erforschen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Eine effiziente Methode zur Isolierung von Highly Purified RNA aus Samen für die Verwendung in Quantitative Transkriptomanalyse

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Forschung

Biochemie

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Synthese von 1,2-Azaborines und die Vorbereitung ihrer Proteinkomplexe mit T4-Lysozym Mutants

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analysieren von Supercomplexen der mitochondrialen Elektronentransportkette mit Native Elektrophorese, In-Gel-Assays und Elektrolyse

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biochemische und strukturelle Charakterisierung von Kohlenhydrat Transport Substrat-Bindeprotein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation und Atemwege Messungen der Mitochondrien von Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteomic Analyse der kontextspezifischen Proteinkomplexe in ihrer natürlichen zellulären Umgebung

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Einsatz von rekombinanten Fusionsproteinen in eine fluoreszierende Protease-Assay-Plattform und ihre In-Gel-Renaturierung

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse der Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen durch radioaktive Puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

In Vitro Ubiquitination und Deubiquitination Assays von Nucleleosomalhistones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anwendung der Biolayer-Interferometrie (BLI) zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen bei der Transkription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...