Name: isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays
Uploaded: 2018-09-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays at JoVE.com

כתב יד זה הוכן עם מימון על ידי חלוקה של מדעי הכימיה, מדעי החיים, 408 משרד האנרגיה הבסיסית, למדעי לנו מחלקת האנרגיה דרך גרנט דה-SC0017035

1. חומרים הראשונית
<ol><li>להשרות כ- 55 גר' אפונה 3 שעות ב- 400 מ ל מים מזוקקים ולאחר מכן לזרוע מגש פלסטיק (35 ס"מ x 20 ס"מ x 6 ס מ) בקרקע מכוסים בשכבה דקה של ורמיקוליט.</li>
	<li>לגדול המגש של אפונה ב- 20 ° C תחת h 12/12/כהה (50 µE/m s2) מחזור 9 עד 15 ימים.</li>
	<li>להכין לסובסטרט חלבון על פי שיטה מועדפת. הערה: הכנו סובסט?...

<ol>
	<li>Ellis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+protein+synthesis:+principles+and+problems.">Chloroplast protein synthesis: principles and problems.</a> Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).</li><li>Li, H. -. m., Chiu, C. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+transport+into+chloroplasts.">Protein transport into chloroplasts.</a> Annual review of plant biology. 61, (2010).</li><li>Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-specific+energy+requirements+for+protein+transport+across+or+into+thylakoid+membranes.+Two+lumenal+proteins+are+transported+in+the+absence+of+ATP.">Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).</li><li>Skalitzky, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastids+contain+a+second+sec+translocase+system+with+essential+functions.">Plastids contain a second sec translocase system with essential functions.</a> Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).</li><li>Dabney-Smith, C., Storm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plastid Biology. , 271-289 (2014).</li><li>Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+&amp;#34;assisted&amp;#34;+and+&amp;#34;spontaneous&amp;#34;+mechanisms+for+the+insertion+of+polytopic+chlorophyll-binding+proteins+into+the+thylakoid+membrane.">Distinct &amp;#34;assisted&amp;#34; and &amp;#34;spontaneous&amp;#34; mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).</li><li>Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. h. l. o. r. o. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChloroP,+a+neural+network-based+method+for+predicting+chloroplast+transit+peptides+and+their+cleavage+sites.">ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites.</a> Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).</li><li>Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locating+proteins+in+the+cell+using+TargetP,+SignalP+and+related+tools.">Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools.</a> Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).</li><li>Ling, Q., Jarvis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants.">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).</li><li>Lo, S. M., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Photosynthesis Research Protocols. , 139-157 (2011).</li><li>Vernon, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+chlorophylls+and+pheophytins+in+plant+extracts.">Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts.</a> Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).</li><li>Knott, T. G., Robinson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secA+inhibitor,+azide,+reversibly+blocks+the+translocation+of+a+subset+of+proteins+across+the+chloroplast+thylakoid+membrane.">The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).</li><li>Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SecA+homolog+in+protein+transport+within+chloroplasts:+evidence+for+endosymbiont-derived+sorting.">SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting.</a> Science. 266 (5186), 796-798 (1994).</li><li>Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+cDNA+for+pea+chloroplast+SecA+Evolutionary+conservation+of+the+bacterial-type+SecA-dependent+protein+transport+within+chloroplasts.">Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts.</a> FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).</li><li>Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-assisted+post-translational+transport+of+plastidic+type+I+signal+peptidase+1.">Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).</li><li>Luirink, J., Sinning, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRP-mediated+protein+targeting:+structure+and+function+revisited.">SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).</li><li>Yuan, J., Henry, R., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+factor+plays+an+essential+role+in+protein+integration+into+thylakoids+that+cannot+be+replaced+by+unfolding+or+by+heat+shock+protein.">Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein.</a> Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).</li><li>Tjalsma, H., van Dijl, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+consensus+prediction+of+protein+retention+in+a+bacterial+membrane.">Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane.</a> Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).</li><li>Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Facile+Reporter+System+for+the+Experimental+Identification+of+Twin-Arginine+Translocation+(Tat)+Signal+Peptides+from+All+Kingdoms+of+Life.">A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life.</a> Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).</li><li>Yuan, J., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastocyanin+and+the+33-kDa+subunit+of+the+oxygen-evolving+complex+are+transported+into+thylakoids+with+similar+requirements+as+predicted+from+pathway+specificity.">Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).</li><li>Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., B&#252;chel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transversal+and+lateral+exciton+energy+transfer+in+grana+thylakoids+of+spinach.">Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach.</a> Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).</li><li>Frielingsdorf, S., Jakob, M., Kl&#246;sgen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+pool+of+TatA+promotes+Tat-dependent+protein+transport+across+the+thylakoid+membrane.">A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).</li><li>Tu, C. -. J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+FtsY,+chloroplast+signal+recognition+particle,+and+GTP+are+required+to+reconstitute+the+soluble+phase+of+light-harvesting+chlorophyll+protein+transport+into+thylakoid+membranes.">Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).</li></ol>

בידוד כלורופלסט, תילקואיד
שבירה מוגזמת עלולה לגרום ב כלורופלסט המסכן בידוד ובכך תילקואיד המסכן תשואות לאחר ההפרדה במעבר הצבע. מומלץ homogenize את הרקמה שנקטפו בעדינות על-ידי הבטחת כי כל החומר שקוע לפני המיזוג, הפועמים 15 מחזורים s ובודקים באופן מלא. אם יש צורך, להשתמש מספר סיבובים ק...

כמעט את כל המכונות proteinaceous אחראי לתפקוד תקין כלורופלסט חייב להיות translocated מ ה ציטוזול1. על המעטפות כלורופלסט, חלבון סובסטרטים מיובאים דרך את translocon של הממברנה החיצונית (TOC), את translocon של הממברנה הפנימית (טיק)2. המיקוד עוד יותר תילקואיד ממברנה ו לומן מתרחשת דרך טווין ארגינין טרנסלוקציה (cpTat)3, את הפרשה (cpSec1)4, אות זיהוי החלקיקים (cpSRP)5, המסלולים ההכנסה ספונטנית6 . שיטת הבידוד לתפוקה גבוהה של פעילות פיזיולוגית מהכלורופלסט וממברנות תילקואיד יש צורך למדוד את energetics ואת קינטיקה של אירוע רוברטסונית, להבין את מנגנוני ההעברה מגוונים בכל מסלול, וכדי להתאים לשפה לסובסטרט חלבון מסוים מכל ששת התאים ברורים של כלורופלסט עניין.
בידודו של ממברנות של כלורופלסט מציע כדאי ניסיוני שליטה על גורמים סביבתיים (כגון: ריכוזי מלח ואת המצע, הנוכחות של ATP/GTP, ותנאי pH) המשפיעים על המדד של תחבורה energetics, קינטיקה. סביבה זו במבחנה הוא משאיל את עצמו חקר מכניסטית בפרטי רוברטסונית מאותן סיבות. בנוסף, בעוד תוכנה חזוי עבור לוקליזציה של כלורופלסט חלבונים השתפרה7,8, in vitro לקשרי תחבורה מבחני לספק שיטה מהירה יותר עבור אישור על מבחני פלורסנט מבוסס מיקרוסקופיה דורשים תגית פלורסנט מקודדים גנטית, צמח שינוי ו/או נוגדנים ספציפיים. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים ומשום כלורופלסט, תילקואיד של אפונה (אפון השדה), כמו גם עבור מבחני תחבורה ממוטב עבור כל אחד המסלולים רוברטסונית תילקואיד תלויי-אנרגיה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1936px;" width="1936">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Pisum sativum seeds</td>
			<td style="width:252px;">Seedway LLC, Hall, NY</td>
			<td style="width:292px;">8686 - Little Marvel</td>
			<td style="width:1068px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, Gibbstown, NJ</td>
			<td>475855-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">80% Acetone</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blender with sharpened blades</td>
			<td>Waring Commercial</td>
			<td>BB155S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polytron 10-35</td>
			<td>Fischer Sci</td>
			<td>13-874-617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>GE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beckman J2-MC with JA 20 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>8043-30-1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall RC-5B with HB-4 rotor</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>8327-30-1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>12/3/83</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM MgATP in 1xIB</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>74804-12-9</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermolysin in 1xIB (2mg/mL)</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>9073-78-3</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K-Tricine</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorbitol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>50-70-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manganese Chloride</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>13446-34-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays

מהכלורופלסט הן organelles בצמחים ירוקים אחראי על ביצוע מסלולים מטבוליים חיוניים רבים, ובראשם פוטוסינתזה. בתוך בתורה מהכלורופלסט, מערכת קרום תילקואיד בתים כל הפיגמנטים פוטוסינתטיים, מתחמי מרכז התגובה, ואת רוב נשאי האלקטרונים, אחראי על סינתזת ATP האור תלוי. מעל 90% של כלורופלסט חלבונים מקודד בגרעין, המתורגמת את ציטוזול, לאחר מכן לייבא לתוך כלורופלסט. תחבורה חלבון נוספת או על פני קרום תילקואיד מנצל לאחד ארבעה מסלולים טרנסלוקציה. כאן, אנו מתארים שיטה תשואה גבוהה עבור בידוד של תחבורה-מוסמך thylakoids של אפונה (אפון השדה), יחד עם תחבורה מבחני דרך שלושה תלויי-אנרגיה cpTat, cpSec1, מסלולים בתיווך cpSRP. שיטות אלה מאפשרות ניסויים הקשורים תילקואיד חלבון לוקליזציה תחבורה energetics, המנגנון של טרנסלוקציה של חלבונים על פני מחקר ביולוגי.

כדי לאמוד את כמות המצע הועברו בהצלחה, זה שימושי לכלול נתיבים "אחוז קלט" אחד או יותר. עבור הנתונים שיובאו להלן, שימש 10% התגובה תחבורה הסופי ללא thylakoids. זה "קלט אחוז" גם עוזר להמחיש את גודל המצע מבשר. האחוז מייצג סכום ידוע, הגדרה של המצע עם אשר כדי להשוות מועבר המצע נגד, וניתן לשנ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays at JoVE.com

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

בידוד של פעיל מבחינה פיזיולוגית Thylakoids, השימוש בהם במסגרת מבחני תחבורה אנרגיה תלוית חלבון

אנו מציגים פרוטוקולים בזאת לבידוד לתפוקה גבוהה של פעיל מבחינה פיזיולוגית thylakoids, חלבון מבחני תחבורה עבור רוברטסונית ארגינין טווין כלורופלסט (cpTat), הפרשה (cpSec1), אות זיהוי החלקיקים (cpSRP) מסלולים.

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי המנגנונים והאנרגטיות של הובלת חלבונים על פני קרום כלורופלסט, כמו גם את המיקום של חלבונים בתוך plastids. היתרון העיקרי של טכניקה זו עבור מיקוד חלבון thylakoid הוא שזה מאפשר שליטה מלאה של הסביבה של התילקואיד במהלך ההובלה, כולל טמפרטורה, pH, תנאים יוניים, ריכוזי מבשר. התחל על ידי השריית כ 55 גרם של אפונה ב 400 מיליליטר של מים מזוקקים במשך שלוש שעות.זורעים את האפונה הספוגה במגש פלסטיק באדמה, מכוסים בשכבה דקה של ורמיקוליט, וגדלים במשך תשעה עד 15 ימים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. ביום של בידוד כלורופלסט, להכין שיפוע צפיפות רציפה על ידי צנטריפוגה תערובת של 15 מיליליטר של פרקול ו 15 מיליליטר של חיץ 2xGB ב 15 מיליליטר פוליקרבונט צינור צנטריפוגה במהירות גבוהה ב 30, 900 gs ברוטור זווית קבוע במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם הבלם כבוי. ואז לקצור כ 25 גרם של תשעה עד 15 יום יורה אפונה.הוסיפו אותם למאגר 1xGB קר של 95 מיליליטר בבלנדר צונן, עם להבים מחודדים. ולהומוגניזציה. מסננים תערובת זו דרך מינימום של שתי שכבות של בד גבינה, להציב משפך על מקור צונן.צנטריפוגה הסינון באמצעות צינור צנטריפוגה פוליקרבונט 15 מיליליטר ברוטור דלי מתנדנד ב 3, 000 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את העל-טבעי ולהשתמש במברשת צבע כדי לעכל בעדינות את גלולת הכדור במיליליטר אחד של 1xGB. לאחר מכן השתמש פיפטה יציבת זכוכית בזהירות שכבת השעיית המסך על גבי מעבר צבע פרקול.צנטריפוגה אותו רוטור דלי מתנדנד ב 8, 000 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם הבלם כבוי. באמצעות פיפטה יציבה שוב בזהירות להעביר את הלהקה הירוקה התחתונה המכילה כלורופלסטים שלמים לתוך צינור פוליקרבונט טרי 50 מיליליטר ולהוסיף 30 מיליליטר של חיץ 1xIB. צנטריפוגה הצינור ברוטור דלי מתנדנד ב 1, 800 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר השלכת supernatant, בעדינות resuspend את גלולה במיליליטר אחד של 1xIB עם מברשת צבע. לשטוף 30 מיליליטר של 1xIB וצנטריפוגה שוב באותם תנאים. תן מחדש את גלולה לאחר הצנטריפוגה הסופית במיליליטר אחד של 1xIB.כדי לקבוע את ריכוז הכלורופיל, יש לערבב 10 מיקרוליטרים של כלורופלסטים המתווסכים במלואם עם חמישה מיליליטר של 80% אצטון. מסננים דרך נייר מסנן בעובי 180 מיקרומטר עם גודל נקבוביות של 11 מיקרומטר ולאחר מכן קובעים את ריכוז הכלורופיל לפי ספקטרופוטומטר. מדללים את תערובת הכלורופלסט למיליגרם אחד למיליליטר באמצעות 1xIB קר.כדי להתחיל לבודד את thylakoids כאשר תמצית סטרומה אין צורך, כגון cpTat תחבורה, צנטריפוגה שלם chloroplasts ב 1.5 צינורות מיליליטר רוטור דלי מתנדנד ב 1, 000 gs בארבע מעלות צלזיוס במשך שש דקות. לאחר מכן, להשליך את supernatant ולתלות מחדש את גלולה במאגר תיזה היפוטונית כדי להשיג מיליגרם אחד למיליליטר עם micropipette. דגירה על קרח בחושך עם ערבוב מדי פעם במשך 10 דקות.כדי לשחזר thylokoids, צנטריפוגה רוטור דלי מתנדנד ב 3, 200 gs בארבע מעלות צלזיוס במשך שמונה דקות. לשטוף את thylokoids פעמיים על ידי resuspending את גלולה עם אחד עד שני מיליליטר של חיץ תמוגה ולאחר מכן צנטריפוגה באותם תנאים. לאחר הצנטריפוגה הסופית, תן שימוש חוזר את גלולה, במיליליטר אחד של חיץ 1xIB ולקבוע את ריכוז כלורופיל thylokoids מבודד באמצעות ספקטרופוטומטר כפי שהוכח בעבר.עבור מסלולים הדורשים התאוששות תמצית סטרומה כגון CPSec1 ו CPSRP eliquate 600 microliters של כלורופלסטים מבודדים רוטור דלי מתנדנד צנטריפוגה ב 1, 000 gs במשך שש דקות בארבע מעלות צלזיוס. עבור תזה כלורופלסט, אנו להשעות את גלולה עם 600 microliters של חיץ תזה היפוטונית. דגירה על קרח בחושך במשך 10 דקות עם ערבוב מדי פעם.ואז צנטריפוגה הצינורות ברוטור דלי מתנדנד ב 3, 200 גרם במשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס. כדי להציל את הסטרומה, להעביר את ירוק בהיר על טבעי צהוב צינור מיקרו צנטריפוגה חדש ולהוסיף נפח שווה של חיץ סטרומל גולמי 2x. כדי לשטוף thylokoids, להוסיף שתי כמויות של חיץ תמוגה צנטריפוגה ב 3, 200 גרם במשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס.השתמש מחדש את גלולה ב 1xIB כדי להשיג ריכוז כלורופיל של מיליגרם אחד למיליליטר ומניחים בצד על קרח לשימוש מאוחר יותר בהעברה. הסר שאריות קרום מסטרומה גולמית על ידי צנטריפוגה של סטרומה גולמית מדוללת ברוטור זווית קבוע ב 42, 000 gs במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן לאסוף 95% של נפח מכל צינור הקפד לא להפריע גלולה ירוקה צהובה קטנה, תוך שים גם את הנפח נלקח מכל צינור.כדי להכין את תמצית סטרומה מרוכזת, בריכה supernatants שנאספו. לאחר מכן השתמש 4 מיליליטר 30 קילודלטון מולקולרית משקל חותך concentrator לרכז את תמצית חמש לקפל. כדי להתבצר התחבורה cpTat בצינור 1.5 מיליליטר על קרח לערבב את בלוטת התריס מבודד ריכוז כלורופיל הסופי של 0.33 מיליגרם למיליליטר, חמישה מילימולרים ATP מוכן 1xIB, ושמונה מילימולר DTT מוכן 1xIB.כדי ליזום את ההובלה, להציג חלבון מצע לתערובת התחבורה. לנהל את התגובה על ידי הארת ההשעיה עם 80 עד 100 microeinsteins למ"ר לשנייה של קרינה פעילה פוטוסינתטית במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. כדי לעצור את תגובת התחבורה, לדלל את ההשעיה שמונה לקפל עם קרח קר 1xIB.צנטריפוגה ב 3, 200 gs בצנטריפוגה מיקרו במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לשחזר בלוטת התריס. לאחר השלכת supernatant, resuspend את גלולה ב 120 microliters של קרח קר 1xIB. כדי להתבצר CPSec1 או PSRP מסלולים לערבב את הדברים הבאים בצינור 1.5 מיליליטר על קרח.Thylakoids לריכוז כלורופיל סופי של 0.33 מיליגרם למיליליטר, 0.83 מיליגרם למיליליטר כלורופיל שווה ערך של תמצית סטרומה, וחמישה מילימולרים ATP מוכן 1xIB. מביאים את התגובה עד לנפח הרצוי עם קרח קר 1xIB ודגירה על קרח במשך 10 דקות. כדי ליזום את ההובלה להציג 10% נפח לפי נפח של חלבון מצע לתערובת תחבורה זו.יש להאיר עם 80 עד 100 מיקרואינשטיין למ"ר לשנייה של קרינה פוטוסינתטית פעילה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. כדי לעצור את התגובה, לדלל את ההשעיה שמונה לקפל עם קרח קר 1xIB. צנטריפוגה ב 3, 200gs בצנטריפוגה מיקרו במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר השלכת supernatant, resuspend את גלולה ב 120 microliters של קרח קר 1xIB. כדי להסיר מצע שיורית שלא הועבר, לעכל חלבון חיצוני על ידי הוספת שישה microliters של שני מיליגרם לכל תרמוליצין מיליליטר ו 10 מילימולאר סידן כלורי ב 1xIB. דגירה זו תגובת פרוטאז על קרח במשך 40 דקות.יש להנמיך את הפרוטאז על ידי הכפלת הנפח ב-25 מילימולרים של EDTA ב-1xIB. צנטריפוגה ב 3, 200 gs בצנטריפוגה מיקרו במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לשחזר בלוטת התריס. לאחר הסרת supernatant, resuspend התאושש thylokoids ב 120 microliters של חמישה milimolar EDTA ב 1xIB, ולהעביר צינור חדש 1.5 מיליליטר.לאחר צנטריפוגה שוב ב 3, 200 gs במיקרו צנטריפוגה במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, להשליך את supernatant ולתלות מחדש את גלולה בנפח המתאים של חיץ מדגם laemmli, בתוספת 10 מילימולר EDTA. מניחים את הדגימות באמבט מים רותחים במשך 10 דקות. המשך לנתח את הדוגמאות לפי דף SDS.הובלת חלבון iOE17 דרך מסלול cpTat הביאה לשינוי גודל של שניים עד שלושה קילודלטונים בין המצע שהוצג לבין הצורה המעובדת הבוגרת. הסיבה לכך היא מחשוף של פפטיד אות n מסוף המציין תחבורה מוצלחת cpTat. טיפול תרמוליסין משאיר רק את הלהקה הבוגרת מועברת בהצלחה ולכן proteus עמיד.הובלת מבשר OE33 דרך מסלול CPSec1, הביאה לשינוי גודל במצע הבוגר, והגנה פרוטאוס של המצע שהועבר. החדרת מבשר LHCP לתוך קרום בלוטת התריס דרך מסלול cpSRP, מוערך באמצעות עיכול תרמוליצין הוביל לשינוי גודל של 1.5 עד שני קילודלטון. זה הצביע על החדרת קרום מוצלחת, כמו הממברנה מגן הדוד של מוצר השפלה LHCP בוגרת מפני פרוטאוליזה מלאה.לאחר צפייה בסרטון זה אתה צריך הבנה טובה של איך לבודד thylokoids ו tranportivity assay דרך cpTat תלוי אנרגיה, cpSec 1 ו cpSRP מסלולים. לאחר השליטה בטכניקה זו ניתן לעשות זאת בשלוש עד ארבע שעות כאשר מבוצע כראוי. אמנם לא מאויר בסרטון זה אנחנו בדרך כלל לשמור את האורות תקורה במעבדה בעת בידוד ועובד עם כלורופלסטית פעיל פוטוסינתטית thylakoids.בעת ניסיון הליך זה חשוב לשמור על כלורופלסט ותילקלואידים מבודדים בארבע מעלות צלזיוס. זכור לעכל מחדש כלורופלסטים בעדינות בהתחלה. הימנעו מלהפריע לשיפוע הפרוקול לאחר שלב הצנטריפוציה הראשון.בנוסף, ניתן להכין דגימת קלט באחוזים במקביל לתגובות התחבורה ולהפעיל על אותו ג'ל כדי להעריך את הובלת המצע. אל תשכח, כי עבודה עם מצעים רדיואקטיביים דורש טיפול מצפוני PPE הנכון. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מיקוד החלבון לחקור את האנרגטיות, הקינטיקה והמנגנונים הייחודיים השולטים בהובלת חלבונים על פני ממברנות תילאקואידיות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

שיטה יעילה עבור הבידוד של רנ&quot;א מאוד מטוהר מזרעים לשימוש ב כמוני transcriptome ניתוח

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

סינתזה של 1,2-Azaborines ואת ההכנה של קומפלקסי החלבונים שלהם עם מוטאנטים ליזוזים T4

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

ניתוח Supercomplexes של Mitochondrial אלקטרונים שרשרת התחבורה עם אלקטרופורזה הילידים, ב-מבחני ג&#39;ל, ו Electroelution

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

בידוד, מדידות הנשימה של המיטוכונדריה מ תודרנית לבנה

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

פיצול-BioID — ניתוח פרוטיאומיה מבנית של חלבון ספציפי ההקשר מתחמי הסלולר בסביבתם הטבעית

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

השימוש פיוז'ן רקומביננטי חלבונים פלטפורמה Assay פרוטאז פלורסנט, Renaturation שלהם בג'ל

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

בתחומי החוץ והאי של האבנים הנוזומטיות

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

יישום של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) ללימוד אינטראקציות חלבונים-חלבונים בתמלול

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...