Name: isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays
Uploaded: 2018-09-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays at JoVE.com

Questo manoscritto è stato preparato con finanziamento da parte della divisione di scienze chimiche, Geoscienze e Biosciences, 408 ufficio energia delle scienze di base del dipartimento di energia attraverso Grant DE-SC0017035

1. materiali iniziale
<ol><li>Ammollo circa 55 g di piselli per 3 ore in 400 mL di acqua distillata e quindi seminare in un vassoio di plastica (35 x 20 cm x 6 cm) in terreno coperto con sottile strato di vermiculite.</li>
	<li>Crescere il vassoio di piselli a 20 ° C sotto ciclo luce/buio (50 µE/m2s) 12/12 h per 9-15 giorni.</li>
	<li>Preparare il substrato proteico secondo un metodo preferito. Nota: Abbiamo preparato substrati della proteina usando una varietà di metodi, tra cui 1) trascrizione in...

<ol>
	<li>Ellis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+protein+synthesis:+principles+and+problems.">Chloroplast protein synthesis: principles and problems.</a> Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).</li><li>Li, H. -. m., Chiu, C. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+transport+into+chloroplasts.">Protein transport into chloroplasts.</a> Annual review of plant biology. 61, (2010).</li><li>Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-specific+energy+requirements+for+protein+transport+across+or+into+thylakoid+membranes.+Two+lumenal+proteins+are+transported+in+the+absence+of+ATP.">Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).</li><li>Skalitzky, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastids+contain+a+second+sec+translocase+system+with+essential+functions.">Plastids contain a second sec translocase system with essential functions.</a> Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).</li><li>Dabney-Smith, C., Storm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plastid Biology. , 271-289 (2014).</li><li>Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+&amp;#34;assisted&amp;#34;+and+&amp;#34;spontaneous&amp;#34;+mechanisms+for+the+insertion+of+polytopic+chlorophyll-binding+proteins+into+the+thylakoid+membrane.">Distinct &amp;#34;assisted&amp;#34; and &amp;#34;spontaneous&amp;#34; mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).</li><li>Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. h. l. o. r. o. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChloroP,+a+neural+network-based+method+for+predicting+chloroplast+transit+peptides+and+their+cleavage+sites.">ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites.</a> Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).</li><li>Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locating+proteins+in+the+cell+using+TargetP,+SignalP+and+related+tools.">Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools.</a> Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).</li><li>Ling, Q., Jarvis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants.">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).</li><li>Lo, S. M., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Photosynthesis Research Protocols. , 139-157 (2011).</li><li>Vernon, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+chlorophylls+and+pheophytins+in+plant+extracts.">Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts.</a> Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).</li><li>Knott, T. G., Robinson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secA+inhibitor,+azide,+reversibly+blocks+the+translocation+of+a+subset+of+proteins+across+the+chloroplast+thylakoid+membrane.">The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).</li><li>Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SecA+homolog+in+protein+transport+within+chloroplasts:+evidence+for+endosymbiont-derived+sorting.">SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting.</a> Science. 266 (5186), 796-798 (1994).</li><li>Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+cDNA+for+pea+chloroplast+SecA+Evolutionary+conservation+of+the+bacterial-type+SecA-dependent+protein+transport+within+chloroplasts.">Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts.</a> FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).</li><li>Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-assisted+post-translational+transport+of+plastidic+type+I+signal+peptidase+1.">Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).</li><li>Luirink, J., Sinning, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRP-mediated+protein+targeting:+structure+and+function+revisited.">SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).</li><li>Yuan, J., Henry, R., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+factor+plays+an+essential+role+in+protein+integration+into+thylakoids+that+cannot+be+replaced+by+unfolding+or+by+heat+shock+protein.">Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein.</a> Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).</li><li>Tjalsma, H., van Dijl, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+consensus+prediction+of+protein+retention+in+a+bacterial+membrane.">Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane.</a> Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).</li><li>Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Facile+Reporter+System+for+the+Experimental+Identification+of+Twin-Arginine+Translocation+(Tat)+Signal+Peptides+from+All+Kingdoms+of+Life.">A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life.</a> Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).</li><li>Yuan, J., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastocyanin+and+the+33-kDa+subunit+of+the+oxygen-evolving+complex+are+transported+into+thylakoids+with+similar+requirements+as+predicted+from+pathway+specificity.">Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).</li><li>Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., B&#252;chel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transversal+and+lateral+exciton+energy+transfer+in+grana+thylakoids+of+spinach.">Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach.</a> Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).</li><li>Frielingsdorf, S., Jakob, M., Kl&#246;sgen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+pool+of+TatA+promotes+Tat-dependent+protein+transport+across+the+thylakoid+membrane.">A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).</li><li>Tu, C. -. J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+FtsY,+chloroplast+signal+recognition+particle,+and+GTP+are+required+to+reconstitute+the+soluble+phase+of+light-harvesting+chlorophyll+protein+transport+into+thylakoid+membranes.">Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).</li></ol>

Cloroplasto e tilacoidale isolamento
La rottura eccessiva può causare nel cloroplasto povero isolamento e così povero thylakoid resa dopo la separazione della sfumatura. È meglio omogeneizzare il tessuto raccolto delicatamente facendo in modo che tutto il materiale è sommerso prima di miscelazione e pulsare in 15 cicli di s fino a quando completamente omogeneizzato. Se necessario, utilizzare più cicli più brevi di miscelazione con meno tessuto in ogni round.
Tutt...

Quasi tutti i macchinari PROTEINICO responsabili cloroplasto corretta funzione deve essere spostati dal cytosol1. Presso le buste del cloroplasto, substrati della proteina sono importati attraverso il Traslocone della membrana esterna (TOC) e il Traslocone della membrana interna (TIC)2. Ulteriormente il targeting per il thylakoid membrana e lume si verifica attraverso la doppia arginina traslocazione (cpTat)3, il secretiva (cpSec1)4, il segnale riconoscimento delle particelle (cpSRP)5e i percorsi di inserimento spontaneo6 . Un metodo per l'isolamento ad alto rendimento dei cloroplasti fisiologicamente attivi e membrane tilacoidali è necessario misurare l'energetica e la cinetica di un evento di spostamento, per comprendere i meccanismi di trasporto diversi in ciascun percorso e per localizzare un substrato particolare proteina di interesse per uno qualsiasi dei sei comparti distinti del cloroplasto.
L'isolamento delle membrane da cloroplasto offre meglio sperimentale controllo sui fattori ambientali (quali le concentrazioni di sale e substrato, la presenza di ATP/GTP e condizioni di pH) che influenzano la misurazione dell'energetica di trasporto e cinetica. Questo ambiente in vitro si presta all'esplorazione dei dettagli meccanicistici di spostamento per gli stessi motivi. Inoltre, mentre software predittivo per la localizzazione delle proteine cloroplasto è migliorata7,8, in vitro trasporto saggi forniscono un metodo più veloce per la conferma nel corso di base di microscopia fluorescente saggi che richiedono un tag fluorescente geneticamente codificato, impianto di trasformazione e/o gli anticorpi specifici. Qui, presentiamo protocolli per isolamenti cloroplasto e tilacoidale da piselli (Pisum sativum), così come per le analisi di trasporto ottimizzate per ciascuna delle vie traslocazione thylakoid energia-dipendente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1936px;" width="1936">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Pisum sativum seeds</td>
			<td style="width:252px;">Seedway LLC, Hall, NY</td>
			<td style="width:292px;">8686 - Little Marvel</td>
			<td style="width:1068px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, Gibbstown, NJ</td>
			<td>475855-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">80% Acetone</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blender with sharpened blades</td>
			<td>Waring Commercial</td>
			<td>BB155S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polytron 10-35</td>
			<td>Fischer Sci</td>
			<td>13-874-617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>GE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beckman J2-MC with JA 20 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>8043-30-1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall RC-5B with HB-4 rotor</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>8327-30-1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>12/3/83</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM MgATP in 1xIB</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>74804-12-9</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermolysin in 1xIB (2mg/mL)</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>9073-78-3</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K-Tricine</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorbitol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>50-70-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manganese Chloride</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>13446-34-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays

Cloroplasti sono gli organelli in piante verdi responsabile per lo svolgimento di numerose vie metaboliche essenziali, in particolare la fotosintesi. Entro i cloroplasti, il sistema a membrana tilacoide ospita tutti i pigmenti fotosintetici, complessi del centro di reazione e la maggior parte degli elementi portanti dell'elettrone ed è responsabile della sintesi di ATP di luce-dipendente. Oltre il 90% delle proteine del cloroplasto sono codificate nel nucleo, tradotta nel citosol e successivamente importati nel cloroplasto. Ulteriore trasporto di proteine in o attraverso la membrana tilacoide utilizza uno dei quattro percorsi di spostamento. Qui, descriviamo un metodo ad alto rendimento per l'isolamento di trasporto-competente tilacoidi dai piselli (Pisum sativum), insieme a saggi di trasporto attraverso le tre energia-dipendente cpTat, cpSec1 e cpSRP-ha mediato le vie. Questi metodi consentono sperimentazioni relative alla localizzazione della proteina tilacoide, trasporto energetica e i meccanismi di traslocazione di proteine attraverso le membrane biologiche.

Per misurare la quantità di substrato correttamente trasportato, è utile includere una o più corsie di "ingresso per cento". Per i dati presentati di seguito, è stato utilizzato il 10% della reazione trasporto finale senza tilacoidi. Questo ingresso"percentuale" aiuta anche a visualizzare le dimensioni del substrato precursore. La percentuale rappresenta una quantità del substrato con cui al substrato confronta trasportato contro nota, definita e possa essere regolata su o giù come ...

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Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolamento dei tilacoidi fisiologicamente attivo e il loro uso nelle analisi di trasporto energia-dipendente della proteina

Vi presentiamo protocolli qui per isolamento ad alto rendimento di tilacoidi fisiologicamente attivo e analisi di trasporto di proteina per la traslocazione di cloroplasto doppia arginina (cpTat), secretiva (cpSec1) e vie di segnale riconoscimento delle particelle (cpSRP).

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave riguardanti i meccanismi e le energetiche del trasporto proteico attraverso le membrane cloroplaste, così come la posizione delle proteine all'interno dei plastidi. Il principale vantaggio di questa tecnica per il targeting delle proteine tilacoidi è che consente il controllo completo dell'ambiente del tilakoide durante il trasporto, tra cui temperatura, pH, condizioni ioniche e concentrazioni precursori. Inizia immergendo circa 55 grammi di piselli in 400 millilitri di acqua distillata per tre ore.Seminare i piselli imbevuti in un vassoio di plastica nel terreno, coperto da un sottile strato di vermiculite, e crescere per nove o 15 giorni come descritto nel protocollo di testo. Il giorno dell'isolamento del cloroplasto, preparare un gradiente di densità continua centrifugando una miscela di 15 millilitri di Percoll e 15 millilitri di tampone da 2xGB in un tubo di centrifuga ad alta velocità in policarbonato da 15 millilitri a 30,900 g in un rotore ad angolo fisso per 30 minuti a quattro gradi Celsius con il freno spento. Quindi raccogliere circa 25 grammi di germogli di piselli vecchi da nove a 15 giorni.Aggiungili a 95 millilitri di tampone freddo da 1xGB in un frullatore refrigerato, con lame affilate. E omogeneizzare. Filtrare questa miscela attraverso un minimo di due strati di stoffa di formaggio, posta in un imbuto su un becher refrigerato.Centrifugare il filtrato utilizzando un tubo di centrifuga in policarbonato da 15 millilitri in un rotore a benna oscillante a 3.000 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il supernatante e utilizzare un pennello per rimescolare delicatamente il pellet in un millilitro di 1xGB. Successivamente utilizzare una pipetta di postura in vetro per sovrapporre con cura le sospensioni dello schermo sopra la sfumatura Percoll.Centrifugarlo in un rotore a benna oscillante a 8.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius con il freno spento. Utilizzando una pipetta postura trasferire nuovamente accuratamente la fascia verde inferiore contenente cloroplasti intatti in un tubo di policarbonato fresco da 50 millilitri e aggiungere 30 millilitri di tampone 1xIB. Centrifugare il tubo in un rotore a benna oscillante a 1.800 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Dopo aver scartato il supernatante, rimescolare delicatamente il pellet in un millilitro di 1xIB con un pennello. Lavare in 30 millilitri di 1xIB e centrifugare di nuovo nelle stesse condizioni. Resuspend il pellet dopo la centrifugazione finale in un millilitro di 1xIB.Per determinare la concentrazione di clorofilla, mescolare 10 microlitri di cloroplasti completamente rimorsi con cinque millilitri di acetone all'80%. Filtrare attraverso una carta filtrante spessa 180 micrometri con dimensioni dei pori di 11 micrometri e quindi determinare la concentrazione di clorofilla mediante spettrofotometro. Diluire la miscela di cloroplasto a un milligrammo per millilitro usando 1xIB freddo.Per iniziare a isolare i thylakoidi quando l'estratto stromale non è necessario, come il trasporto cpTat, centrifugare cloroplasti intatti in tubi da 1,5 millilitri in un rotore a secchio oscillante a 1.000 g a quattro gradi Celsius per sei minuti. Successivamente, scartare il supernatante e rimescolare il pellet nel tampone di lisi ipotonica per ottenere un milligrammo per millilitro con una micropipetta. Incubare sul ghiaccio al buio con miscelazione occasionale per 10 minuti.Per recuperare i tireokoidi, centrifugare in un rotore a secchio oscillante a 3.200 g a quattro gradi Celsius per otto minuti. Lavare i tireokoidi due volte rimescolando il pellet con uno o due millilitri di tampone di lisi e quindi centrifugando nelle stesse condizioni. Dopo la centrifugazione finale, resospendare il pellet, in un millilitro di tampone 1xIB e determinare la concentrazione di clorofilla in thylokoidi isolati utilizzando uno spettrofotometro come precedentemente dimostrato.Per percorsi che richiedono il recupero di estratti stromali come CPSec1 e CPSRP eliquate 600 microlitri di cloroplasti isolati in un rotore a secchio oscillante e centrifuga a 1.000 g per sei minuti a quattro gradi Celsius. Per la lisi cloroplasta, sospendiamo il pellet con 600 microlitri di tampone di lisi ipotonica. Incubare sul ghiaccio al buio per 10 minuti con miscelazione occasionale.Quindi centrifugare i tubi in un rotore a benna oscillante a 3.200 g per otto minuti a quattro gradi Celsius. Per salvare lo stroma, trasferire il supernatante dal verde chiaro al giallo su un nuovo tubo di micro centrifuga e aggiungere un volume uguale di tampone stromale grezzo 2x. Per lavare i tireokoidi, aggiungere due volumi di tampone dilisi e centrifuga a 3.200 g per otto minuti a quattro gradi Celsius.Resuspend il pellet in 1xIB per ottenere una concentrazione di clorofilla di un milligrammo per millilitro e messo da parte sul ghiaccio per un uso successivo nei saggi di trasporto. Rimuovere le membrane residue dallo stroma grezzo centrifugando lo stroma grezzo diluito in un rotore ad angolo fisso a 42.000 g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi raccogliere il 95% del volume da ogni tubo assicurandosi di non disturbare il piccolo pellet giallo verde, notando il volume prelevato da ogni tubo.Per preparare l'estratto stromale concentrato, mettere in comune i supernatanti raccolti. Quindi utilizzare un concentratore cut-off di peso molecolare da quattro millilitri da 30 kilodalton per concentrare l'estratto di cinque volte. Per saggiare il trasporto cpTat in un tubo da 1,5 millilitri su ghiaccio mescolare i tireokoidi isolati ad una concentrazione finale di clorofilla di 0,33 milligrammi per millilitro, cinque ATP millimolare preparato in 1xIB e otto DTT millimolare preparati in 1xIB.Per avviare il trasporto, introdurre la proteina del substrato nel mix di trasporto. Condurre la reazione illuminando la sospensione con da 80 a 100 microeinstein per metro quadrato al secondo di radiazione fotosinteticamente attiva per 10 minuti a temperatura ambiente. Per interrompere la reazione di trasporto, diluire la sospensione di otto volte con ghiaccio freddo 1xIB.Centrifuga a 3.200 g in micro centrifuga per cinque minuti a quattro gradi Celsius per recuperare i tireokoidi. Dopo aver scartato il supernatante, resuspend il pellet in 120 microlitri di ghiaccio freddo 1xIB. Per saggiare le vie CPSec1 o PSRP mescolare quanto segue in un tubo da 1,5 millilitri su ghiaccio.Thylakoids ad una concentrazione finale di clorofilla di 0,33 milligrammi per millilitro, 0,83 milligrammi per millilitro equivalenti di clorofilla di estratto stromale e cinque MILLIMOLARI ATP preparati in 1xIB. Portare la reazione al volume desiderato con ghiaccio freddo 1xIB e incubare sul ghiaccio per 10 minuti. Per avviare il trasporto introdurre il 10% volume in volume di proteine del substrato in questa miscela di trasporto.Illuminare con da 80 a 100 microeinsteine per metro quadrato al secondo di radiazione fotosinteticamente attiva per 10 minuti a temperatura ambiente. Per fermare la reazione, diluire la sospensione di otto volte con ghiaccio freddo 1xIB. Centrifuga a 3.200g in micro centrifuga per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Dopo aver scartato il supernatante, resuspend il pellet in 120 microlitri di ghiaccio freddo 1xIB. Per rimuovere il substrato residuo che non è stato trasportato, digerire proteine esterne aggiungendo sei microlitri di due milligrammi per millilitro termolisina e 10 millimolare cloruro di calcio in 1xIB. Incubare questa reazione di proteasi sul ghiaccio per 40 minuti.Temprare la proteasi raddoppiando il volume con EDTA da 25 millimolari in 1xIB. Centrifuga a 3.200 g in micro centrifuga per cinque minuti a quattro gradi Celsius per recuperare i tireokoidi. Dopo aver rimosso il supernatante, resuspend recuperò i tireokoidi in 120 microlitri di cinque EDTA milimolari in 1xIB, e si trasferisce in un nuovo tubo da 1,5 millilitri.Dopo aver centrifugato di nuovo a 3.200 g in una micro centrifuga per cinque minuti a quattro gradi Celsius, scartare il supernatante e rimescolare il pellet in un volume appropriato di tampone di campione di laemmli, integrato con EDTA da 10 millimolare. Mettere i campioni in un bagno d'acqua bollente per 10 minuti. Procedere all'analisi degli esempi in base alla pagina SDS.Il trasporto della proteina iOE17 attraverso la via cpTat ha comportato uno spostamento delle dimensioni da due a tre kilodalton tra il substrato introdotto e la forma lavorata matura. Ciò è dovuto alla scissione del peptide del segnale terminale n che indica un trasporto cpTat riuscito. Il trattamento con termolisina lascia solo la banda matura trasportata con successo e quindi resistente al proteo.Il trasporto del precursore OE33 attraverso la via CPSec1, ha comportato uno spostamento delle dimensioni nel substrato maturo e la protezione proteus del substrato trasportato. L'inserimento del precursore LHCP nella membrana tireokoide attraverso la via cpSRP, valutato attraverso la digestione della termolisina, ha portato a uno spostamento delle dimensioni da 1,5 a due kilodalton. Ciò ha indicato un inserimento riuscito della membrana, poiché la membrana protegge lo zio del prodotto di degradazione LHCP maturo dalla proteolisi completa.Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come isolare i tireokoidi e la trasportivity del test attraverso le vie cpTat, cpSec 1 e cpSRP dipendenti dall'energia. Una volta padroneggiata questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore se eseguita correttamente. Sebbene non sia illustrato in questo video, generalmente teniamo spente le luci aeree in laboratorio quando si isolano e si lavora con cloroplasti e thylakoidi fotosinteticamente attivi.Durante il tentativo di questa procedura è importante mantenere cloroplasti e tilakoidi isolati a quattro gradi Celsius. Ricordati di rimospendare delicatamente i cloroplasti all'inizio. Evitare di disturbare la sfumatura Procoll dopo il primo passaggio di centrifugazione.Inoltre, la percentuale di campione di ingresso può essere preparata in parallelo con le reazioni di trasporto ed eseguita sullo stesso gel per stimare il trasporto del substrato. Non dimenticare che lavorare con substrati radioattivi richiede una manipolazione coscienziosa e dPI adeguati. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo del targeting proteico per esplorare l'energia, la cinetica e i meccanismi unici che regolano il trasporto proteico attraverso le membrane tilacoidi.

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