Name: isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays
Uploaded: 2018-09-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays at JoVE.com

この原稿は化学専攻、地球科学、生命科学、米国エネルギー省を介してグラント ・ デ ・ SC0017035 の基本的なエネルギー科学の 408 のオフィスで準備されました。

1. 初期の材料
<ol><li>400 mL の水で 3 時間のエンドウ豆の約 55 g を浸漬し、その後、プラスチック製のトレイに種をまく (35 cm × 20 cm × 6 cm) 土バーミキュ ライトの薄層で覆われています。</li>
	<li>12/12 h/暗 (50 Με/m2s) サイクル 9 ~ 15 日の下 20 の ° C でエンドウ豆のトレイを成長します。</li>
	<li>推奨される方法に従ってタンパク質基板を準備します。 注: さまざまな 1 を含む方法を使?...

<ol>
	<li>Ellis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+protein+synthesis:+principles+and+problems.">Chloroplast protein synthesis: principles and problems.</a> Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).</li><li>Li, H. -. m., Chiu, C. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+transport+into+chloroplasts.">Protein transport into chloroplasts.</a> Annual review of plant biology. 61, (2010).</li><li>Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-specific+energy+requirements+for+protein+transport+across+or+into+thylakoid+membranes.+Two+lumenal+proteins+are+transported+in+the+absence+of+ATP.">Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).</li><li>Skalitzky, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastids+contain+a+second+sec+translocase+system+with+essential+functions.">Plastids contain a second sec translocase system with essential functions.</a> Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).</li><li>Dabney-Smith, C., Storm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plastid Biology. , 271-289 (2014).</li><li>Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+&amp;#34;assisted&amp;#34;+and+&amp;#34;spontaneous&amp;#34;+mechanisms+for+the+insertion+of+polytopic+chlorophyll-binding+proteins+into+the+thylakoid+membrane.">Distinct &amp;#34;assisted&amp;#34; and &amp;#34;spontaneous&amp;#34; mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).</li><li>Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. h. l. o. r. o. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChloroP,+a+neural+network-based+method+for+predicting+chloroplast+transit+peptides+and+their+cleavage+sites.">ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites.</a> Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).</li><li>Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locating+proteins+in+the+cell+using+TargetP,+SignalP+and+related+tools.">Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools.</a> Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).</li><li>Ling, Q., Jarvis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants.">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).</li><li>Lo, S. M., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Photosynthesis Research Protocols. , 139-157 (2011).</li><li>Vernon, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+chlorophylls+and+pheophytins+in+plant+extracts.">Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts.</a> Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).</li><li>Knott, T. G., Robinson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secA+inhibitor,+azide,+reversibly+blocks+the+translocation+of+a+subset+of+proteins+across+the+chloroplast+thylakoid+membrane.">The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).</li><li>Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SecA+homolog+in+protein+transport+within+chloroplasts:+evidence+for+endosymbiont-derived+sorting.">SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting.</a> Science. 266 (5186), 796-798 (1994).</li><li>Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+cDNA+for+pea+chloroplast+SecA+Evolutionary+conservation+of+the+bacterial-type+SecA-dependent+protein+transport+within+chloroplasts.">Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts.</a> FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).</li><li>Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-assisted+post-translational+transport+of+plastidic+type+I+signal+peptidase+1.">Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).</li><li>Luirink, J., Sinning, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRP-mediated+protein+targeting:+structure+and+function+revisited.">SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).</li><li>Yuan, J., Henry, R., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+factor+plays+an+essential+role+in+protein+integration+into+thylakoids+that+cannot+be+replaced+by+unfolding+or+by+heat+shock+protein.">Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein.</a> Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).</li><li>Tjalsma, H., van Dijl, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+consensus+prediction+of+protein+retention+in+a+bacterial+membrane.">Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane.</a> Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).</li><li>Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Facile+Reporter+System+for+the+Experimental+Identification+of+Twin-Arginine+Translocation+(Tat)+Signal+Peptides+from+All+Kingdoms+of+Life.">A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life.</a> Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).</li><li>Yuan, J., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastocyanin+and+the+33-kDa+subunit+of+the+oxygen-evolving+complex+are+transported+into+thylakoids+with+similar+requirements+as+predicted+from+pathway+specificity.">Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).</li><li>Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., B&#252;chel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transversal+and+lateral+exciton+energy+transfer+in+grana+thylakoids+of+spinach.">Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach.</a> Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).</li><li>Frielingsdorf, S., Jakob, M., Kl&#246;sgen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+pool+of+TatA+promotes+Tat-dependent+protein+transport+across+the+thylakoid+membrane.">A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).</li><li>Tu, C. -. J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+FtsY,+chloroplast+signal+recognition+particle,+and+GTP+are+required+to+reconstitute+the+soluble+phase+of+light-harvesting+chlorophyll+protein+transport+into+thylakoid+membranes.">Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).</li></ol>

葉緑体とチラコイドの分離
過度の破損が発生することができます貧しい葉緑体の分離そしてこうして貧しいチラコイドをグラデーションで分離後もたらします。優しくブレンドと完全に均質になるまで 15 秒サイクルでパルスの前にすべての材料を浸漬を確保することによって収穫された組織を均質化することをお勧めします。必要に応じて、各ラウンドで以下の組織とブ?...

適切な葉緑体機能の責任タンパク質機械のほぼすべては細胞質1から移行する必要があります。葉緑体エンベロープでタンパク質は、トランスロコン (TOC) の外側の膜と内膜 (TIC)2トランスロコンを通じてインポートされます。さらに、チラコイドにターゲット膜と内腔がツイン アルギニン転 (cpTat)3、分泌 (cpSec1)4、信号認識粒子 (cpSRP)5自発挿入経路6 を通じて行われます。.生理活性の葉緑体のチラコイド膜高収率分離法はエネルギー論および転流イベント、各経路で多様なトランスポート機構を理解し、ローカライズの体内動態を測定するために必要な葉緑体の六つの異なる区画のいずれかに関心の特定のタンパク質基質です。
葉緑体膜の分離は、輸送エネルギーの測定に影響を与える要因 (塩と基質濃度 ATP/GTP と pH 条件の存在など) をより実験的制御を提供していて、速度論。この体外環境は同じ理由のための転流機構詳細の探査に適しています。さらに、葉緑体タンパク質の局在化の予言するソフトウェアは、7、8をしましたが、輸送の in vitroアッセイでは、確認のため高速な方法顕微鏡蛍光アッセイ遺伝的コード化蛍光タグ、植物形質転換および/または特定の抗体が必要です。ここでは、輸送アッセイごとエネルギー依存チラコイドの転流経路の最適化のためだけでなく、エンドウ豆 (エンドウ) から葉緑体とチラコイドの隔離のためのプロトコルを提案する.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1936px;" width="1936">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Pisum sativum seeds</td>
			<td style="width:252px;">Seedway LLC, Hall, NY</td>
			<td style="width:292px;">8686 - Little Marvel</td>
			<td style="width:1068px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, Gibbstown, NJ</td>
			<td>475855-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">80% Acetone</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blender with sharpened blades</td>
			<td>Waring Commercial</td>
			<td>BB155S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polytron 10-35</td>
			<td>Fischer Sci</td>
			<td>13-874-617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>GE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beckman J2-MC with JA 20 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>8043-30-1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall RC-5B with HB-4 rotor</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>8327-30-1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>12/3/83</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM MgATP in 1xIB</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>74804-12-9</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermolysin in 1xIB (2mg/mL)</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>9073-78-3</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K-Tricine</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorbitol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>50-70-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manganese Chloride</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>13446-34-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays

葉緑体は、緑色植物の多数の重要な代謝経路を運ぶための責任で細胞小器官最も特に光合成。葉緑体には、チラコイド膜システムすべての光合成色素、反応中心複合体、電子キャリアのほとんどを住宅と光依存性 ATP 合成のためあります。葉緑体タンパク質の 90% 以上は、核でエンコードされ、細胞質で翻訳、後葉緑体にインポートします。さらにタンパク質輸送やチラコイド膜は、4 つの転流経路の一つを利用しています。ここでは、3 つのエネルギー依存性 cpTat、cpSec1、および cpSRP を介した経路を介して輸送アッセイと一緒に豆 (エンドウ) からトランスポート主務チラコイドの単離のため高収率手法について述べる。これらのメソッドは、生体膜、チラコイドのタンパク質の局在、輸送エネルギーおよびタンパク質輸送のメカニズムに関する実験を有効にします。

正常に輸送基質の量を測定するには、1 つまたは複数の「パーセント入力」車線を含めると便利です。以下に示すデータ、最終輸送反応をせずにチラコイドの 10% 使用しています。この「% 入力」前駆体基板のサイズを視覚化することができます。割合に対して輸送比較基板、基板の知られている、定義された量を表すことができます上下にタンパク質を用意して最初?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays at JoVE.com

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

生理活性とエネルギー依存性タンパク質輸送アッセイでの使用の分離

生理活性チラコイドの高収率分離のためにここのプロトコルおよび葉緑体ツイン アルギニン転流 (cpTat)、分泌 (cpSec1)、およびシグナル認識粒子 (cpSRP) のための蛋白質輸送アッセイを提案します。

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

この方法は、葉膜を横切るタンパク質輸送のメカニズムとエネルギー、およびプラスティド内のタンパク質の位置に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。チラコイドタンパク質ターゲティングのこの技術の主な利点は、温度、pH、イオン条件、前駆体濃度を含む輸送中のチラコイドの環境を完全に制御できることです。約55グラムのエンドウ豆を400ミリリットルの蒸留水に3時間浸すことから始めます。浸したエンドウ豆を土壌中のプラスチックトレイにまき、薄い層の朱色で覆われ、テキストプロトコルに記載されているように9〜15日間成長します。葉芽体分離の日には、15ミリリットルのポリカーボネート高速遠心管に15ミリリットルのパーコールと15ミリリットルの2xGBバッファーの混合物を遠心分離して連続的な密度勾配を調製し、ブレーキをオフにして摂氏4度で30分間固定角度ローターで900 gs。その後、約25グラムの9〜15日齢のエンドウ豆の芽を収穫します。冷やしたブレンダーで95ミリリットルの冷たい1xGBバッファーに、シャープブレードを加えます。そして均質化する。この混合物を少なくとも2層のチーズクロスでろ過し、冷やしたビーカーの上に漏斗に入れます。3,000 gsのスイングバケットローターに15ミリリットルのポリカーボネート遠心チューブを使用して濾液を摂氏4度で5分間遠心する。上清を捨て、ペイントブラシを使用してペレットを1ミリリットル(1xGB)にそっと再懸濁します。その後、ガラスポスチャピペットを使用して、Percoll勾配の上に画面サスペンションを慎重に重ねるようにします。ブレーキをオフにして摂氏4度で10分間、8,000 gsのスイングバケットローターで遠心分離します。ポスチャピペットを使用して再び慎重に新しい50ミリリットルポリカーボネートチューブに無傷の葉緑のバンドを入れ、1xIBバッファーの30ミリリットルを追加します。1,800 gsのスイングバケットローターのチューブを摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を捨て、1xIBの1ミリリットルのペレットをペイントブラシで静かに再懸濁します。同じ条件下で再び1xIBと遠心分離機の30ミリリットルで洗浄します。最終遠心分離後にペレットを1ミリリットル1xIBで再懸濁する。クロロフィル濃度を決定するには、完全に再懸濁した葉芽細胞の10マイクロリットルを80%アセトンの5ミリリットルと混合する。180マイクロメートルの厚さのフィルターペーパーを通して11マイクロメートルの細孔サイズをフィルターし、分光光度計によってクロロフィル濃度を決定する。冷たい1xIBを使用して、1ミリリットル当たり1ミリグラムに葉ロプラスト混合物を希釈します。cpTat輸送などの間質抽出物が必要ない場合にチラコイドの単離を開始するには、1.5ミリリットルチューブの内の遠心分離の無傷葉芽を1,000 gsで摂氏4度で6分間回転させる。その後、上清を捨て、低張性リシスバッファー内のペレットを再懸濁して、マイクロピペットで1ミリリットル当たり1ミリグラムを達成する。暗闇の中で氷の上でインキュベートし、時折10分間混合します。チロコイドを回復するために、3、200 gsのスイングバケットローターで8分間摂氏4度で遠心分離機。シロコイドを2回洗浄し、ペレットを1~2ミリリットルのリシスバッファーで再懸濁し、同じ条件で遠心分離します。最終遠心分離後、ペレットを1ミリリットルの1ミリリットルの1xIBバッファーで再懸濁し、先に実証したように分光光度計を用いて分離チロコイドにおけるクロロフィル濃度を決定する。CPSec1およびCPSRPエリクエータートのような間質抽出回復を必要とする経路については、1,000 gsのスイングバケットローターおよび遠心分離機で6分間摂氏4度で分離された葉芽の600マイクロリットル。葉芽細胞のリシスについては、600マイクロリットルの低張性ライシスバッファーでペレットを懸濁します。時折混合して暗闇の中で氷の上で10分間インキュベートします。その後、3、200 gsで4°Cで8分間スイングバケットローターでチューブを遠心分離します。ストロマを保存するには、新しいマイクロ遠心分離管に黄色の上清にライトグリーンを転送し、2倍の粗い間質バッファーの等しい量を追加します。チロコイドを洗うには、3,200 gsで摂氏4度で8分間、2巻のリシスバッファーと遠心分離機を加えます。1xIBでペレットを再懸濁して1ミリリットル当たり1ミリグラムのクロロフィル濃度を達成し、後で輸送アッセイで使用するために氷の上に置きます。42,000 gsの固定角度ローターで希釈した粗質を摂氏4度で30分間遠心して、粗野なストロマから残留膜を取り除きます。その後、各チューブから取られたボリュームに注意しながら、小さな黄色の緑色のペレットを乱さないように各チューブからボリュームの95%を収集します。濃縮された間質抽出物を調製するために、集めた上清をプールする。その後、4ミリリットル30キロリットルの分子量カットオフ濃縮器を使用して、抽出物を5倍に濃縮する。氷上の1.5ミリリットルチューブ内のcpTat輸送をアッセイするために、分離されたチロコイドを1ミリリットル当たり0.33ミリグラムの最終的なクロロフィル濃度に混合し、1xIBで調製した5ミリモルATP、および1xIBで調製した8ミリモルDTTを混合する。輸送を開始するために、輸送ミックスに基質タンパク質を導入する。1平方メートル当たり80~100マイクロインスタインを光合成活性放射線で10分間室温で10分間照射して、反応を行います。輸送反応を停止するには、懸濁液を氷冷1xIBで8倍に希釈する。3,200 gsの遠心分離機をマイクロ遠心分離機で摂氏4度で5分間、チロコイドを回収する。上清を捨て、120マイクロリットルの氷冷1xIBでペレットを再懸濁する。CPSec1またはPSRP経路をアッセイするには、氷上の1.5ミリリットルチューブに以下を混合します。チラコイドは、1ミリリットル当たり0.33ミリグラムの最終的なクロロフィル濃度、1ミリリットルクロロフィル相当の1ミリグラムの間質抽出物、および1xIBで調製された5ミリモルATPに対する。氷冷1xIBで目的の体積まで反応を持ち込み、氷の上で10分間インキュベートします。輸送を開始するために、この輸送ミックスに基質タンパク質の体積によって10%体積を導入する。1平方メートルあたり80~100マイクロアインシュタインで光合成活性放射を室温で10分間照射します。反応を止めるには、懸濁液を氷冷1xIBで8倍に希釈する。マイクロ遠心分離機で3,200gsの遠心分離機を摂氏4度で5分間。上清を捨て、120マイクロリットルの氷冷1xIBでペレットを再懸濁する。輸送されていない残留基質を除去するために、1ミリリットルのサーモリシン当たり2ミリグラム6マイクロリットル、1xIBに10ミリモルの塩化カルシウムを加えて外部タンパク質を消化する。このプロテアーゼ反応を氷上で40分間インキュベートします。1xIBで25ミリモルEDTAで容量を倍増させることでプロテアーゼをクエンチする。3,200 gsの遠心分離機をマイクロ遠心分離機で摂氏4度で5分間、チロコイドを回収する。上清を除去した後、回収したチロコイドを1xIBで5ミリモルEDTAの120マイクロリットルで回収し、新しい1.5ミリリットルチューブに移す。3,200 gsで再びマイクロ遠心分離機で摂氏4度で5分間遠心分離した後、上清を捨て、ペレットを適切な量のレムリサンプルバッファーに再懸濁させ、10ミリモルEDTAを補う。熱湯浴にサンプルを10分間入れます。SDS ページでサンプルの分析に進みます。cpTat経路を介したiOE17タンパク質の輸送は、導入された基質と成熟した処理された形態との間に2〜3キロダルトンのサイズシフトをもたらした。これは、cpTat輸送の成功を示すn末端シグナルペプチドの切断によるものである。サーモリシン処理は、正常に輸送され、したがってプロテウス耐性成熟バンドのみを残します。CPSec1経路を介したOE33前駆体の輸送は、成熟した基質におけるサイズシフト、および輸送された基質のプロテウス保護をもたらした。cpSRP経路を介してチロコイド膜にLHCP前駆体を挿入し、サーリシン消化を通じて評価し、1.5〜2キロダルトンのサイズシフトにつながった。これは、膜が完全なタンパク質分解から成熟したLHCP分解産物の未切断を保護するので、膜挿入に成功したことを示した。このビデオを見た後、エネルギー依存性cpTat、cpSec 1およびcpSRP経路を介してチロコイドとアッセイトランポーティを分離する方法をよく理解する必要があります。この技術を習得したら、3~4時間で適切に実行できます。このビデオでは説明されていませんが、光合成活性葉皮とチラシを分離して作業する際には、一般的にラボのオーバーヘッドライトを消しておいてください。この手順を試みている間、孤立した葉蓋とチラコイドを摂氏4度に保つことが重要です。最初は葉葉芽細胞をやさしく再中断してください。最初の中心のステップの後にプロコール勾配を乱さないようにします。さらに、パーセント入力サンプルは、輸送反応と並行して調製し、基質輸送を推定するために同じゲル上で実行することができる。放射性基質を扱うには、良心的な取り扱いと適切なPPEが必要であることを忘れないでください。開発後、この技術は、タンパク質ターゲティングの分野の研究者が、チラシ骨膜を横切るタンパク質輸送を支配するエネルギッシュ、キネティクス、ユニークなメカニズムを探求する道を開きました。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

定量的トランスクリプトーム解析に使用するための種子から高度に精製されたRNAの単離のための効率的な方法

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

1,2- Azaborinesの合成とT4リゾチーム変異体とのタンパク質複合体の調製

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

ネイティブ電気泳動、インゲルアッセイおよび電気溶出を用いたミトコンドリア電子輸送鎖のスーパーコンプレックスの解析

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

ネイティブな携帯電話環境におけるコンテキスト固有蛋白質複合体の分割-BioID-プロテオーム解析

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

蛍光プロテアーゼ アッセイプラット フォームとそのゲルの下で遺伝子組換えの融合蛋白質の使用

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

タンパク質の折り畳み、トランスポート、および放射性パルス追跡による生体細胞の劣化の解析

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

ヌクレオソームヒストンのインビトロユビキチン化とデュービキチン化アッセイ

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

転写におけるタンパク質とタンパク質の相互作用を研究するための生体層干渉計(BLI)の応用

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...