Name: isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays
Uploaded: 2018-09-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays at JoVE.com

Dette manuskriptet var forberedt med finansiering av Division of kjemiske Sciences, Geofag og biovitenskap, 408 kontoret til energi basalfag av oss Department of Energy gjennom Grant DE-SC0017035

1. første materialer
<ol><li>Suge ca 55 g av erter i 3 timer i 400 mL destillert vann og deretter purke i en plast brett (35 cm x 20 cm x 6 cm) i jorda dekket med tynt lag av vermikulitt.</li>
	<li>Vokse skuffen av erter ved 20 ° C under 12/12 h lys/mørke (50 µE/m2s) syklus for 9 til 15 dager.</li>
	<li>Forberede protein substrat etter en foretrukket metode. Merk: Vi har forberedt protein underlag bruker en rekke metoder, inkludert 1) i vitro transkripsjon fra renset plasmider etterfulgt av o...

<ol>
	<li>Ellis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+protein+synthesis:+principles+and+problems.">Chloroplast protein synthesis: principles and problems.</a> Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).</li><li>Li, H. -. m., Chiu, C. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+transport+into+chloroplasts.">Protein transport into chloroplasts.</a> Annual review of plant biology. 61, (2010).</li><li>Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-specific+energy+requirements+for+protein+transport+across+or+into+thylakoid+membranes.+Two+lumenal+proteins+are+transported+in+the+absence+of+ATP.">Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).</li><li>Skalitzky, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastids+contain+a+second+sec+translocase+system+with+essential+functions.">Plastids contain a second sec translocase system with essential functions.</a> Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).</li><li>Dabney-Smith, C., Storm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plastid Biology. , 271-289 (2014).</li><li>Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+&amp;#34;assisted&amp;#34;+and+&amp;#34;spontaneous&amp;#34;+mechanisms+for+the+insertion+of+polytopic+chlorophyll-binding+proteins+into+the+thylakoid+membrane.">Distinct &amp;#34;assisted&amp;#34; and &amp;#34;spontaneous&amp;#34; mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).</li><li>Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. h. l. o. r. o. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChloroP,+a+neural+network-based+method+for+predicting+chloroplast+transit+peptides+and+their+cleavage+sites.">ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites.</a> Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).</li><li>Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locating+proteins+in+the+cell+using+TargetP,+SignalP+and+related+tools.">Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools.</a> Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).</li><li>Ling, Q., Jarvis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants.">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).</li><li>Lo, S. M., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Photosynthesis Research Protocols. , 139-157 (2011).</li><li>Vernon, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+chlorophylls+and+pheophytins+in+plant+extracts.">Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts.</a> Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).</li><li>Knott, T. G., Robinson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secA+inhibitor,+azide,+reversibly+blocks+the+translocation+of+a+subset+of+proteins+across+the+chloroplast+thylakoid+membrane.">The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).</li><li>Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SecA+homolog+in+protein+transport+within+chloroplasts:+evidence+for+endosymbiont-derived+sorting.">SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting.</a> Science. 266 (5186), 796-798 (1994).</li><li>Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+cDNA+for+pea+chloroplast+SecA+Evolutionary+conservation+of+the+bacterial-type+SecA-dependent+protein+transport+within+chloroplasts.">Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts.</a> FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).</li><li>Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-assisted+post-translational+transport+of+plastidic+type+I+signal+peptidase+1.">Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).</li><li>Luirink, J., Sinning, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRP-mediated+protein+targeting:+structure+and+function+revisited.">SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).</li><li>Yuan, J., Henry, R., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+factor+plays+an+essential+role+in+protein+integration+into+thylakoids+that+cannot+be+replaced+by+unfolding+or+by+heat+shock+protein.">Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein.</a> Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).</li><li>Tjalsma, H., van Dijl, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+consensus+prediction+of+protein+retention+in+a+bacterial+membrane.">Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane.</a> Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).</li><li>Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Facile+Reporter+System+for+the+Experimental+Identification+of+Twin-Arginine+Translocation+(Tat)+Signal+Peptides+from+All+Kingdoms+of+Life.">A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life.</a> Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).</li><li>Yuan, J., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastocyanin+and+the+33-kDa+subunit+of+the+oxygen-evolving+complex+are+transported+into+thylakoids+with+similar+requirements+as+predicted+from+pathway+specificity.">Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).</li><li>Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., B&#252;chel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transversal+and+lateral+exciton+energy+transfer+in+grana+thylakoids+of+spinach.">Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach.</a> Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).</li><li>Frielingsdorf, S., Jakob, M., Kl&#246;sgen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+pool+of+TatA+promotes+Tat-dependent+protein+transport+across+the+thylakoid+membrane.">A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).</li><li>Tu, C. -. J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+FtsY,+chloroplast+signal+recognition+particle,+and+GTP+are+required+to+reconstitute+the+soluble+phase+of+light-harvesting+chlorophyll+protein+transport+into+thylakoid+membranes.">Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).</li></ol>

Chloroplast og Thylakoid isolasjon
Overdreven brudd kan resultere i dårlig chloroplast isolasjon og dårlig thylakoid kapasitet etter separasjonen i forløpningen. Det er best å homogenize høstet vevet forsiktig ved å sikre at alt materiale er neddykket før blanding og pulserende i 15 s sykluser til fullt homogenisert. Om nødvendig kan du bruke flere kortere runder blanding med mindre vev i hver runde.
Kjøle alle materialer som kommer i kontakt med høstet vev h...

Nesten alle proteinaceous maskiner ansvarlig for riktig chloroplast-funksjonen må være translocated fra stoffer1. På chloroplast konvoluttene importeres protein underlag gjennom translocon av den ytre membranen (Innholdsfortegnelsen) og translocon av indre membran (TIC)2. Videre målretting for thylakoid skjer membran og lumen gjennom twin arginine translokasjon (cpTat)3, sekretoriske (cpSec1)4, signalet anerkjennelse partikkel (cpSRP)5og spontan innsetting veier6 . En metode for høy avkastning isolering av fysiologisk aktive chloroplasts og thylakoid membraner er nødvendig for å måle energi og kinetics av en translokasjon hendelse, forstår de forskjellige transportmekanismene i hver veien og lokalisere en spesielle proteinet substrat av interesse for noen av de seks forskjellige avdelinger av chloroplast.
Isolasjon av membraner fra chloroplast gir bedre eksperimentelle kontroll over miljøfaktorer (for eksempel salt og underlaget konsentrasjoner, ATP/GTP, og pH forhold) som påvirker måling av transport energi og Kinetics. Dette i vitro miljø gir seg til utforskning av mekanistisk detaljer om translokasjon av samme grunn. I tillegg, mens prognosen programvare for lokalisering av chloroplast proteiner har forbedret7,8, gir i vitro transport analyser en raskere metode for bekreftelse over mikroskopi-baserte fluorescerende analyser som kreve en genetisk kodet fluorescerende kode, plante transformasjon og/eller spesifikke antistoffer. Her presenterer vi protokoller for chloroplast og thylakoid isolasjoner fra erter (Parlamentarisme sativum) og transport analyser optimalisert for hver av energi-avhengige thylakoid translokasjon veier.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1936px;" width="1936">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Pisum sativum seeds</td>
			<td style="width:252px;">Seedway LLC, Hall, NY</td>
			<td style="width:292px;">8686 - Little Marvel</td>
			<td style="width:1068px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, Gibbstown, NJ</td>
			<td>475855-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">80% Acetone</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blender with sharpened blades</td>
			<td>Waring Commercial</td>
			<td>BB155S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polytron 10-35</td>
			<td>Fischer Sci</td>
			<td>13-874-617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>GE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beckman J2-MC with JA 20 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>8043-30-1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall RC-5B with HB-4 rotor</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>8327-30-1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>12/3/83</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM MgATP in 1xIB</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>74804-12-9</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermolysin in 1xIB (2mg/mL)</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>9073-78-3</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K-Tricine</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorbitol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>50-70-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manganese Chloride</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>13446-34-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays

Chloroplasts er organelles i grønne planter ansvarlig for gjennomføring av mange viktige metabolske veier, spesielt fotosyntese. Chloroplasts, thylakoid membran systemet huser alle fotosynteseaktiviteten pigmentene, reaksjon center komplekser og de fleste av elektron bærere og er ansvarlig for lys-avhengige ATP syntese. Over 90% av chloroplast proteiner er kodet i kjernen, oversatt i stoffer, og deretter importeres til chloroplast. Ytterligere protein transport i eller over thylakoid membranen benytter en av fire translokasjon. Her beskriver vi en høy dekkevne metode for isolering av transport-kompetent thylakoids fra erter (Parlamentarisme sativum), samt transport analyser gjennom tre energi avhengig av cpTat, cpSec1 og cpSRP-mediert trasé. Disse metodene at eksperimenter vedrørende thylakoid protein lokalisering og transport energi mekanismer av protein translokasjon over biologiske membraner.

For å måle mengden av underlaget ble transportert, er det nyttig å inkludere én eller flere "prosent input" baner. 10% av den endelige transport reaksjonen uten thylakoids ble brukt for dataene nedenfor. Denne "prosent input" bidrar også til å visualisere størrelsen på forløper underlaget. Prosentandelen representerer en kjent, definert mengde substrat som å sammenligne transportert substrat mot og kan skaleres opp eller ned som nødvendig bruker først forberedt protein. I till...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays at JoVE.com

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering av fysiologisk aktiv Thylakoids og deres bruk i energi avhengig av Protein Transport analyser

Vi presenterer protokoller her for høy avkastning isolering av fysiologisk aktiv thylakoids og protein transport analyser for chloroplast twin arginine translokasjon (cpTat), sekretoriske (cpSec1) og signal anerkjennelse partikkel (cpSRP) stier.

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål om mekanismene og energiske proteintransport på tvers av kloroplastmembraner, samt plasseringen av proteiner innen plastider. Den største fordelen med denne teknikken for thylakoid protein målretting er at det gir full kontroll over thylakoid miljø under transport, inkludert temperatur, pH, ioniske forhold, og forløper konsentrasjoner. Begynn med å bløtlegge ca 55 gram erter i 400 milliliter destillert vann i tre timer.Så de gjennomvåte ertene i et plastbrett i jord, dekket med et tynt lag vermiculite, og vokse i ni til 15 dager som beskrevet i tekstprotokollen. På dagen for kloroplastisolering, lag en kontinuerlig tetthetsgradient ved å sentrifugere en blanding av 15 milliliter Percoll og 15 milliliter 2xGB buffer i en 15 milliliter polykarbonat høy hastighet sentrifuge rør på 30, 900 gs i en fast vinkel rotor i 30 minutter på fire grader Celsius med bremsen av. Deretter høster ca 25 gram ni til 15 dagers gamle ertskudd.Legg dem til 95 milliliter kald 1xGB buffer i en kjølt blender, med skjerpede blader. Og homogenisere. Filtrer denne blandingen gjennom minst to lag osteklu, plassert i en trakt over et kjølt beger.Sentrifuger filtratet ved hjelp av et 15 milliliter polykarbonat sentrifugerør i en svingende bøtterotor ved 3000 gs i fem minutter ved fire grader Celsius. Kast det overnaturlige og bruk en pensel til å forsiktig bruke pelleten i en milliliter på 1xGB. Deretter bruker du en glassstillingpipette til å forsiktig legge skjermen suspensjon på toppen av Percoll gradient.Sentrifuge den i en svingende bøtte rotor på 8000 gs i 10 minutter ved fire grader Celsius med bremsen av. Bruk en holdningpipette igjen forsiktig overføre det nedre grønne båndet som inneholder intakte kloroplaster til en frisk 50 milliliter polykarbonatrør og tilsett 30 milliliter 1xIB buffer. Sentrifuger røret i en svingende bøtterotor ved 1800 gs i fem minutter ved fire grader Celsius.Etter å ha kastet den overnaturlige, forsiktig resuspend pellet i en milliliter 1xIB med en pensel. Vask i 30 milliliter 1xIB og sentrifuge igjen under samme forhold. Resuspend pellet etter den endelige sentrifugering i en milliliter på 1xIB.For å bestemme klorofyllkonsentrasjon, bland 10 mikroliter med fullt resuspended kloroplaster med fem milliliter med 80% aceton. Filtrer gjennom et 180 mikrometer tykt filterpapir med 11 mikrometer porestørrelse og bestem deretter klorofyllkonsentrasjonen ved spektrofotometer. Fortynn kloroplastblandingen til ett mg per milliliter ved hjelp av kald 1xIB.For å begynne å isolere thylakoidene når stromal ekstrakt ikke er nødvendig, for eksempel cpTat transport, sentrifuge intakt kloroplaster i 1,5 milliliter rør i en svingende bøtte rotor på 1000 gs ved fire grader Celsius i seks minutter. Deretter kast den overnaturlige og resuspend pellet i hypotonisk lysis buffer for å oppnå ett mg per milliliter med en mikropipette. Inkuber på is i mørket med sporadisk blanding i 10 minutter.For å gjenopprette thylokoider, sentrifuge i en svingende bøtte rotor på 3, 200 gs ved fire grader Celsius i åtte minutter. Vask thylokoidene to ganger ved å gjenopplive pelleten med en til to milliliter lysisbuffer og deretter sentrifuging under samme forhold. Etter den endelige sentrifugeringen, resuspend pellet, i en milliliter av 1xIB buffer og bestemme klorofyllkonsentrasjonen i isolerte tyrolokoider ved hjelp av et spektrofotometer som tidligere demonstrert.For veier som krever stromal ekstrakt utvinning som CPSec1 og CPSRP eliquate 600 mikroliter isolerte kloroplaster i en svingende bøtte rotor og sentrifuge på 1000 gs i seks minutter ved fire grader Celsius. For kloroplastlyse suspenderer vi pelleten med 600 mikroliter hypotonisk lysisbuffer. Inkuber på is i mørket i 10 minutter med sporadisk blanding.Sentrifuger deretter rørene i en svingende bøtterotor ved 3, 200 gs i åtte minutter ved fire grader Celsius. For å redde stroma, overfør den lysegrønne til gul supernatant til et nytt mikrosentrigerrør og legg til et likt volum på 2x rå stromal buffer. For å vaske thylokoider, tilsett to volumer lysisbuffer og sentrifuge ved 3, 200 gs i åtte minutter ved fire grader Celsius.Resuspend pellet i 1xIB for å oppnå klorofyll konsentrasjon av ett mg per milliliter og sette til side på is for senere bruk i transportanalyser. Fjern restmembraner fra rå stroma ved å sentrifugere fortynnet rå stroma i en fast vinkelrotor ved 42 000 gs i 30 minutter ved fire grader Celsius. Deretter samler du 95% av volumet fra hvert rør og sørger for ikke å forstyrre den lille gule grønne pelleten, mens du noterer volumet tatt fra hvert rør.For å forberede konsentrert stromalekstrakt, samle de innsamlede supernativa. Bruk deretter en fire milliliter 30 kilodaltonmolekylær vekt cut-off konsentrator for å konsentrere ekstraktet fem ganger. For å analysere cpTat transport i en 1,5 milliliter rør på is bland de isolerte thylokoider til en endelig klorofyll konsentrasjon på 0,33 milligram per milliliter, fem millimolar ATP tilberedt i 1xIB, og åtte millimolar DTT forberedt i 1xIB.For å starte transporten, innføre substratprotein til transportblandingen. Utuk reaksjonen ved å belyse suspensjonen med 80 til 100 mikroeinstein per kvadratmeter per sekund fotosyntetisk aktiv stråling i 10 minutter ved romtemperatur. For å stoppe transportreaksjonen, fortynne suspensjonen åtte ganger med iskald 1xIB.Sentrifuge på 3, 200 gs i en mikro sentrifuge i fem minutter på fire grader Celsius å gjenopprette thylokoids. Etter å ha kastet det overnaturante, resuspend pellet i 120 mikroliter iskalde 1xIB. For å analysere CPSec1- eller PSRP-banene blandes følgende i et 1,5 milliliter rør på is.Thylakoider til en endelig klorofyllkonsentrasjon på 0,33 milligram per milliliter, 0,83 milligram per milliliter klorofyllekvivalenter av stromal ekstrakt, og fem millimolar ATP tilberedt i 1xIB. Ta reaksjonen opp til ønsket volum med iskald 1xIB og inkuber på is i 10 minutter. For å initiere transporten innføre 10% volum i volum av substrat protein til denne transportblandingen.Belyse med 80 til 100 mikroeinstein per kvadratmeter per sekund av fotosyntetisk aktiv stråling i 10 minutter ved romtemperatur. For å stoppe reaksjonen, fortynne suspensjonen åtte ganger med iskald 1xIB. Sentrifuge på 3, 200gs i en mikro sentrifuge i fem minutter på fire grader Celsius.Etter å ha kastet det overnaturante, resuspend pellet i 120 mikroliter iskalde 1xIB. For å fjerne restsubstrat som ikke er transportert, fordøye eksternt protein ved å tilsette seks mikroliter på to milligram per milliliter termolysin og 10 millimolar kalsiumklorid i 1xIB. Inkuber denne proteasereaksjonen på is i 40 minutter.Slukke protease ved å doble volumet med 25 millimolar EDTA i 1xIB. Sentrifuge på 3, 200 gs i en mikro sentrifuge i fem minutter på fire grader Celsius å gjenopprette thylokoids. Etter å ha fjernet det overnaturante, gjenforbruk gjenvunnet thylokoider i 120 mikroliter av fem milimolar EDTA i 1xIB, og overføre til en ny 1,5 milliliter tube.Etter sentrifuging igjen på 3, 200 gs i en mikro sentrifuge i fem minutter ved fire grader Celsius, kast supernatant og resuspend pellet i et passende volum av laemmli prøvebuffer, supplert med 10 millimolar EDTA. Legg prøvene i et kokende vannbad i 10 minutter. Fortsett å analysere eksemplene med SDS-siden.Transport av iOE17-protein gjennom cpTatbanen resulterte i et størrelsesskifte på to til tre kilodaltonn mellom det introduserte substratet og den modne bearbeidede formen. Dette skyldes spaltning av n terminal signal peptid indikerer en vellykket cpTat transport. Thermolysin behandling etterlater bare vellykket transportert og derfor proteus motstandsdyktig moden band.Transport av OE33-forløperen gjennom CPSec1-banen, resulterte i et størrelsesskifte i det modne substratet, og proteusbeskyttelse av det transporterte substratet. Innsetting av LHCP-forløperen i tylokoidmembranen via cpSRP-banen, evaluert gjennom termolysinfordøyelsen førte til et størrelsesskifte på 1,5 til to kilodaltonn. Dette indikerte vellykket membraninnsetting, da membranen beskytter onkelen til modne LHCP-nedbrytningsprodukt fra fullstendig proteolyse.Etter å ha sett denne videoen bør du ha en god forståelse av hvordan du isolerer thylokoider og analysetransportivitet gjennom energiavhengig cpTat, cpSec 1 og cpSRP-veier. Når mestret denne teknikken kan gjøres i tre til fire timer når utført riktig. Selv om det ikke er illustrert i denne videoen, holder vi vanligvis overhead lysene av i laboratoriet når isolere og arbeide med fotosyntologisk aktive kloroplaster og thylakoids.Mens du prøver denne prosedyren er det viktig å holde isolert kloroplast og thylakoids på fire grader Celsius. Husk å gjenbruke kloroplaster forsiktig i begynnelsen. Unngå å forstyrre Procoll-graderingen etter det første centrifucation-trinnet.I tillegg kan prosent input sample tilberedes parallelt med transportreaksjonene og kjøres på samme gel for å estimere substrattransporten. Ikke glem, at arbeid med radioaktive substrater krever samvittighetsfull håndtering og riktig PPE. Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen proteinmålretting for å utforske energisk, kinetikk og unike mekanismer som styrer proteintransport over thylakoid membraner.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metode for Isolering av høyt renset RNA fra frø for bruk i Quantitative Analysis transcriptome

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Syntese av 1,2-Azaborines og utarbeidelse av deres protein komplekser med T4 Lysozyme Mutants

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analysere superkomplekser av den mitokondriale elektrontransportkjede med innfødte elektroforese, in-gel-analyser og elektrolysering

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokjemiske og strukturelle karakteristikk av karbohydrater Transport substrat-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolasjon og respiratoriske målinger av mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID-Proteomic analyse av kontekstavhengige Protein komplekser i sitt opprinnelige mobilnettet miljø

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Bruk av rekombinant Fusion proteiner i en fluorescerende Protease analysen plattform og deres i-gel-Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse av proteinfolding, Transport og nedbrytning i levende celler av radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

In vitro Ubiqitinering og Deubiquitination analyser av Nucleosomal Histoner

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anvendelse av Biolayer laboratoriefasiliteter (BLI) for å studere protein-protein interaksjoner i transkripsjon

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...