Name: isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays
Uploaded: 2018-09-28T14:45:00
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Este manuscrito foi preparado com financiamento pela divisão de ciências químicas, Geociências e Biociências, 408 escritório de ciências básicas da energia do departamento de energia através DE Grant-SC0017035

1. materiais iniciais
<ol><li>Aproximadamente 55 g de ervilhas de molho por 3 horas em 400 mL de água destilada e em seguida semear em uma bandeja plástica (35 cm x 20 cm x 6 cm) em solo coberto com fina camada de vermiculita.</li>
	<li>Cresce a bandeja de ervilhas a 20 ° C, sob o ciclo claro/escuro (50 µE/m2s) de 12/12 h por 9 a 15 dias.</li>
	<li>Prepare o substrato da proteína de acordo com um método preferido. Nota: Temos preparado substratos de proteínas usando uma variedade de métodos, inclu...

<ol>
	<li>Ellis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+protein+synthesis:+principles+and+problems.">Chloroplast protein synthesis: principles and problems.</a> Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).</li><li>Li, H. -. m., Chiu, C. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+transport+into+chloroplasts.">Protein transport into chloroplasts.</a> Annual review of plant biology. 61, (2010).</li><li>Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-specific+energy+requirements+for+protein+transport+across+or+into+thylakoid+membranes.+Two+lumenal+proteins+are+transported+in+the+absence+of+ATP.">Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).</li><li>Skalitzky, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastids+contain+a+second+sec+translocase+system+with+essential+functions.">Plastids contain a second sec translocase system with essential functions.</a> Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).</li><li>Dabney-Smith, C., Storm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plastid Biology. , 271-289 (2014).</li><li>Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+&amp;#34;assisted&amp;#34;+and+&amp;#34;spontaneous&amp;#34;+mechanisms+for+the+insertion+of+polytopic+chlorophyll-binding+proteins+into+the+thylakoid+membrane.">Distinct &amp;#34;assisted&amp;#34; and &amp;#34;spontaneous&amp;#34; mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).</li><li>Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. h. l. o. r. o. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChloroP,+a+neural+network-based+method+for+predicting+chloroplast+transit+peptides+and+their+cleavage+sites.">ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites.</a> Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).</li><li>Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locating+proteins+in+the+cell+using+TargetP,+SignalP+and+related+tools.">Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools.</a> Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).</li><li>Ling, Q., Jarvis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants.">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).</li><li>Lo, S. M., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Photosynthesis Research Protocols. , 139-157 (2011).</li><li>Vernon, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+chlorophylls+and+pheophytins+in+plant+extracts.">Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts.</a> Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).</li><li>Knott, T. G., Robinson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secA+inhibitor,+azide,+reversibly+blocks+the+translocation+of+a+subset+of+proteins+across+the+chloroplast+thylakoid+membrane.">The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).</li><li>Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SecA+homolog+in+protein+transport+within+chloroplasts:+evidence+for+endosymbiont-derived+sorting.">SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting.</a> Science. 266 (5186), 796-798 (1994).</li><li>Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+cDNA+for+pea+chloroplast+SecA+Evolutionary+conservation+of+the+bacterial-type+SecA-dependent+protein+transport+within+chloroplasts.">Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts.</a> FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).</li><li>Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-assisted+post-translational+transport+of+plastidic+type+I+signal+peptidase+1.">Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).</li><li>Luirink, J., Sinning, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRP-mediated+protein+targeting:+structure+and+function+revisited.">SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).</li><li>Yuan, J., Henry, R., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+factor+plays+an+essential+role+in+protein+integration+into+thylakoids+that+cannot+be+replaced+by+unfolding+or+by+heat+shock+protein.">Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein.</a> Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).</li><li>Tjalsma, H., van Dijl, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+consensus+prediction+of+protein+retention+in+a+bacterial+membrane.">Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane.</a> Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).</li><li>Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Facile+Reporter+System+for+the+Experimental+Identification+of+Twin-Arginine+Translocation+(Tat)+Signal+Peptides+from+All+Kingdoms+of+Life.">A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life.</a> Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).</li><li>Yuan, J., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastocyanin+and+the+33-kDa+subunit+of+the+oxygen-evolving+complex+are+transported+into+thylakoids+with+similar+requirements+as+predicted+from+pathway+specificity.">Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).</li><li>Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., B&#252;chel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transversal+and+lateral+exciton+energy+transfer+in+grana+thylakoids+of+spinach.">Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach.</a> Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).</li><li>Frielingsdorf, S., Jakob, M., Kl&#246;sgen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+pool+of+TatA+promotes+Tat-dependent+protein+transport+across+the+thylakoid+membrane.">A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).</li><li>Tu, C. -. J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+FtsY,+chloroplast+signal+recognition+particle,+and+GTP+are+required+to+reconstitute+the+soluble+phase+of+light-harvesting+chlorophyll+protein+transport+into+thylakoid+membranes.">Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).</li></ol>

Isolamento de cloroplasto e tilacoides
Quebra excessiva pode resultar em cloroplasto pobre isolamento e, portanto, pobre tilacoides rendimento após a separação do degradê. É melhor homogeneizar o tecido colhido suavemente, garantindo que todo o material está submersa antes de mesclagem e pulsação em 15 ciclos s até totalmente homogeneizado. Se necessário, use vários tiros mais curtos de mistura com menos tecido em cada rodada.
Todos os materiais que entram e...

Quase todas as máquinas proteicas responsável pela função de cloroplasto adequada devem ser translocadas no citosol1. Os envelopes do cloroplasto, substratos de proteína são importados através do translocon da membrana exterior (TOC) e o translocon da membrana interna (TIC)2. Mais direcionamento para os tilacoides membrana e lúmen ocorre através do gêmeo arginina translocação (cpTat)3, a secretora (cpSec1)4, o sinal de reconhecimento das partículas (cpSRP)5e as vias de inserção espontânea6 . Um método para a isolação de alto rendimento de cloroplastos fisiologicamente ativos e membranas tilacoides é necessário medir a energética e cinética de um evento de translocação, compreender os mecanismos de transporte diversa em cada percurso e localizar uma substrato específico da proteína de interesse para qualquer um dos seis compartimentos distintos do cloroplasto.
O isolamento das membranas do cloroplasto oferece melhor experimental controle sobre fatores ambientais (tais como concentrações de sal e substrato, a presença de ATP/GTP e condições de pH) que afetam a medição da energética de transporte e cinética. Este ambiente em vitro presta-se à exploração dos detalhes mecanicistas de translocação, pelas mesmas razões. Além disso, enquanto o software preditivo para localização de proteínas cloroplasto melhorou7,8, ensaios de transporte em vitro fornecem um método mais rápido para confirmação sobre baseado em microscopia fluorescentes ensaios que exigem uma etiqueta fluorescente geneticamente codificada, planta de transformação e/ou anticorpos específicos. Aqui, apresentamos protocolos para isolamentos de cloroplasto e tilacoides de ervilhas (Pisum sativum), bem como para os ensaios de transporte otimizados para cada uma das vias de translocação de tilacoides de energia-dependente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1936px;" width="1936">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Pisum sativum seeds</td>
			<td style="width:252px;">Seedway LLC, Hall, NY</td>
			<td style="width:292px;">8686 - Little Marvel</td>
			<td style="width:1068px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, Gibbstown, NJ</td>
			<td>475855-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">80% Acetone</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blender with sharpened blades</td>
			<td>Waring Commercial</td>
			<td>BB155S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polytron 10-35</td>
			<td>Fischer Sci</td>
			<td>13-874-617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>GE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beckman J2-MC with JA 20 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>8043-30-1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall RC-5B with HB-4 rotor</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>8327-30-1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>12/3/83</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM MgATP in 1xIB</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>74804-12-9</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermolysin in 1xIB (2mg/mL)</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>9073-78-3</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K-Tricine</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorbitol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>50-70-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manganese Chloride</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>13446-34-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays

Cloroplastos são as organelas em plantas verdes responsáveis pela realização de inúmeras vias metabólicas essenciais, mais notavelmente a fotossíntese. Dentro do cloroplasto, o sistema de membrana tilacoides abriga todos os pigmentos fotossintéticos, complexos de centro de reação e a maioria dos transportadores de elétrons e é responsável pela síntese de ATP de luz-dependente. Mais de 90% das proteínas do cloroplasto são codificados no núcleo, traduzido no citoplasma e posteriormente importada para o cloroplasto. Transporte de proteína adicional em ou através da membrana tilacoides utiliza uma das quatro vias de translocação. Aqui, descrevemos um método de alto rendimento para isolamento de transporte-competente contém de ervilhas (Pisum sativum), juntamente com ensaios de transporte através de três cpTat de energia-dependente, cpSec1 e vias mediada por cpSRP. Estes métodos permitem experiências relacionadas com a localização da proteína tilacoides, transporte energética e os mecanismos de translocação de proteínas através das membranas biológicas.

Para medir a quantidade de substrato transportado com sucesso, é útil incluir uma ou mais faixas de "entrada por cento". Para os dados apresentados a seguir, utilizou-se 10% da reação final transporte sem contém. Esta entrada"por cento" também ajuda a visualizar o tamanho do substrato precursor. O percentual representa uma quantidade conhecida, definida de substrato com o qual comparar transportado substrato contra e pode ser escalado a cima ou para baixo conforme necessário usando...

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Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolamento de fisiologicamente ativo contém e a sua utilização em ensaios de transporte de energia-dependente da proteína

Apresentamos os protocolos neste documento para isolamento de alto rendimento de fisiologicamente ativo contém e ensaios de transporte da proteína para a translocação de arginina gêmeo cloroplasto (cpTat), secretora (cpSec1) e percursos de partícula (cpSRP) de reconhecimento de sinal.

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre os mecanismos e energéticos do transporte de proteínas através de membranas cloroplastas, bem como a localização de proteínas dentro de plastídeos. A principal vantagem desta técnica para a segmentação da proteína thylakoid é que ela permite o controle completo do ambiente da timoide durante o transporte, incluindo temperatura, pH, condições iônicas e concentrações precursoras. Comece absorvendo aproximadamente 55 gramas de ervilhas em 400 mililitros de água destilada por três horas.Semear as ervilhas encharcadas em uma bandeja de plástico no solo, coberta com uma fina camada de vermiculite, e crescer por nove a 15 dias, como descrito no protocolo de texto. No dia do isolamento do cloroplasto, prepare um gradiente de densidade contínua centrifugando uma mistura de 15 mililitros de Percoll e 15 mililitros de tampão de 2xGB em um tubo de centrífuga de alta velocidade de 15 mililitros a 30,900 gs em um rotor de ângulo fixo por 30 minutos a quatro graus Celsius com o freio desligado. Em seguida, colher aproximadamente 25 gramas de nove a 15 dias de pea shoots.Adicione-os a 95 mililitros de tampão frio de 1xGB em um liquidificador refrigerado, com lâminas afiadas. E homogeneizar. Filtre essa mistura através de um mínimo de duas camadas de pano de queijo, colocado em um funil sobre um béquer resfriado.Centrifugar o filtrado usando um tubo de centrífuga de 15 mililitros de policarbonato em um rotor de balde balançando a 3.000 gs por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e use um pincel para resuspensar suavemente a pelota em um mililitro de 1xGB. Depois disso, use uma pipeta de postura de vidro para cuidadosamente camada a suspensão da tela em cima do gradiente Percoll.Centrifuá-lo em um rotor de balde balançando a 8.000 gs por 10 minutos a quatro graus Celsius com o freio desligado. Usando uma pipeta de postura novamente transfira cuidadosamente a faixa verde inferior contendo cloroplastos intactos em um tubo de policarbonato fresco de 50 mililitros e adicione 30 mililitros de tampão 1xIB. Centrifugar o tubo em um rotor de balde balançando a 1.800 gs por cinco minutos a quatro graus Celsius.Depois de descartar o supernascimento, resuspenque suavemente a pelota em um mililitro de 1xIB com um pincel. Lave em 30 mililitros de 1xIB e centrífuga novamente sob as mesmas condições. Resuspend a pelota após a centrifugação final em um mililitro de 1xIB.Para determinar a concentração de clorofila, misture 10 microliters de cloroplastos totalmente resuspended com cinco mililitros de 80% de acetona. Filtre através de um papel filtro de 180 micrômetros de espessura com tamanho de 11 micrômetros e, em seguida, determine a concentração de clorofila por espectrofotômetro. Diluir a mistura de cloroplasto a um miligrama por mililitro usando 1xIB frio.Para começar a isolar as tireilaliteides quando o extrato estrommal não é necessário, como o transporte cpTat, cloretos intactos centrífugas em tubos de 1,5 mililitro em um rotor de balde balançando a 1.000 gs a quatro graus Celsius por seis minutos. Depois disso, descarte o supernascer e resuspenque a pelota no tampão de lise hipotônica para alcançar um miligrama por mililitro com uma micropipette. Incubar no gelo no escuro com mistura ocasional por 10 minutos.Para recuperar as timocóidas, centrífuga em um rotor de balde balançando a 3.200 gs a quatro graus Celsius por oito minutos. Lave as timocóidas duas vezes, reutilizando a pelota com um a dois mililitros de tampão de lise e, em seguida, centrifugando sob as mesmas condições. Após a centrifugação final, resuspenque a pelota, em um mililitro de tampão 1xIB e determine a concentração de clorofila em tirolokoides isolados usando um espectrofotômetro como demonstrado anteriormente.Para caminhos que requerem recuperação de extratos estrômicos, como CPSec1 e CPSRP eliquate 600 microliters de cloroplastos isolados em um rotor de balde balançando e centrífuga a 1.000 gs por seis minutos a quatro graus Celsius. Para a lise cloroplasta, suspendemos a pelota com 600 microliters de tampão de hipotônica de lise. Incubar no gelo no escuro por 10 minutos com mistura ocasional.Em seguida, centrifugar os tubos em um rotor de balde balançando a 3.200 gs por oito minutos a quatro graus Celsius. Para salvar o estroma, transfira o verde claro para o supernatante amarelo para um novo tubo de micro centrífuga e adicione um volume igual de 2x de tampão estrommal bruto. Para lavar as timocóidas, adicione dois volumes de tampão de lise e centrífuga a 3.200 gs por oito minutos a quatro graus Celsius.Resuspend a pelota em 1xIB para obter concentração de clorofila de um miligrama por mililitro e reserve no gelo para uso posterior em ensaios de transporte. Remova as membranas residuais do estroma bruto centrifugando o estroma bruto diluído em um rotor de ângulo fixo a 42.000 gs por 30 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, colecione 95% do volume de cada tubo certificando-se de não perturbar a pequena pelota verde amarela, observando o volume retirado de cada tubo.Para preparar o extrato estrommal concentrado, reconte as supernantes coletadas. Em seguida, use um concentrador de corte de peso molecular de 4 mililitros de 30 kilodalton para concentrar o extrato cinco vezes. Para avaliar o transporte cpTat em um tubo de 1,5 mililitro no gelo misture as thylokoids isoladas a uma concentração final de clorofila de 0,33 miligramas por mililitro, cinco MILimil ATP preparado em 1xIB e oito milimilas DTT preparados em 1xIB.Para iniciar o transporte, introduza a proteína do substrato à mistura de transporte. Conduza a reação iluminando a suspensão com 80 a 100 microeínsteins por metro quadrado por segundo de radiação fotossintética ativa por 10 minutos à temperatura ambiente. Para parar a reação de transporte, diluir a suspensão oito vezes com gelo frio 1xIB.Centrífuga a 3.200 gs em uma micro centrífuga por cinco minutos a quatro graus Celsius para recuperar timokoides. Depois de descartar o supernascer, resuspenque a pelota em 120 microliters de gelo frio 1xIB. Para avaliar as vias CPSec1 ou PSRP, misture as seguintes em um tubo de 1,5 mililitro no gelo.Thylakoids para uma concentração final de clorofila de 0,33 miligramas por mililitro, 0,83 miligramas por mililitro equivalentes de clorofila de extrato estrommal, e cinco MILimola ATP preparado em 1xIB. Leve a reação até o volume desejado com gelo frio 1xIB e incubar no gelo por 10 minutos. Para iniciar o transporte introduza 10% de volume por volume de proteína de substrato a esta mistura de transporte.Ilumine com 80 a 100 microeínsteinos por metro quadrado por segundo de radiação fotossintética ativa por 10 minutos à temperatura ambiente. Para parar a reação, diluir a suspensão oito vezes com gelo frio 1xIB. Centrífuga a 3.200gs em uma micro centrífuga por cinco minutos a quatro graus Celsius.Depois de descartar o supernascer, resuspenque a pelota em 120 microliters de gelo frio 1xIB. Para remover o substrato residual que não foi transportado, digerir proteína externa adicionando seis microlitadores de dois miligramas por termolysina mililitro e cloreto de cálcio de 10 mililitros em 1xIB. Incubar esta reação protease no gelo por 40 minutos.Sacie a protease dobrando o volume com 25 mililitros EDTA em 1xIB. Centrífuga a 3.200 gs em uma micro centrífuga por cinco minutos a quatro graus Celsius para recuperar timokoides. Depois de remover o supernascer, resuspend recuperou thylokoids em 120 microliters de cinco milimolar EDTA em 1xIB, e transferir para um novo tubo de 1,5 mililitro.Depois de centrifugar novamente a 3.200 gs em uma micro centrífuga por cinco minutos a quatro graus Celsius, descarte o supernascer e resuspenda a pelota em um volume apropriado de tampão de laemmli, complementado com 10 mililitros EDTA. Coloque as amostras em um banho de água fervente por 10 minutos. Prossiga para analisar as amostras pela página da SDS.O transporte da proteína iOE17 através da via cpTat resultou em uma mudança de tamanho de dois a três kilodaltons entre o substrato introduzido e a forma processada madura. Isso se deve ao decote do peptídeo de sinal n terminal indicando um transporte cpTat bem sucedido. O tratamento da termolise deixa apenas a banda madura transportada com sucesso e, portanto, resistente ao proteus.O transporte do precursor OE33 através da via CPSec1 resultou em uma mudança de tamanho no substrato maduro, e proteção proteus do substrato transportado. A inserção do precursor LHCP na membrana thylokoide através da via cpSRP, avaliada através da digestão termolysina levou a uma mudança de tamanho de 1,5 para dois kilodaltons. Isso indicou inserção de membrana bem sucedida, pois a membrana protege o produto de degradação LHCP maduro da proteólise completa.Depois de assistir a este vídeo você deve ter uma boa compreensão de como isolar thylokoids e avaliar a vias de cpTat, cpSec 1 e cpSRP. Uma vez dominada esta técnica pode ser feita em três a quatro horas quando realizada corretamente. Embora não ilustrado neste vídeo, geralmente mantemos as luzes aéreas apagadas no laboratório ao isolar e trabalhar com cloroplastos e tireoides fotosinteticamente ativos.Ao tentar este procedimento é importante manter cloroplasto isolado e tireoides a quatro graus Celsius. Lembre-se de resuspend cloroplastos suavemente no início. Evite perturbar o gradiente Procoll após a primeira etapa de centrífuga.Além disso, a amostra de entrada percentual pode ser preparada em paralelo com as reações de transporte e executada no mesmo gel para estimar o transporte do substrato. Não se esqueça que trabalhar com substratos radioativos requer manuseio consciente e EPI adequado. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da proteica para explorar a energia, cinética e mecanismos únicos que regem o transporte de proteínas através de membranas de tirokoóide.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Um método eficiente para o isolamento de ARN altamente purificada a partir de sementes para Utilização em Análise Quantitativa do transcriptoma

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Bioquímica

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Síntese de 1,2-Azaborines e preparação dos seus complexos de proteínas com T4 lisozima Mutantes

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analisando supercomplexos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial com eletroforese nativa, ensaios em gel e eletroeluição

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Caracterização bioquímica e estrutural do carboidrato transporte proteína-substrato-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolamento e medições respiratória de mitocôndrias de Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteomic análise de complexos de proteínas específicas do contexto em seu ambiente nativo do celular

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Utilização de proteínas recombinantes de fusão em uma plataforma de ensaio de Protease fluorescente e sua renaturalização em-gel

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Análise de proteínas, transporte e degradação em células vivas por pulso radioativo Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Ensaios de Ubiquitinação e Deubiquitinação in vitro de histonas Nucleossomal

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Aplicação de interferometria Biolayer (BLI) para o estudo de interações proteína-proteína em transcrição

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...