Name: isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays
Uploaded: 2018-09-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays at JoVE.com

Этот манускрипт был подготовлен при финансовой поддержке Отдела химических наук, наук о земле и Biosciences, 408 Управление основных энергетических наук Департамента энергетики США через Grant де-SC0017035

1. первоначальные материалы
<ol><li>Замочите приблизительно 55 г гороха на 3 часа в 400 мл дистиллированной воды и затем посеять в пластиковый лоток (35 см x 20 см x 6 см) в почве, покрытые тонким слоем вермикулита.</li>
	<li>Растут лоток горох при 20 ° C под 12/12 h Светлый/темный (50 µE/м2с) цикл для 9-15 дн?...

<ol>
	<li>Ellis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+protein+synthesis:+principles+and+problems.">Chloroplast protein synthesis: principles and problems.</a> Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).</li><li>Li, H. -. m., Chiu, C. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+transport+into+chloroplasts.">Protein transport into chloroplasts.</a> Annual review of plant biology. 61, (2010).</li><li>Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-specific+energy+requirements+for+protein+transport+across+or+into+thylakoid+membranes.+Two+lumenal+proteins+are+transported+in+the+absence+of+ATP.">Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).</li><li>Skalitzky, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastids+contain+a+second+sec+translocase+system+with+essential+functions.">Plastids contain a second sec translocase system with essential functions.</a> Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).</li><li>Dabney-Smith, C., Storm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plastid Biology. , 271-289 (2014).</li><li>Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+&amp;#34;assisted&amp;#34;+and+&amp;#34;spontaneous&amp;#34;+mechanisms+for+the+insertion+of+polytopic+chlorophyll-binding+proteins+into+the+thylakoid+membrane.">Distinct &amp;#34;assisted&amp;#34; and &amp;#34;spontaneous&amp;#34; mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).</li><li>Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. h. l. o. r. o. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChloroP,+a+neural+network-based+method+for+predicting+chloroplast+transit+peptides+and+their+cleavage+sites.">ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites.</a> Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).</li><li>Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locating+proteins+in+the+cell+using+TargetP,+SignalP+and+related+tools.">Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools.</a> Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).</li><li>Ling, Q., Jarvis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants.">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).</li><li>Lo, S. M., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Photosynthesis Research Protocols. , 139-157 (2011).</li><li>Vernon, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+chlorophylls+and+pheophytins+in+plant+extracts.">Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts.</a> Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).</li><li>Knott, T. G., Robinson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secA+inhibitor,+azide,+reversibly+blocks+the+translocation+of+a+subset+of+proteins+across+the+chloroplast+thylakoid+membrane.">The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).</li><li>Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SecA+homolog+in+protein+transport+within+chloroplasts:+evidence+for+endosymbiont-derived+sorting.">SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting.</a> Science. 266 (5186), 796-798 (1994).</li><li>Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+cDNA+for+pea+chloroplast+SecA+Evolutionary+conservation+of+the+bacterial-type+SecA-dependent+protein+transport+within+chloroplasts.">Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts.</a> FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).</li><li>Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-assisted+post-translational+transport+of+plastidic+type+I+signal+peptidase+1.">Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).</li><li>Luirink, J., Sinning, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRP-mediated+protein+targeting:+structure+and+function+revisited.">SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).</li><li>Yuan, J., Henry, R., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+factor+plays+an+essential+role+in+protein+integration+into+thylakoids+that+cannot+be+replaced+by+unfolding+or+by+heat+shock+protein.">Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein.</a> Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).</li><li>Tjalsma, H., van Dijl, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+consensus+prediction+of+protein+retention+in+a+bacterial+membrane.">Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane.</a> Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).</li><li>Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Facile+Reporter+System+for+the+Experimental+Identification+of+Twin-Arginine+Translocation+(Tat)+Signal+Peptides+from+All+Kingdoms+of+Life.">A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life.</a> Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).</li><li>Yuan, J., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastocyanin+and+the+33-kDa+subunit+of+the+oxygen-evolving+complex+are+transported+into+thylakoids+with+similar+requirements+as+predicted+from+pathway+specificity.">Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).</li><li>Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., B&#252;chel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transversal+and+lateral+exciton+energy+transfer+in+grana+thylakoids+of+spinach.">Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach.</a> Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).</li><li>Frielingsdorf, S., Jakob, M., Kl&#246;sgen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+pool+of+TatA+promotes+Tat-dependent+protein+transport+across+the+thylakoid+membrane.">A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).</li><li>Tu, C. -. J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+FtsY,+chloroplast+signal+recognition+particle,+and+GTP+are+required+to+reconstitute+the+soluble+phase+of+light-harvesting+chlorophyll+protein+transport+into+thylakoid+membranes.">Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).</li></ol>

Изоляция хлоропластов и тилакоидов
Чрезмерная поломки может привести в бедных хлоропласта изоляции и, таким образом, бедных тилакоидов выход после разделения в градиенте. Это лучше для гомогенизации собранного ткань мягко путем обеспечения того, чтобы все материалы погр...

Почти все из белковых техники отвечает за надлежащее хлоропласта функция должна перемещен из цитозоль1. В хлоропласте конверты белковых субстратов импортируются через translocon внешней мембраны (TOC) и translocon внутренняя мембрана (TIC)2. Дальнейшей ориентации тилакоидной мембраны и Люмене происходит через Твин аргинин транслокация (cpTat)3, секреторную (cpSec1)4, сигнал признание частиц (cpSRP)5и спонтанное вставки пути6 . Метод для изоляции высокодоходные физиологически активных хлоропластов и тилакоидной мембраны для измерения энергетики и кинетика транслокации события, чтобы понять различные транспортные механизмы в каждом пути и для локализации особое белкового субстрата, представляющие интерес для любого из шести отдельных отсеков хлоропластов.
Изоляция мембраны из хлоропласта предлагает более экспериментальный контроль над экологических факторов (например, концентрации соли и субстрат, присутствие СПС/гтп и рН условий), которые влияют на измерение энергетики транспорта и Кинетика. Эта среда в vitro поддается исследованию механистический деталей транслокации по тем же причинам. Кроме того хотя интеллектуального программного обеспечения для локализации хлоропласта белков улучшилась7,8, в пробирке анализов транспорта обеспечивают быстрый метод для подтверждения над микроскопии основанные флуоресцентные анализов требуют генетически закодированный флуоресцентные метки, трансформации растений и/или специфических антител. Здесь мы представляем протоколы хлоропластов и тилакоидов изоляции от горох (Pisum sativum), а также для транспорта анализов, оптимизированы для каждого пути транслокации энергии зависимых тилакоидов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1936px;" width="1936">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Pisum sativum seeds</td>
			<td style="width:252px;">Seedway LLC, Hall, NY</td>
			<td style="width:292px;">8686 - Little Marvel</td>
			<td style="width:1068px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, Gibbstown, NJ</td>
			<td>475855-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">80% Acetone</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blender with sharpened blades</td>
			<td>Waring Commercial</td>
			<td>BB155S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polytron 10-35</td>
			<td>Fischer Sci</td>
			<td>13-874-617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>GE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beckman J2-MC with JA 20 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>8043-30-1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall RC-5B with HB-4 rotor</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>8327-30-1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>12/3/83</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM MgATP in 1xIB</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>74804-12-9</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermolysin in 1xIB (2mg/mL)</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>9073-78-3</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K-Tricine</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorbitol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>50-70-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manganese Chloride</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>13446-34-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays

Хлоропластов являются органеллы в зеленых растений, ответственная за проведение многочисленных важнейших метаболических путей, прежде всего фотосинтеза. В хлоропластах тилакоидной мембраны системы дома фотосинтетических пигментов, реакция центра комплексов и большинство носителей электронов, а отвечает за синтез АТФ светозависимой. Свыше 90% белков хлоропласта кодируются в ядре, переведены в цитозоле и впоследствии импортирован хлоропластов. Дальнейший перенос белков в или поперек тилакоидной мембраны использует один из четырех транслокации пути. Здесь мы описываем высокодоходный метод для изоляции транспорта компетентных тилакоидов из гороха (Pisum sativum), наряду с транспорта анализов через три энергии зависимой cpTat, cpSec1 и cpSRP опосредованного пути. Эти методы позволяют эксперименты, касающиеся тилакоидных белков локализации, энергетика, транспорт и механизмы транслокации белка через биологические мембраны.

Чтобы оценить количество субстрата успешно доставлены, полезно включить один или более полос «процент ввода». Для данных, представленных ниже был использован 10% окончательного транспорта реакции без тилакоидов. Этот «процент ввода» также помогает визуализировать Ра...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays at JoVE.com

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Изоляция физиологически активных тилакоидов и их использования в энергии зависимых белков транспорт анализов

Мы представляем здесь протоколы изоляции высокодоходные физиологически активных тилакоидов и анализов транспортного белка для хлоропластов Твин аргинин транслокация (cpTat), секреторную (cpSec1) и сигнал признания частиц (cpSRP) пути.

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся механизмов и энергии транспортировки белка через хлоропластовые мембраны, а также расположение белков в пластидах. Основным преимуществом этого метода для таргетинга тилакоида белка является то, что он позволяет осуществлять полный контроль над окружающей средой тилакоида во время транспортировки, включая температуру, рН, ионные условия и концентрации прекурсоров. Начните с замачивания примерно 55 граммов гороха в 400 миллилитров дистиллированной воды в течение трех часов.Посеять пропитанный горох в пластиковый лоток в почве, покрытый тонким слоем вермикулита, и расти в течение девяти-15 дней, как описано в текстовом протоколе. В день изоляции хлоропласта подготовьтесь к градиенту непрерывной плотности, центрифугировать смесь из 15 миллилитров Percoll и 15 миллилитров буфера 2xGB в 15 миллилитровом поликарбонатной высокой скорости центрифугной трубки на 30 900 г в роторе с фиксированным углом в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия с выключенным тормозом. Затем урожай примерно 25 граммов от девяти до 15 дней побеги гороха.Добавьте их в 95 миллилитров холодного буфера 1xGB в охлажденном блендере, с заточенными лезвиями. И гомогенизировать. Фильтр этой смеси через минимум два слоя сыра ткань, помещенная в воронку над охлажденным стаканом.Центрифуга фильтрата с использованием 15 миллилитров поликарбонатной центрифуги трубки в размахивая ротор ведро на 3000 г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию. Откажитесь от супернатанта и используйте кисть, чтобы аккуратно повторно использовать гранулы в один миллилитр 1xGB. После этого используйте стеклянную позу пипетки, чтобы тщательно слой подвески экрана на верхней части градиента Percoll.Центрифуга его в размахивая ротором ведро на 8000 г в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию с торможением. Используя позу пипетки снова тщательно передать нижнюю зеленую полосу, содержащую нетронутые хлоропласты в свежие 50 миллилитров поликарбонатной трубки и добавить 30 миллилитров буфера 1xIB. Центрифуга трубки в размахивая ротор ведро на 1800 г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию.После отказа от супернатанта, аккуратно повторно помесить гранулы в один миллилитр 1xIB с кистью. Вымойте в 30 миллилитров 1xIB и центрифуги снова при тех же условиях. Повторное производство гранул после окончательной центрифугации в один миллилитр 1xIB.Для определения концентрации хлорофилла смешайте 10 микролитров полностью рсюпенных хлоропластов с пятью миллилитров 80%ацетона. Фильтр через фильтровальную бумагу толщиной 180 микрометров с размером 11 микрометров, а затем определить концентрацию хлорофилла по спектрофотометру. Разбавить смесь хлоропласта до одного миллиграмма на миллилитр с помощью холодного 1xIB.Чтобы начать изолировать тилакоидов, когда стромальный экстракт не является необходимым, таких как cpTat транспорта, центрифуги нетронутыми хлоропластов в 1,5 миллилитров труб в размахивая ротор ведро на 1000 г при четырех градусах Цельсия в течение шести минут. После этого, отбросить супернатант и повторно гранулы в гипотонический буфер лиза для достижения одного миллиграмма на миллилитр с micropipette. Инкубировать на льду в темноте с редким смешивания в течение 10 минут.Чтобы восстановить тилокоиды, центрифуга в размахивая ротором ведро на 3200 г при четырех градусах по Цельсию в течение восьми минут. Вымойте тилокоиды дважды, повторно поместив гранулы с одного до двух миллилитров буфера лиза, а затем центрифугирования в тех же условиях. После окончательной центрифугации, resuspend гранулы, в один миллилитр 1xIB буфера и определить концентрацию хлорофилла в изолированных тилокоидов с помощью спектрофотометра, как это было ранее продемонстрировано.Для путей, которые требуют стромального восстановления экстракта, таких как CPSec1 и CPSRP eliquate 600 микролитров изолированных хлоропластов в размахивая ротора ведро и центрифуги на 1000 г в течение шести минут при четырех градусах по Цельсию. При хлоропластовом лизе мы приостанавливаем гранулы 600 микролитров гипотонического лиза буфера. Инкубировать на льду в темноте в течение 10 минут с случайным смешивания.Затем центрифуга труб в размахивая ротор ведро на 3200 г в течение восьми минут при четырех градусах по Цельсию. Чтобы сохранить строму, перенесите светло-зеленый в желтый супернатант в новую микро-центрифугу трубки и добавить равный объем 2x сырой стромальный буфер. Чтобы вымыть тилокоиды, добавьте два тома буфера лиза и центрифугу при 3200 г в течение восьми минут при четырех градусах Цельсия.Повторное использование гранул в 1xIB для достижения концентрации хлорофилла в один миллиграмм на миллилитр и отложить на лед для более длительного использования в транспортных анализах. Удалите остаточные мембраны из сырой стромы путем центрифугирования разбавленной сырой стромы в роторе с фиксированным углом при 42 000 г в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Затем соберите 95% объема с каждой трубки убедившись, что не беспокоить небольшой желто-зеленый гранулы, при этом, унося объем, взятый из каждой трубки.Чтобы подготовить концентрированный стромальный экстракт, объединить собранные супернатанты. Затем используйте четырехми миллилитр 30 килодальтон молекулярный концентратор для разрезателя веса, чтобы сконцентрировать экстракт в пять раз. Для анализа транспорта cpTat в 1,5 миллилитровой трубке на льду смешивают изолированные тилокоиды до конечной концентрации хлорофилла 0,33 миллиграмма на миллилитр, пять миллимолярной АТФ, подготовленной в 1xIB, и восемь миллимолярной DTT, подготовленной в 1xIB.Чтобы инициировать транспортировку, ввемите в транспортную смесь субстратовый белок. Проводите реакцию, освещая подвеску 80-100 микроиенштейнами на квадратный метр в секунду фотосинтетически активного излучения в течение 10 минут при комнатной температуре. Чтобы остановить транспортную реакцию, разбавить подвеску восемь раз ледяным 1xIB.Центрифуга при 3200 г микро центрифуги в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия для восстановления тилокоидов. После отказа от супернатанта, повторное производство гранул в 120 микролитров ледяной 1xIB. Для анализа ПУТЕЙ CPSec1 или PSRP смешивают следующее в 1,5 миллилитровой трубке на льду.Тилакоиды к окончательной концентрации хлорофилла 0,33 миллиграмма на миллилитр, 0,83 миллиграмма на миллилитр хлорофилла эквиваленты стромального экстракта, и пять миллимолярный АТФ, подготовленный в 1xIB. Довнесите реакцию до нужного объема с ледяным холодом 1xIB и инкубировать на льду в течение 10 минут. Для инициирования транспортировки вводят 10%-ный объем по объему субстратного белка в эту транспортную смесь.Осветите с 80 до 100 microeinsteins в квадратный метр в секунду фотосинтетически активного излучения в течение 10 минут при комнатной температуре. Чтобы остановить реакцию, разбавьте подвеску восемь раз ледяным 1xIB. Центрифуга при 3 200г в микро центрифуге в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.После отказа от супернатанта, повторное производство гранул в 120 микролитров ледяной 1xIB. Чтобы удалить остаточный субстрат, который не был транспортирован, усваивает внешний белок, добавляя шесть микролитров по два миллиграмма на миллилитр термолизина и 10 миллимолярный хлорид кальция в 1xIB. Инкубировать эту реакцию protease на льду в течение 40 минут.Утолить протеазу, удвоив объем с 25 миллимолейной EDTA в 1xIB. Центрифуга при 3200 г микро центрифуги в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия для восстановления тилокоидов. После удаления супернатанта, resuspend восстановить тилокоиды в 120 микролитров из пяти milimolar EDTA в 1xIB, и перейти на новый 1,5 миллилитров трубки.После центрифугирования снова на 3, 200 г в микро центрифуге в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, отбросить супернатант и повторно гранулы в соответствующем объеме буфера образца laemmli, дополненный 10 миллимолярнов EDTA. Поместите образцы в кипящую ванну в течение 10 минут. Продолжить анализ образцов на странице SDS.Транспортировка белка iOE17 по пути cpTat привела к сдвигу размеров от двух до трех килодалтов между введенным субстратом и зрелой обработанной формой. Это связано с расщеплением пептида n терминального сигнала, указывающего на успешный транспорт cpTat. Термолизин лечение оставляет только успешно транспортируется и, следовательно, протеус устойчивы зрелой полосы.Транспортировка прекурсора OE33 по пути CPSec1 привела к сдвигу размеров зрелого субстрата и защите протеуса транспортного субстрата. Вставка прекурсора LHCP в мембрану тилокоида через путь CPSRP, оцененный через переваривание термолизина, привела к сдвигу размера от 1,5 до двух килодальтонов. Это указывает на успешную мембранную вставку, так как мембрана защищает неохватитный зрелый продукт деградации LHCP от полного протеолиза.После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее понимание того, как изолировать тилокоиды и анализа транзистории через энергозависимых cpTat, cpSec 1 и CPSRP путей. После освоения этот метод может быть сделано в течение трех-четырех часов при правильном исполнении. Хотя не иллюстрируется в этом видео мы обычно держать накладные огни выключены в лаборатории при изоляции и работы с фотосинтетически активных хлоропластов и тилакоидов.При попытке этой процедуры важно сохранить изолированные хлоропласты и тилакоиды при четырех градусах Цельсия. Не забудьте повторно хлоропласты мягко в начале. Избегайте нарушений градиента Procoll после первого шага центрифугации.Кроме того, процент входной выборки может быть подготовлен параллельно с транспортными реакциями и работать на том же геле для оценки транспорта субстрата. Не забывайте, что работа с радиоактивными субстратами требует добросовестного обращения и надлежащего СИЗ. После его развития, этот метод проложил путь для исследователей в области белка ориентации для изучения энергии, кинетики и уникальных механизмов, регулирующих транспортировку белка через тилакоид мембран.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Эффективный метод для выделения высокоочищенного РНК из семян для использования в количественном анализе Транскриптом

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Синтез 1,2-Azaborines и подготовке их белковых комплексов с Т4 лизоцима Мутанты

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Анализ суперкомплексов транспортной цепи митохондриальных электронов с собственным электрофорезом, в-гель-анализах и электроизлучения

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Биохимических и структурных характеристик углеводный транспорта субстрата белок-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Изоляция и дыхательных измерения митохондрий от Резуховидка Таля

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Сплит BioID — Протеомного анализа контекстно зависимых белковых комплексов в их родной среде сотовой

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Использование рекомбинантных Fusion белков в платформу Assay флуоресцентные протеазы и их выемка в гель

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

В Vitro Увселицивание и Deubiquitination Анализы Нуклеосомальных Хистонов

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Применение биослойной интерферометрии (BLI) для изучения белково-белковых взаимодействий в транскрипции

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...