Name: isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays
Uploaded: 2018-09-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays at JoVE.com

Detta manuskript var beredd med finansiering av Division of Chemical Sciences, geovetenskaper och biovetenskaper, 408 Office för grundläggande Energivetenskaper av oss Department of Energy genom Grant DE-SC0017035

1. inledande material
<ol><li>Blötlägg ca 55 g ärtor 3 timmar i 400 mL destillerat vatten och sedan sår i en plastbricka (35 cm x 20 cm x 6 cm) i jord täcks med tunt lager av vermiculit.</li>
	<li>Växa facket av ärter vid 20 ° C under 12/12 h ljus och mörker (50 µE/m2s) cykel för 9 till 15 dagar.</li>
	<li>Förbereda protein substrat enligt en rekommenderad metod. Obs: Vi har förberett protein substrat med hjälp av olika metoder, inklusive 1) in vitro- transkription från renat plasm...

<ol>
	<li>Ellis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+protein+synthesis:+principles+and+problems.">Chloroplast protein synthesis: principles and problems.</a> Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).</li><li>Li, H. -. m., Chiu, C. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+transport+into+chloroplasts.">Protein transport into chloroplasts.</a> Annual review of plant biology. 61, (2010).</li><li>Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-specific+energy+requirements+for+protein+transport+across+or+into+thylakoid+membranes.+Two+lumenal+proteins+are+transported+in+the+absence+of+ATP.">Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).</li><li>Skalitzky, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastids+contain+a+second+sec+translocase+system+with+essential+functions.">Plastids contain a second sec translocase system with essential functions.</a> Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).</li><li>Dabney-Smith, C., Storm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plastid Biology. , 271-289 (2014).</li><li>Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+&amp;#34;assisted&amp;#34;+and+&amp;#34;spontaneous&amp;#34;+mechanisms+for+the+insertion+of+polytopic+chlorophyll-binding+proteins+into+the+thylakoid+membrane.">Distinct &amp;#34;assisted&amp;#34; and &amp;#34;spontaneous&amp;#34; mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).</li><li>Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. h. l. o. r. o. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChloroP,+a+neural+network-based+method+for+predicting+chloroplast+transit+peptides+and+their+cleavage+sites.">ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites.</a> Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).</li><li>Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locating+proteins+in+the+cell+using+TargetP,+SignalP+and+related+tools.">Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools.</a> Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).</li><li>Ling, Q., Jarvis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants.">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).</li><li>Lo, S. M., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Photosynthesis Research Protocols. , 139-157 (2011).</li><li>Vernon, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+chlorophylls+and+pheophytins+in+plant+extracts.">Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts.</a> Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).</li><li>Knott, T. G., Robinson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secA+inhibitor,+azide,+reversibly+blocks+the+translocation+of+a+subset+of+proteins+across+the+chloroplast+thylakoid+membrane.">The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).</li><li>Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SecA+homolog+in+protein+transport+within+chloroplasts:+evidence+for+endosymbiont-derived+sorting.">SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting.</a> Science. 266 (5186), 796-798 (1994).</li><li>Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+cDNA+for+pea+chloroplast+SecA+Evolutionary+conservation+of+the+bacterial-type+SecA-dependent+protein+transport+within+chloroplasts.">Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts.</a> FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).</li><li>Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-assisted+post-translational+transport+of+plastidic+type+I+signal+peptidase+1.">Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).</li><li>Luirink, J., Sinning, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRP-mediated+protein+targeting:+structure+and+function+revisited.">SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).</li><li>Yuan, J., Henry, R., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+factor+plays+an+essential+role+in+protein+integration+into+thylakoids+that+cannot+be+replaced+by+unfolding+or+by+heat+shock+protein.">Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein.</a> Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).</li><li>Tjalsma, H., van Dijl, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+consensus+prediction+of+protein+retention+in+a+bacterial+membrane.">Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane.</a> Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).</li><li>Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Facile+Reporter+System+for+the+Experimental+Identification+of+Twin-Arginine+Translocation+(Tat)+Signal+Peptides+from+All+Kingdoms+of+Life.">A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life.</a> Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).</li><li>Yuan, J., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastocyanin+and+the+33-kDa+subunit+of+the+oxygen-evolving+complex+are+transported+into+thylakoids+with+similar+requirements+as+predicted+from+pathway+specificity.">Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).</li><li>Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., B&#252;chel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transversal+and+lateral+exciton+energy+transfer+in+grana+thylakoids+of+spinach.">Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach.</a> Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).</li><li>Frielingsdorf, S., Jakob, M., Kl&#246;sgen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+pool+of+TatA+promotes+Tat-dependent+protein+transport+across+the+thylakoid+membrane.">A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).</li><li>Tu, C. -. J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+FtsY,+chloroplast+signal+recognition+particle,+and+GTP+are+required+to+reconstitute+the+soluble+phase+of+light-harvesting+chlorophyll+protein+transport+into+thylakoid+membranes.">Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).</li></ol>

Kloroplast och tylakoida isolering
Överdriven brott kan resultera i dålig kloroplast isolering och därmed dålig tylakoida avkastning efter separation i övertoningen. Det är bäst att homogenisera skördade vävnaden försiktigt genom att säkerställa att allt material är nedsänkt innan blandning och pulserande i 15 s cykler tills fullt homogeniseras. Om nödvändigt, använda flera kortare rundor av blandning med mindre vävnad i varje omgång.
Kyl alla materi...

Nästan alla av proteinhaltiga maskiner ansvarar för korrekt kloroplast funktion måste vara flyttad från cytosolen1. På kloroplast kuverten importeras protein substrat genom translocon av det yttre membranet (TOC) och translocon av inre membranet (TIC)2. Ytterligare inriktning till tylakoida sker membranet och lumen genom twin arginin translokation (cpTat)3, den sekretoriska (cpSec1)4, signal erkännande partikel (cpSRP)5och den spontana införande vägar6 . En metod för högavkastande isolering av fysiologiskt aktiva kloroplaster och tylakoida membran är nödvändigt att mäta de energetiken och kinetik av en translokation händelse, att förstå de olika transportmekanismer i varje väg, och att lokalisera en visst protein substrat av intresse för någon av de sex skilda fack för kloroplast.
Isolering av membran från kloroplast erbjuder bättre experimentell kontroll över miljöfaktorer (t.ex. salt och substrat koncentrationer, förekomsten av ATP/GTP och pH förhållanden) som påverkar mätningen av transport Energetik och kinetik. Denna in vitro- miljö lämpar sig för utforskandet av mekanistiska detaljerna av flyttning av samma skäl. Dessutom, medan predikterande mjukvara för lokalisering av kloroplast proteiner har förbättrats7,8, ger in vitro- transport analyser en snabbare metod för bekräftelse över mikroskopi-baserade fluorescerande analyser som kräver en genetiskt kodade fluorescerande tagg, växt förvandling och/eller specifika antikroppar. Här presenterar vi protokoll för kloroplast och tylakoida isoleringar från ärter (Pisum sativum), samt för transport analyser optimerad för var och en av energiberoende tylakoida flyttning vägar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1936px;" width="1936">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Pisum sativum seeds</td>
			<td style="width:252px;">Seedway LLC, Hall, NY</td>
			<td style="width:292px;">8686 - Little Marvel</td>
			<td style="width:1068px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, Gibbstown, NJ</td>
			<td>475855-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">80% Acetone</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blender with sharpened blades</td>
			<td>Waring Commercial</td>
			<td>BB155S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polytron 10-35</td>
			<td>Fischer Sci</td>
			<td>13-874-617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>GE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beckman J2-MC with JA 20 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>8043-30-1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall RC-5B with HB-4 rotor</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>8327-30-1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>12/3/83</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM MgATP in 1xIB</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>74804-12-9</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermolysin in 1xIB (2mg/mL)</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>9073-78-3</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K-Tricine</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorbitol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>50-70-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manganese Chloride</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>13446-34-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays

Kloroplaster är organeller i gröna växter ansvarar för att utföra många viktiga metaboliska vägar, främst fotosyntes. Inom kloroplaster, tylakoida membran systemet inrymmer alla fotosyntetiserande pigment, reaktion centrerar komplex och de flesta av de elektron bärarna, och ansvarar för light-dependent ATP-syntes. Över 90% av kloroplast proteiner är kodade i kärnan, översatt i cytosolen och därefter importeras till kloroplast. Ytterligare proteintransport in i eller över det tylakoida membranet använder en av fyra translokation vägar. Här beskriver vi en högavkastande metod för isolering av transport-behöriga thylakoids från ärter (Pisum sativum), tillsammans med transport analyser genom tre energiberoende cpTat, cpSec1 och cpSRP-medierade vägar. Dessa metoder gör det möjligt för experiment som avser tylakoida protein lokalisering, transport Energetik och mekanismerna för protein flyttning över biologiska membraner.

För att mäta mängden substrat framgångsrikt transporteras, är det användbart att inkludera en eller flera ”procent input” körfält. För de data som presenteras nedan, användes 10% av den slutliga transport reaktionen utan thylakoids. Denna ”procent ingång” bidrar också till att visualisera storleken på föregångaren substratet. Procentsatsen motsvarar en känd, definierad mängd substrat som jämför transporteras substratet mot och kan skalas upp eller ned som nödv?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays at JoVE.com

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Isolering av fysiologiskt aktiva Thylakoids och deras användning i energi-beroende Protein Transport analyser

Vi presenterar protokoll häri för högavkastande isolering av fysiologiskt aktiva thylakoids och protein transport analyser för kloroplast twin arginin translokation (cpTat), sekretoriska (cpSec1) och signalvägar erkännande partikel (cpSRP).

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor om mekanismer och energier av proteintransport över kloroplast membran, liksom placeringen av proteiner inom plastids. Den största fördelen med denna teknik för thylakoid protein inriktning är att det möjliggör fullständig kontroll av thylakoid miljö under transport, inklusive temperatur, pH, joniska förhållanden, och prekursor koncentrationer. Börja med att blötlägga cirka 55 gram ärter i 400 milliliter destillerat vatten i tre timmar.Så de blöta ärtorna i en plastbricka i jord, täckt med ett tunt lager vermikulit, och växa i nio till 15 dagar som beskrivs i textprotokollet. På dagen för kloroplast isolering, förbereda en kontinuerlig densitet gradient genom centrifuging en blandning av 15 milliliter percoll och 15 milliliter av 2xGB buffert i en 15 milliliter polykarbonat hög hastighet centrifugera röret vid 30, 900 gs i en fast vinkel rotor i 30 minuter vid fyra grader Celsius med bromsen av. Sedan skörda cirka 25 gram av nio till 15 dagar gamla ärtskott.Lägg till dem till 95 milliliter kall 1xGB buffert i en kyld mixer, med vässade blad. Och homogenisera. Filtrera denna blandning genom minst två lager ostduk, placerad i en tratt över en kyld bägare.Centrifugera filtratet med hjälp av en 15 milliliter polykarbonat centrifuge röret i en svängande hink rotor på 3, 000 gs i fem minuter vid fyra grader Celsius. Kassera supernatanten och använd en pensel för att försiktigt återanvända pelleten i en milliliter på 1xGB. Efter det använd en glashållningspipett för att noggrant lägga skärmfjädringen ovanpå Percoll-gradienten.Centrifugera den i en svängande bucket rotor på 8, 000 gs i 10 minuter vid fyra grader Celsius med bromsen av. Med hjälp av en hållning pipetter igen försiktigt överföra lägre gröna bandet som innehåller intakta kloroplaster i en färsk 50 milliliter polykarbonat rör och tillsätt 30 milliliter 1xIB buffert. Centrifugera röret i en svängande bucket rotor vid 1, 800 gs i fem minuter vid fyra grader Celsius.Efter att du har kastat supernatanten återbehagar du försiktigt pelleten i en milliliter av 1xIB med en pensel. Tvätta i 30 milliliter av 1xIB och centrifug igen under samma förhållanden. Resuspend pelleten efter den slutliga centrifugeringen i en milliliter av 1xIB.För att bestämma klorofyllkoncentration, blanda 10 mikroliter av helt återsuspended kloroplaster med fem milliliter på 80%aceton. Filtrera genom ett 180 mikrometer tjockt filterpapper med 11 mikrometer porstorlek och sedan bestämma klorofyllkoncentrationen genom spektrofotometer. Späd kloroplastblandningen till ett milligram per milliliter med hjälp av kalla 1xIB.För att börja isolera de thylakoids när stromal extrakt inte är nödvändigt, såsom cpTat transport, centrifug intakta kloroplaster i 1,5 milliliter rör i en svängande hink rotor vid 1, 000 gs vid fyra grader Celsius i sex minuter. Därefter kasseras supernatanten och resuspend pelleten i hypotonlysbuffert för att uppnå ett milligram per milliliter med en mikropipette. Inkubera på is i mörker med enstaka blandning i 10 minuter.För att återvinna thylokoider, centrifug i en svängande hink rotor på 3, 200 gs vid fyra grader Celsius i åtta minuter. Tvätta thylokoiderna två gånger genom att resuspending pelleten med en till två milliliter av lysbuffert och sedan centrifugering under samma förhållanden. Efter den slutliga centrifugeringen, resuspend pelleten, i en milliliter av 1xIB buffert och bestämma klorofyllkoncentrationen i isolerade thylokoider med hjälp av en spektrofotometer som tidigare visats.För vägar som kräver stromal extrakt återhämtning såsom CPSec1 och CPSRP eliquate 600 mikroliter av isolerade kloroplaster i en svängande hink rotor och centrifug vid 1, 000 gs i sex minuter vid fyra grader Celsius. För kloroplast lys, vi upphäva pelleten med 600 mikroliter av hypotoniska lys buffert. Inkubera på is i mörker i 10 minuter med tillfällig blandning.Sedan centrifugera rören i en svängande hink rotor på 3, 200 gs i åtta minuter vid fyra grader Celsius. För att spara stroma, överför ljusgrön till gul supernatant till en ny mikro centrifug röret och lägga till en lika stor volym av 2x rå stromal buffert. För att tvätta thylokoids, tillsätt två volymer av lysbuffert och centrifug vid 3, 200 gs i åtta minuter vid fyra grader Celsius.Resuspend pelleten i 1xIB för att uppnå klorofyll koncentration av ett milligram per milliliter och avsatts på is för senare användning i transport analyser. Avlägsna restmembran från rå stroma genom att centrifugera den utspädda rå stroma i en fast vinkel rotor vid 42, 000 gs i 30 minuter vid fyra grader Celsius. Samla sedan 95%av volymen från varje rör se till att inte störa den lilla gula gröna pelleten, samtidigt som man kan lägga till volymen tas från varje rör.För att förbereda det koncentrerade stromalextraktet, poola de insamlade supernatanterna. Använd sedan en fyra milliliter 30 kilodalton molekylvikt cut-off koncentrator för att koncentrera extraktet fem gånger. För att analysera cpTat-transporten i ett 1,5 milliliterrör på is blanda de isolerade thylokoiderna till en slutlig klorofyllkoncentration på 0,33 milligram per milliliter, fem millimolar ATP framställt i 1xIB och åtta millimolar DTT beredda i 1xIB.För att initiera transporten, införa substratprotein till transportblandningen. Genomföra reaktionen genom att belysa suspensionen med 80 till 100 mikroeinstein per kvadratmeter per sekund av fotosynthetiskt aktiv strålning i 10 minuter vid rumstemperatur. För att stoppa transportreaktionen, späd suspensionen åtta gånger med iskall 1xIB.Centrifugera vid 3, 200 gs i en mikro centrifug i fem minuter vid fyra grader Celsius för att återvinna thylokoids. Efter att ha kastat supernatanten, resuspend pelleten i 120 mikroliter av iskall 1xIB. För att analysera CPSec1- eller PSRP-banorna blanda följande i ett 1,5 milliliterrör på is.Thylakoids till en slutlig klorofyll koncentration av 0.33 milligram per milliliter, 0.83 milligram per milliliter klorofyll motsvarigheter av stromal extrakt, och fem millimolar ATP beredd i 1xIB. Ta upp reaktionen till önskad volym med iskall 1xIB och inkubera på is i 10 minuter. Att inleda transporten införa 10%volymvolym volym av substratprotein till denna transport mix.Belysa med 80 till 100 mikroeinstein per kvadratmeter per sekund av fotosynthetiskt aktiv strålning i 10 minuter vid rumstemperatur. För att stoppa reaktionen, späd suspensionen åtta gånger med iskall 1xIB. Centrifug vid 3, 200gs i en mikro centrifug i fem minuter vid fyra grader Celsius.Efter att ha kastat supernatanten, resuspend pelleten i 120 mikroliter av iskall 1xIB. För att avlägsna kvarvarande substrat som inte har transporterats, smälta externt protein genom att lägga till sex mikroliter på två milligram per milliliter termoklysin och 10 millimolar kalciumklorid i 1xIB. Inkubera denna proteasreaktion på is i 40 minuter.Släck proteasen genom att fördubbla volymen med 25 millimolar EDTA i 1xIB. Centrifugera vid 3, 200 gs i en mikro centrifug i fem minuter vid fyra grader Celsius för att återvinna thylokoids. Efter att ha tagit bort supernatant, resuspend återhämtade thylokoids i 120 mikroliter av fem milimolar EDTA i 1xIB, och överföring till en ny 1,5 milliliter rör.Efter centrifugering igen vid 3, 200 gs i en mikrocentrifug i fem minuter vid fyra grader Celsius, kassera supernatanten och resuspend pelleten i en lämplig volym av laemmli provbuffert, kompletterad med 10 millimolar EDTA. Placera proverna i ett kokande vattenbad i 10 minuter. Fortsätt att analysera proverna genom SDS sida.Transport av iOE17-protein genom cpTat-vägen resulterade i en storleksförskjutning på två till tre kilodalton mellan det introducerade substratet och den mogna bearbetade formen. Detta beror på klyvning av den n terminal signal peptid som indikerar en lyckad cpTat transport. Thermolysin behandling lämnar endast den framgångsrikt transporteras och därför proteus resistenta mogna bandet.Transport av OE33-prekursor genom CPSec1-vägen, resulterade i en storleksförskjutning i det mogna substratet, och proteusskydd av det transporterade substratet. Insättning av LHCP föregångare i thylokoid membranet via cpSRP utbildningsavsnitt, utvärderas genom thermolysin matsmältningen ledde till en storlek förskjutning av 1,5 till två kilodaltons. Detta indikerade lyckad membraninsättning, eftersom membranet skyddar den moroderade av mogen LHCP nedbrytningsprodukt från fullständig proteolys.Efter att ha sett den här videon bör du ha en god förståelse för hur man isolerar thylokoids och assay tranportivity genom den energiberoende cpTat, cpSec 1 och cpSRP vägar. När behärskar denna teknik kan göras i tre till fyra timmar när de utförs på rätt sätt. Även om det inte illustreras i den här videon vi i allmänhet hålla overhead lamporna släckt i labbet när isolera och arbeta med photosynthetically aktiva chloroplasts och thylakoids.Samtidigt försöker detta förfarande är det viktigt att hålla isolerade kloroplast och thylakoids vid fyra grader Celsius. Kom ihåg att återanvända kloroplaster försiktigt i början. Undvik att störa Procoll-gradienten efter det första centrifucationsteget.Dessutom kan procent ingångsprovet beredas parallellt med transportreaktionerna och köras på samma gel för att uppskatta substrattransporten. Glöm inte, att arbeta med radioaktiva substrat kräver samvetsgrann hantering och korrekt PPE. Efter dets utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom proteininriktning att utforska energier, kinetik och unika mekanismer som styr proteintransport över thylakoidmembran.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metod för isolering av högrenat RNA från frön för användning i kvantitativ transkriptom analys

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

Syntes av 1,2-Azaborines och utarbetandet av deras proteinkomplex med T4 Lysozyme mutanter

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analysera superkomplex av den mitokondriella elektrontransportkedjan med naturliga elektrofores, in-gel-analyser och elektrolys

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiska och strukturell karaktärisering av den kolhydrat Transport substrat-bindande-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolering och respiratoriska mätningar av mitokondrier från Arabidopsis thaliana.

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteomiska analys av sammanhangsberoende proteinkomplex i deras infödda cellulära miljön

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Användning av rekombinanta fusionsproteinerna i en fluorescerande proteas Assay plattform och deras i-gel utvinningsarbete

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analys av proteinveckning, Transport och nedbrytning i levande celler av radioaktiva puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

In vitro Ubiquitination och Deubiquitination assays av Nukleosomala Histones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Tillämpning av Biolayer interferometri (BLI) för att studera protein-proteininteraktioner vid transkription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...