Name: isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays
Uploaded: 2018-09-28T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays at JoVE.com

Bu el yazması kimyasal Bilimler Bölümü, yerbilim ve Biosciences, temel enerji Bilimler bize Enerji Bakanlığı aracılığıyla Grant DE-SC0017035, 408 Office tarafından fon ile hazırlanmıştır

1. ilk malzemeleri
<ol><li>400 mL distile su içinde 3 saat yaklaşık 55 g bezelye ıslatın ve plastik bir tepsi içinde ekmek (35 cm x 20 cm x 6 cm) toprak vermikülit ince bir tabaka ile kaplı.</li>
	<li>Tepsiyi bezelye 12/12 h açık/koyu (50 µE/m2s) döngüsü için 9-15 gün altında 20 ° C'de büyümek.</li>
	<li>Protein substrat tercih edilen yöntemi göre hazırlayın. Not: 1 gibi yöntemleri kullanarak protein yüzeylerde hazırladık) vitro transkripsiyon arıtılmış plazmid gel...

<ol>
	<li>Ellis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+protein+synthesis:+principles+and+problems.">Chloroplast protein synthesis: principles and problems.</a> Sub-cellular biochemistry. 9, 237 (1983).</li><li>Li, H. -. m., Chiu, C. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+transport+into+chloroplasts.">Protein transport into chloroplasts.</a> Annual review of plant biology. 61, (2010).</li><li>Cline, K., Ettinger, W., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-specific+energy+requirements+for+protein+transport+across+or+into+thylakoid+membranes.+Two+lumenal+proteins+are+transported+in+the+absence+of+ATP.">Protein-specific energy requirements for protein transport across or into thylakoid membranes. Two lumenal proteins are transported in the absence of ATP.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (4), 2688-2696 (1992).</li><li>Skalitzky, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastids+contain+a+second+sec+translocase+system+with+essential+functions.">Plastids contain a second sec translocase system with essential functions.</a> Plant physiology. 155 (1), 354-369 (2011).</li><li>Dabney-Smith, C., Storm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plastid Biology. , 271-289 (2014).</li><li>Kim, S. J., Jansson, S., Hoffman, N. E., Robinson, C., Mant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+&amp;#34;assisted&amp;#34;+and+&amp;#34;spontaneous&amp;#34;+mechanisms+for+the+insertion+of+polytopic+chlorophyll-binding+proteins+into+the+thylakoid+membrane.">Distinct &amp;#34;assisted&amp;#34; and &amp;#34;spontaneous&amp;#34; mechanisms for the insertion of polytopic chlorophyll-binding proteins into the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (8), 4715-4721 (1999).</li><li>Emanuelsson, O., Nielsen, H., Von Heijne, G. C. h. l. o. r. o. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChloroP,+a+neural+network-based+method+for+predicting+chloroplast+transit+peptides+and+their+cleavage+sites.">ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites.</a> Protein Science. 8 (5), 978-984 (1999).</li><li>Emanuelsson, O., Brunak, S., Von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locating+proteins+in+the+cell+using+TargetP,+SignalP+and+related+tools.">Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools.</a> Nature protocols. 2 (4), 953 (2007).</li><li>Ling, Q., Jarvis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+import+into+chloroplasts+isolated+from+stressed+plants.">Analysis of protein import into chloroplasts isolated from stressed plants.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54717 (2016).</li><li>Lo, S. M., Theg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Photosynthesis Research Protocols. , 139-157 (2011).</li><li>Vernon, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+determination+of+chlorophylls+and+pheophytins+in+plant+extracts.">Spectrophotometric determination of chlorophylls and pheophytins in plant extracts.</a> Analytical Chemistry. 32 (9), 1144-1150 (1960).</li><li>Knott, T. G., Robinson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secA+inhibitor,+azide,+reversibly+blocks+the+translocation+of+a+subset+of+proteins+across+the+chloroplast+thylakoid+membrane.">The secA inhibitor, azide, reversibly blocks the translocation of a subset of proteins across the chloroplast thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 7843-7846 (1994).</li><li>Yuan, J., Henry, R., McCaffery, M., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SecA+homolog+in+protein+transport+within+chloroplasts:+evidence+for+endosymbiont-derived+sorting.">SecA homolog in protein transport within chloroplasts: evidence for endosymbiont-derived sorting.</a> Science. 266 (5186), 796-798 (1994).</li><li>Nohara, T., Nakai, M., Goto, A., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+the+cDNA+for+pea+chloroplast+SecA+Evolutionary+conservation+of+the+bacterial-type+SecA-dependent+protein+transport+within+chloroplasts.">Isolation and characterization of the cDNA for pea chloroplast SecA Evolutionary conservation of the bacterial-type SecA-dependent protein transport within chloroplasts.</a> FEBS letters. 364 (3), 305-308 (1995).</li><li>Endow, J. K., Singhal, R., Fernandez, D. E., Inoue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-assisted+post-translational+transport+of+plastidic+type+I+signal+peptidase+1.">Chaperone-assisted post-translational transport of plastidic type I signal peptidase 1.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28778-28791 (2015).</li><li>Luirink, J., Sinning, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SRP-mediated+protein+targeting:+structure+and+function+revisited.">SRP-mediated protein targeting: structure and function revisited.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1694 (1-3), 17-35 (2004).</li><li>Yuan, J., Henry, R., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+factor+plays+an+essential+role+in+protein+integration+into+thylakoids+that+cannot+be+replaced+by+unfolding+or+by+heat+shock+protein.">Stromal factor plays an essential role in protein integration into thylakoids that cannot be replaced by unfolding or by heat shock protein.</a> Hsp70. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (18), 8552-8556 (1993).</li><li>Tjalsma, H., van Dijl, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+consensus+prediction+of+protein+retention+in+a+bacterial+membrane.">Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane.</a> Proteomics. 5 (17), 4472-4482 (2005).</li><li>Widdick, D. A., Eijlander, R. T., van Dijl, J. M., Kuipers, O. P., Palmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Facile+Reporter+System+for+the+Experimental+Identification+of+Twin-Arginine+Translocation+(Tat)+Signal+Peptides+from+All+Kingdoms+of+Life.">A Facile Reporter System for the Experimental Identification of Twin-Arginine Translocation (Tat) Signal Peptides from All Kingdoms of Life.</a> Journal of Molecular Biology. 375 (3), 595-603 (2008).</li><li>Yuan, J., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastocyanin+and+the+33-kDa+subunit+of+the+oxygen-evolving+complex+are+transported+into+thylakoids+with+similar+requirements+as+predicted+from+pathway+specificity.">Plastocyanin and the 33-kDa subunit of the oxygen-evolving complex are transported into thylakoids with similar requirements as predicted from pathway specificity.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (28), 18463-18467 (1994).</li><li>Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., B&#252;chel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transversal+and+lateral+exciton+energy+transfer+in+grana+thylakoids+of+spinach.">Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach.</a> Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).</li><li>Frielingsdorf, S., Jakob, M., Kl&#246;sgen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+pool+of+TatA+promotes+Tat-dependent+protein+transport+across+the+thylakoid+membrane.">A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).</li><li>Tu, C. -. J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+FtsY,+chloroplast+signal+recognition+particle,+and+GTP+are+required+to+reconstitute+the+soluble+phase+of+light-harvesting+chlorophyll+protein+transport+into+thylakoid+membranes.">Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).</li></ol>

Kloroplast ve Thylakoid yalıtım
Aşırı kırılması neden olur zavallı kloroplast ayrılık degradedeki sonra yalıtım ve böylece zavallı thylakoid verim. Hasat doku yavaşça tüm malzeme karıştırma ve tamamen homojenize oluncaya kadar 15 s döngülerle darbe önce batık sağlayarak homojenize en iyisidir. Gerekirse, birden çok daha kısa tur her turda daha az doku ile harmanlama kullanın.
Hasat doku ile temas gelen tüm malzemeler soğutma izole kloropl...

Neredeyse tüm proteinaceous makine uygun kloroplast işlevi için sorumlu sitozol1ile translocated gerekir. Kloroplast zarflar protein yüzeylerde dış membran (TOC) translocon ve iç zar (TIC)2translocon alınır. Daha fazla thylakoid için hedefleme membran ve lümen oluşur ikiz arginin translocation (cpTat)3, salgı (cpSec1)4, sinyal tanıma parçacık (cpSRP)5ve spontan ekleme yolları6 ile . Yüksek verimli yalıtım fizyolojik aktif kloroplast ve thylakoid membran için bir yöntem enerji bilimi ve kinetik bir translocation olay, her yolu farklı taşıma mekanizmaları anlamak ve yerelleştirmek için ölçmek gerekli olan bir kloroplast altı ayrı bölmeleri hiçbirine ilgi belirli protein alt katman.
Kloroplast dan membran izolasyon taşıma enerji ölçümü etkileyen çevresel faktörler (örneğin, tuz ve substrat konsantrasyonu, ATP/GTP ve pH koşulların varlığı) üzerinde daha iyi deneysel kontrol sunar ve kinetik. Bu vitro ortamda aynı sebeplerden dolayı mekanik translocation ayrıntılarını keşif için oldukça rahat. Akıllı yazılım yerelleştirme kloroplast proteinlerin7,8geliştirdi, Ayrıca, vitro taşıma deneyleri onay için daha hızlı bir yöntem mikroskobu tabanlı floresan deneyleri üzerinde bunu sağlarken genetik olarak kodlanmış bir floresan etiketi, bitki dönüşümü ve/veya belirli antikor gerektirir. Burada, iletişim kuralları her enerji bağımlı thylakoid translocation yolları için optimize taşıma deneyleri yanı sıra, kloroplast ve thylakoid izolasyonların bezelye (Pisum sativum) üzerinden için mevcut.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1936px;" width="1936">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:324px;">Pisum sativum seeds</td>
			<td style="width:252px;">Seedway LLC, Hall, NY</td>
			<td style="width:292px;">8686 - Little Marvel</td>
			<td style="width:1068px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Miracloth</td>
			<td>Calbiochem, Gibbstown, NJ</td>
			<td>475855-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">80% Acetone</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blender with sharpened blades</td>
			<td>Waring Commercial</td>
			<td>BB155S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polytron 10-35</td>
			<td>Fischer Sci</td>
			<td>13-874-617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>GE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beckman J2-MC with JA 20 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>8043-30-1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall RC-5B with HB-4 rotor</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td>8327-30-1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mM dithiothreitol (DTT) in 1xIB</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>12/3/83</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM MgATP in 1xIB</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>74804-12-9</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermolysin in 1xIB (2mg/mL)</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>9073-78-3</td>
			<td>Can be frozen in aliquots for future use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K-Tricine</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>T0377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorbitol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>50-70-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manganese Chloride</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>13446-34-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma, Saint Louis, MO</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of physiologically active thylakoids and their use in energy-dependent protein transport assays

Kloroplast vardır organelleri çok sayıda temel metabolik yollar, sorumlu yeşil bitkilerde fotosentez en önemlisi. Kloroplast içinde thylakoid membran sistemi ve fotosentetik pigment, reaksiyon merkezi kompleksleri ve elektron taşıyıcıları çoğu evler ışık bağımlı ATP sentezi için sorumludur. Kloroplast proteinlerin % 90'çekirdeğinde kodlanmış, sitozol tercüme ve daha sonra kloroplast ithal. Daha fazla protein taşıma içine veya thylakoid membran boyunca dört translocation yollar birini kullanır. Buraya, taşıma deneyleri üç enerji bağımlı cpTat, cpSec1 ve cpSRP-aracılı yolu ile birlikte bezelye (Pisum sativum), gelen taşıma-yetkili thylakoids yalıtım için yüksek verimli yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntemler thylakoid protein yerelleştirme, taşıma enerji ve protein translocation mekanizmaları biyolojik membranlar arasında ilgili deneyler etkinleştirin.

Başarılı bir şekilde taşınan substrat miktarını ölçmek için bir veya daha fazla "yüzde giriş" Şerit eklemek kullanışlı olabilir. Aşağıda gösterilen veri için son aktarım tepki thylakoids olmadan yüzde 10'u kullanıldı. Bu "yüzde giriş" da habercisi substrat boyutunu görselleştirmek için yardımcı olur. Yüzde hangi substrat taşınan Karşılaştır substrat karşı için bilinen, tanımlı miktarını temsil eder ve gerekli başlangıçta kullanarak protein...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays at JoVE.com

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Yalıtım fizyolojik aktif Thylakoids ve onların kullanımı enerji bağımlı Protein taşıma deneyleri

Biz burada fizyolojik aktif thylakoids yüksek verimli izolasyon için protokoller ve protein taşıma deneyleri kloroplast ikiz arginin translocation (cpTat), salgı (cpSec1) ve sinyal tanıma parçacık (cpSRP) yolu için mevcut.

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Bu yöntem, kloroplast membranları arasında protein taşıma mekanizmaları ve enerjik yanı sıra plastids içinde proteinlerin konumu ile ilgili anahtar soruların cevap yardımcı olabilir. Thylakoid protein hedeflemesi için bu tekniğin en büyük avantajı, sıcaklık, pH, iyonik koşullar ve öncül konsantrasyonları da dahil olmak üzere taşıma sırasında thylakoid ortamının tam kontrol sağlar olmasıdır. Üç saat boyunca 400 mililitre distile su yaklaşık 55 gram bezelye ıslatarak başlayın.Toprağa plastik bir tepsi içinde batırılmış bezelye ekin, vermikülit ince bir tabaka ile kaplı, ve metin protokolü açıklandığı gibi dokuz ila 15 gün boyunca büyümek. Kloroplast izolasyon gününde, 15 mililitre Percoll mililitre ve 15 mililitre lik 2xGB tamponu 30 mililitrelik polikarbonat yüksek hızlı santrifüj tüpünde 30, sabit açıda rotorda 900 gs'lik bir karışımı nı frenkapalı yken 30 dakika boyunca 30 dakika boyunca santrifüj ederek sürekli bir yoğunluk gradyanı hazırlayın. Sonra hasat yaklaşık 25 gram dokuz ila 15 günlük bezelye sürgünler.Soğutulmuş bir blender soğuk 1xGB tampon 95 mililitre ekleyin, keskinleştirilmiş bıçakları ile. Ve homojenize. Soğutulmuş bir kabın üzerine bir huni yerleştirilen peynir bezi en az iki kat ile bu karışımı filtreleyin.Santrifüj filtrasyon bir 15 mililitre polikarbonat santrifüj tüp kullanarak bir sallanan kova rotor 3, 000 gs dört derece santigrat beş dakika için. Supernatant atın ve hafifçe 1xGB bir mililitre pelet resuspend için bir paintbrush kullanın. Bundan sonra dikkatle Percoll gradyan üstüne ekran süspansiyon katman için bir cam duruş pipet kullanın.8,000 gs'de sallanan bir kova rotorunda 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca freni kapalı santrifüj edin. Bir duruş pipet kullanarak tekrar dikkatle bozulmamış kloroplastlar içeren alt yeşil bant taze bir 50 mililitre polikarbonat tüp içine aktarın ve 1xIB tampon 30 mililitre ekleyin. Dört santigrat derece beş dakika için 1, 800 gs bir sallanan kova rotor tüp santrifüj.Supernatant attıktan sonra, yavaşça bir boya fırçası ile 1xIB bir mililitre pelet resuspend. 30 mililitre 1xIB ve santrifüj de aynı koşullarda tekrar yıkayın. 1xIB bir mililitre son santrifüj sonra pelet resuspend.Klorofil konsantrasyonu belirlemek için, % 80 aseton beş mililitre ile tamamen resuspended kloroplast10 mikrolitre karıştırın. 11 mikrometre gözenek boyutuna sahip 180 mikrometre kalınlığındaki filtre kağıdından süzün ve klorofil konsantrasyonunu spektrofotometre ile belirleyin. Soğuk 1xIB kullanarak mililitre başına bir miligram kloroplast karışımı seyreltin.Stromal ekstresin gerekli olmadığı nda thylakoidleri izole etmeye başlamak için cpTat taşıma, santrifüj bozulmamış kloroplastlar 1,5 mililitrelik tüplerde sallanan kova rotorunda 1,000 gs'de dört derece santigrat derece altı dakika süreyle. Bundan sonra, supernatant atın ve bir mikropipet ile mililitre başına bir miligram elde etmek için hipotonik lysis tampon pelet resuspend. 10 dakika ara sıra karıştırarak karanlıkta buz üzerinde kuluçka.Timokoidleri kurtarmak için, sallanan kova rotorunda santrifüj 3, 200 gs'de dört derece santigrat derecede sekiz dakika. Bir ila iki mililitre likiz tamponu ile peleti yeniden suyararak ve aynı koşullarda santrifüj ederek timokoidleri iki kez yıkayın. Son santrifüjden sonra, peleti 1xIB tamponunun bir mililitresinde yeniden askıya alın ve daha önce gösterildiği gibi bir spektrofotometre kullanarak izole timokoidlerde klorofil konsantrasyonunu belirleyin.CPSec1 ve CPSRP eliquate gibi stromal ekstresi kurtarma gerektiren yollar için bir sallanan kova rotor ve santrifüj izole kloroplast600 mikrolitre 1,000 gs dört derece santigrat altı dakika için. Kloroplast lysis için, 600 mikrolitre hipotonik lysis tamponu ile pelet askıya alıyoruz. Ara sıra karıştırma ile 10 dakika boyunca karanlıkta buz üzerinde kuluçka.Sonra tüpleri sallanan kova rotorunda 3, 200 gs'de dört santigrat derecede sekiz dakika santrifüj edin. Stroma kaydetmek için, yeni bir mikro santrifüj tüp sarı supernatant açık yeşil transfer ve 2x ham stromal tampon eşit hacim ekleyin. Thylokoids yıkamak için, dört santigrat derece sekiz dakika boyunca 3, 200 gs iki cilt lysis tampon ve santrifüj ekleyin.Mililitre başına bir miligram klorofil konsantrasyonu elde etmek için 1xIB pelet resuspend ve taşıma tahlillerde daha sonra kullanılmak üzere buz üzerinde bir kenara koyun. Seyreltilmiş ham stroma'yı 42, 000 gs'de sabit açı rotoruyla santrifüj ederek ham stromadan arta kalan membranları 42 derece santigrat derecede 30 dakika çıkarın. Daha sonra her tüpten alınan hacmi not ederken, küçük sarı yeşil pelet rahatsız değil emin olmak için her tüp hacminin% 95 toplamak.Konsantre stromal ekstresi hazırlamak için, toplanan supernatants havuz. Sonra dört mililitre kullanın 30 kilodalton moleküler ağırlık kesme konsantratörü ekstre beş kat konsantre. Buz üzerinde 1,5 mililitrelik bir tüpteki cpTat taşımasını tahlil etmek için izole timokoidleri mililitrede 0,33 miligram lık son klorofil konsantrasyonuna, 1xIB'de hazırlanan beş milimolar ATP'ye ve 1xIB'de hazırlanan sekiz milimolar DTT'ye karıştırın.Taşımayı başlatmak için, substrat proteinini taşıma karışımına tanıtın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca fotosentetik olarak aktif radyasyonun saniyede 80 ila 100 mikroeinstein'ı ile süspansiyonu aydınlatarak reaksiyonuyguluyor. Taşıma reaksiyonu durdurmak için, süspansiyonu buz gibi 1xIB ile sekiz kat seyreltin.Centrifuge 3, 200 gs bir mikro santrifüj beş dakika dört derece santigrat thys de thylokoids kurtarmak için. Supernatant attıktan sonra, buz soğuk 1xIB 120 mikrolitre pelet resuspend. CPSec1 veya PSRP yollarını teşpetmek için aşağıdakileri 1,5 mililitrelik bir tüpte buz üzerinde karıştırın.Mililitrebaşına 0.33 miligram son klorofil konsantrasyonuna thylakoidler, stromal ekstresin mililitre klorofil eşdeğerleri başına 0.83 miligram ve 1xIB'de hazırlanan beş milimolar ATP. Buz gibi soğuk 1xIB ile reaksiyonu istenilen hacime getirin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın. Taşımayı başlatmak için bu taşıma karışımına substrat proteinhacmine göre %10 hacim sağlar.Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca fotosentetik olarak aktif radyasyonsaniyede metrekare başına 80 ila 100 mikroeinstein ile aydınlatın. Reaksiyonu durdurmak için süspansiyonu buz gibi 1xIB ile sekiz kat seyreltin. Santrifüj 3, 200gs bir mikro santrifüj beş dakika dört santigrat derece.Supernatant attıktan sonra, buz soğuk 1xIB 120 mikrolitre pelet resuspend. Taşınmış değil artık substrat kaldırmak için, mililitre termilsin başına iki miligram altı mikrolitre ve 1xIB 10 milimolar kalsiyum klorür ekleyerek dış protein sindirmek. Bu proteaz reaksiyonu 40 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın.1xIB'de 25 milimolar EDTA ile hacmi ikikatına çıkararak proteazı söndürün. Centrifuge 3, 200 gs bir mikro santrifüj beş dakika dört derece santigrat thys de thylokoids kurtarmak için. Supernatant çıkarıldıktan sonra, 1xIB beş milimolar EDTA 120 mikrolitre de kurtarılan timokoidler resuspend, ve yeni bir 1.5 mililitre tüp transfer.Tekrar santrifüj sonra 3, bir mikro santrifüj beş dakika boyunca bir mikro santrifüj içinde gs dört santigrat, supernatant atın ve laemmli örnek tampon uygun bir hacim içinde pelet resuspend, 10 milimolar EDTA ile takviye. Örnekleri 10 dakika kaynar su banyosuna koyun. Örnekleri SDS sayfasına göre analiz etmeye devam edin.iOE17 proteininin cpTat yolu ile taşınması, tanıtılan substrat ile olgun işlenmiş form arasında 2-3 kilodalton büyüklüğünde bir boyut kaymasıile sonuçlandı. Bunun nedeni, başarılı bir cpTat taşımasını gösteren n terminal sinyal peptidinde dekoltedir. Termolizin tedavisi sadece başarılı bir şekilde taşınan ve bu nedenle proteus dirençli olgun bant bırakır.OE33 öncütünün CPSec1 yolu üzerinden taşınması, olgun substratta bir boyut kayması ve taşınan substratproteus koruması ile sonuçlandı. LHCP öncülünün cpSRP yolu ile timokoid membrana yerleştirilmesi, termolysin sindirimi ile değerlendirilerek 1,5 ila iki kilodalton boyut kaymasına yol açmıştır. Bu başarılı membran ekleme, membran tam proteolysis olgun LHCP bozulma ürün amcaaved korur gibi.Bu videoyu izledikten sonra enerjiye bağımlı cpTat, cpSec 1 ve cpSRP yolları ile thylokoids ve asa tranportivity izole etmek için nasıl iyi bir anlayışa sahip olmalıdır. Bir kez bu teknik ustalaştıktan sonra düzgün yapıldığında 3-4 saat içinde yapılabilir. Bu videoda resimli olmasa da biz genellikle izole ve fotosentetik aktif kloroplastlar ve thylakoids ile çalışırken laboratuarda havai ışıkları kapalı tutmak.Bu prosedürü denerken izole kloroplast ve thylakoidleri dört santigrat derecede tutmak önemlidir. Başlangıçta kloroplastları nazikçe askıya almamayı unutmayın. İlk santrifüj adımından sonra Procoll degradesini rahatsız etmekten kaçının.Ayrıca, yüzde giriş örneği taşıma reaksiyonlarına paralel olarak hazırlanabilir ve substrat taşımasını tahmin etmek için aynı jel üzerinde çalıştırılabilir. Unutmayın, radyoaktif yüzeyler ile çalışan vicdani işleme ve uygun PPE gerektirir. Bu teknik, geliştirildikten sonra, protein hedeflemesi alanında araştırmacıların thylakoid membranlar arasında protein taşımasını yöneten enerjik, kinetik ve benzersiz mekanizmaları keşfetmelerinin önünü açmıştır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA&#39;nın izolasyonu için etkili bir yöntem

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Synthesis of 1,2-Azaborines and the Preparation of Their Protein Complexes with T4 Lysozyme Mutants

1,2-Azaborines Sentezi ve T4 Lizozim Mutants ile Bunların Protein Kompleksleri hazırlanması

We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Mitokondriyal Elektron Nakil Zincirinin Süper Komplekslerinin Yerli Elektroforez, In-Jel Testleri ve Elektroelüsyon ile İncelenmesi

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Yalıtım ve solunum ölçümleri mitokondri Arabidopsis thaliana üzerinden

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

Split-BioID — Proteomik analiz onların yerel hücresel ortamında içeriğe özel Protein kompleksleri

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Rekombinant füzyon protein flüoresan proteaz tahlil Platform ve onların jel Renaturation kullanımı

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Nükliosomal Histones in vitro Ubiquitination ve Deubiquitination bulguları

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Transkripsiyon protein-protein etkileşimlerini Incelemek için Biolayer Interferometri (BLı) uygulaması

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...