Name: identification, histological characterization, and dissection of mouse prostate lobes for in vitro 3d spheroid culture models
Uploaded: 2018-09-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models at JoVE.com

وأيد هذا العمل المنحة من المعهد الوطني للسرطان، R01CA161018 إلى LK.

أجريت جميع التجارب الماوس الموصوفة هنا وفقا للمبادئ التوجيهية الواردة في البروتوكولات وافق IACUC المؤسسي في جامعة ولاية نيويورك شمال ولاية الجامعة الطبية.
1-تشريح الجهاز البولي التناسلي (UGS)
ملاحظة: يتم عرض التخطيطي في الشكل 1.
<ol><li>Euthanize ماوس C57B...

<ol>
	<li>Marks, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Human+Cancers+Consortium+(MMHCC)+from+the+NCI.">Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI.</a> Cancer Research. 65 (9 Supplement), 242-243 (2005).</li><li>Marks, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Human+Cancers+Consortium+(MMHCC)+from+the+NCI.">Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 2 (3-4), 111 (2009).</li><li>Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+mouse+cancer+models:+a+maze+of+opportunities+and+challenges.">Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges.</a> Cell. 163 (1), 39-53 (2015).</li><li>Society, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cancer Facts and Figures. , (2018).</li><li>Shappell, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+Pathology+of+Genetically+Engineered+Mice:+Definitions+and+Classification.+The+Consensus+Report+from+the+Bar+Harbor+Meeting+of+the+Mouse+Models+of+Human+Cancer+Consortium+Prostate+Pathology+Committee.">Prostate Pathology of Genetically Engineered Mice: Definitions and Classification. The Consensus Report from the Bar Harbor Meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee.</a> Cancer Research. 64 (6), 2270-2305 (2004).</li><li>Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+signature+of+the+mouse+prostate.">Expression signature of the mouse prostate.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (43), 36442-36451 (2005).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+epithelial+cell-specific+Cre+transgenic+mouse+model+for+tissue-specific+gene+ablation.">Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation.</a> Mechanisms of Development. 101 (1-2), 61-69 (2001).</li><li>Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+multilineage+differentiation+in+vitro+from+murine+prostate+stem+cells.">Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells.</a> Stem Cells. 25 (11), 2760-2769 (2007).</li><li>Hofner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+conditions+for+the+isolation+and+expansion+of+basal+prostate+progenitor+cells+of+mouse+and+human+origin.">Defined conditions for the isolation and expansion of basal prostate progenitor cells of mouse and human origin.</a> Stem Cell Reports. 4 (3), 503-518 (2015).</li><li>Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+cultivation+and+characterization+of+adult+murine+prostate+stem+cells.">Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (4), 702-713 (2010).</li><li>Clarke, M. F., Fuller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+cancer:+two+faces+of+eve.">Stem cells and cancer: two faces of eve.</a> Cell. 124 (6), 1111-1115 (2006).</li><li>Oliveira, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+prostate:+a+basic+anatomical+and+histological+guideline.">The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline.</a> Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).</li><li>Colicino, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravin+regulates+centrosome+function+through+PLK1.">Gravin regulates centrosome function through PLK1.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (5), 532-541 (2018).</li><li>Ittmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+prostate+cancer:+the+consensus+report+of+the+New+York+meeting+of+the+Mouse+Models+of+Human+Cancers+Consortium+Prostate+Pathology+Committee.">Animal models of human prostate cancer: the consensus report of the New York meeting of the Mouse Models of Human Cancers Consortium Prostate Pathology Committee.</a> Cancer Research. 73 (9), 2718-2736 (2013).</li><li>Valkenburg, K. C., Williams, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+prostate+cancer.">Mouse models of prostate cancer.</a> Prostate Cancer. 2011, 895238 (2011).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Abi1/Hssh3bp1+expression+induces+prostatic+intraepithelial+neoplasia+in+the+conditional+Abi1/Hssh3bp1+KO+mice.">Disruption of Abi1/Hssh3bp1 expression induces prostatic intraepithelial neoplasia in the conditional Abi1/Hssh3bp1 KO mice.</a> Oncogenesis. 1, e26 (2012).</li><li>Liao, C. P., Adisetiyo, H., Liang, M., Roy-Burman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+enhance+the+gland-forming+capability+of+prostate+cancer+stem+cells.">Cancer-associated fibroblasts enhance the gland-forming capability of prostate cancer stem cells.</a> Cancer Research. 70 (18), 7294-7303 (2010).</li></ol>

وتلخص هذه الورقة طرق تشريح البروستات الماوس وتحديد الهوية من الفصوص الفردية. ووصف أيضا هو بروتوكول لاستزراع خلايا البروستات الماوس في ثقافة 3D للتحليل في المختبر .
خطوة حاسمة في تشريح البروتوكول هو حصاد UGS كامل من الماوس (1) وفصل الأجهزة الفردية تحت مجهر تشريح. أنسجة البر...

ما فتئت تسعى الأوساط العلمية توضيح الآلية المعقدة للتنمية البشرية السرطان لعدة عقود. حين يبدأ تحديد اللاعبين الرئيسيين المحتملين وأهداف المخدرات مع خلايا المريض ودراسات الأنسجة، تطبيق متعدية الجنسيات مثل هذه النتائج غالباً ما يتطلب استخدام نماذج حيوانية قبل الإكلينيكية. استخدام الفئران المهندسة وراثيا نماذج (جيممس) للسرطانات البشرية نموذج ارتفع مطردا منذ إقامة "الماوس نماذج من البشر سرطانات الكونسورتيوم" (NCI-ممهكك)، لجنة الذي سعى إلى وصف وتوحيد الصفات المميزة للسرطان الماوس نماذج للعلماء في جميع أنحاء العالم1،2. نماذج الماوس تفي بالحاجة إلى الدراسات الميكانيكية في الدراسات ما قبل السريرية لمعظم أنواع السرطان، فهم في التنمية، والتقدم، استجابة للعلاج، واكتسبت مقاومة3.
سرطان البروستات هو السرطان الأكثر شيوعاً التي تحدث في الرجال، والتي تؤثر على الرجال أكثر من 160,000 كل سنة4. أشكال عدوانية من المرض تدعي عشرات آلاف أرواح كل عام. ومع ذلك، هو ما زالت غير مفهومة إليه تطور المرض. ينتج عن هذا نقص خطير في خيارات علاج فعال لسرطان البروستاتا المتقدم والمنتشر، كما يدل على ذلك ارتفاع معدل الوفيات في مرضى سرطان البروستاتا المتقدم4. ومن ثم، هناك حاجة متزايدة لنماذج ما قبل السريرية لدراسة سرطان البروستاتا. ومع ذلك، نظراً للخلافات المتأصلة بين الماوس والبروستاتا البشرية، النمذجة لسرطان البروستاتا في جيمس لم يحظ شعبية حتى تطبيق نظام "التصنيف بار هاربور" في عام 2004، الذي أوجز تغييرات نسيجية في الماوس البروستاتا عند التلاعب بالجينات وتحديد التغيرات الورمية، وعلاقتها بمراحل تطور السرطان في البشر5. من الخصائص الهامة للبروستاتا الماوس التي يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند دراسة أي نموذج جيمم البروستاتا هو وجود أربع متميزة أزواج من الفصوص: الأمامي والجانبي والبطني والظهريه. يقدم الفصوص اختلافات كبيرة في الأنسجة والجينات نمط التعبير6. يمكن أن يختلف نمط التعبير البروتين بروباسين بين الفصوص في الشباب بعد سن البلوغ الفئران7، التي يجب مراعاتها منذ معظمها صممت النماذج المستندة إلى لجنة المساواة العرقية جيمم مروج المستندة إلى بروباسين باستخدام استدعاء Pb-Cre47. الاختلافات المكانية والزمانية الناتجة في التعبير لجنة المساواة العرقية غالباً ما تؤدي إلى الاختلافات في مواعيد بدء وتطور الورم، فضلا عن الاختلافات في التغيرات الورمية بين الفصوص. ومن ثم، فمن المهم مراعاة لمثل هذه الخلافات أثناء دراسة التنمية ورم في البروستاتا جيمس، والفصوص الفردية قد تحتاج إلى تقييم كل على حدة لتحقيق النتائج استنساخه. ويصف الجزء الأول من هذه المقالة الأساليب المناسبة تشريح البروستاتا ماوس، وتحديد وفصل كل الفص والاعتراف بالفروق في غذائها الفصوص.
بينما تحليل نمو الأورام والأنسجة يمكن أن توفر أفكاراً قيمة في تطوير الورم، أنها لا توفر الكثير من المعلومات عن الآليات الجزيئية. دراسة إليه الورم التنمية والتقدم وغالباً مفيدة لتحليل الخلايا السرطانية في المختبر. تم اقتراح عدة أساليب على مر السنوات التي تنطوي على الثقافات لهذه الخلايا، بما في ذلك تعليق الثقافات والثقافات 3D8 ، وفي الآونة الأخيرة، الثقافات 2D العادية9. بينما يؤدي معظم هذه الأساليب في معدلات البقاء على قيد الحياة وانتشار الخلايا جيدة، ثقافات 3D توفر بيئة الأقرب إلى الظروف الفسيولوجية. في الثقافات 3D أو كروي نمت في مصفوفة خارج الخلية غشاء الطابق السفلي (ECM)، والخلايا لومينال متمايزة تماما عادة ما يكون معدل بقاء منخفضة جداً؛ الخلايا القاعدية والوسيطة (معظمها الخلايا الجذعية) غير قادرة على نشر وإنتاج مجموعات الخلية تسمى الماغنيسيوم10. وهذا يجعلها مناسبة لدراسة سرطان منذ سرطان طلائي يعتقد أنها تنشأ من الخلايا الجذعية (المعروفة شعبيا باسم الخلايا الجذعية السرطانية)11. ويصف الجزء الثاني من هذا البروتوكول طريقة لاستزراع خلايا البروستات الماوس في الثقافات 3D. يمكن استخدامها في المجالات الناتجة عن ذلك لعدة أنواع من التحليلات المتلقين للمعلومات، بما في ذلك دراسة مورفولوجية أورجانويد والسلوك بخلية يعيش التصوير، الفلورة تلطيخ للبروتينات المختلفة، ودراسة الردود على العلاج الكيميائي العلاجات.
عموما، والهدف من هذا البروتوكول بيان الأساليب المثلى لاستخدام نماذج الماوس في سرطان البروستاتا بوصف تقنيات التشريح والتشريح البروستاتا الماوس وتجهيز الأنسجة للثقافات كروي وتحليلها في المختبر .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1491px;" width="1491">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit)</td>
			<td style="width:260px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:196px;">MOUSEKIT</td>
			<td style="width:620px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">RPMI medium</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dissection medium (DMEM + 10%FBS)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>10438018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:415px;">PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Collagenase</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">17018029</td>
			<td>Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">DNase I</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001&#160;ROCHE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Syringes and Needles</td>
			<td style="width:260px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fisherbran&#160;Sterile Cell Strainers, 40&#956;m</td>
			<td style="width:260px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PrEGM BulletKit&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Lonza</td>
			<td>CC-3166</td>
			<td>Add all componenets, aliquot and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Matrigel membrane matrix</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dispase II powder</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">17105041</td>
			<td>Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification, histological characterization, and dissection of mouse prostate lobes for in vitro 3d spheroid culture models

نماذج الماوس المهندسة وراثيا (جيمس) تكون بمثابة نماذج قبل سريرية فعالة للتحقيق في معظم أنواع السرطانات البشرية، بما في ذلك سرطان البروستاتا (PCa). فهم التشريح وعلم الأنسجة البروستاتا الماوس مهم لكفاءة استخدام والتوصيف الصحيح لمثل هذه النماذج الحيوانية. وقد البروستاتا الماوس أربع متميزة أزواج من الفصوص، كل منها خصائصها. يوضح هذا المقال الأسلوب السليم للتشريح وتحديد الماوس الفصوص البروستاتا لتحليل الأمراض. بعد التشريح، خلايا البروستات يمكن كذلك مثقف في المختبر لفهم الميكانيكية. منذ الماوس خلايا البروستات الابتدائية تميل إلى فقدان خصائصها الطبيعية عندما مثقف في المختبر، ونحن مخطط هنا طريقة لعزل الخلايا وتنمو كالثقافات كروي ثلاثي الأبعاد، والتي فعالة للحفاظ على الفسيولوجية خصائص الخلايا. يمكن استخدام هذه الثقافات ثلاثي الأبعاد لتحليل مورفولوجيا الخلايا ومستويات السلوك في ظروف قرب الفسيولوجية، والتحقيق في تعديل وتعريب البروتينات الرئيسية وسبل المشاركة في تنمية وتطور المرض، ويبحث في ردود على العلاج بالعقاقير.

يمكن التعرف على الفصوص البروستاتا الماوس وتشريح استخدام مواقعها بالنسبة للحويصلات ومجرى البول. البروستاتا الماوس يتكون من 4 أزواج من الفصوص الواقعة دورسالي وبطنيا إلى الحويصلات ومجرى البول. الشكل 4a و 4b (أعلى) إظهار آراء الظهرية والبطني البروستا...

Watch this Scientific Journal Video about Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models at JoVE.com

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

تحديد وتوصيف النسيجي، وتشريح للماوس الفصوص البروستاتا لفي المختبر كروي 3D نماذج الثقافة

الفئران المهندسة وراثيا نماذج مفيدة للتحقيق وآليات سرطان البروستاتا. نقدم هنا بروتوكولا لتحديد وتشريح البروستاتا الفصوص من ماوس الجهاز البولي التناسلي والتفريق بينهم على أساس في علم الأنسجة، وعزل والثقافة خلايا البروستاتا الأولية في المختبر الماغنيسيوم لتحليلات المتلقين للمعلومات.

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في بدء نماذج الماوس المعدلة وراثيا من سرطان البروستاتا والتحقيق في آلية سرطان البروستاتا من خلال في التحليل في الجسم الحي وفي المختبر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتحليل كامل لنموذج فأر سرطان البروستاتا ، على طول الطريق من تشريح الأنسجة إلى عزل الخلايا واستزراعها. بعد تعريض الجهاز البولي التناسلي، أو UGS، فهم بقوة المثانة البولية مع ملقط حادة المتوسطة، ورفع النظام بأكمله من البطن الماوس.حرك زوجًا من المقصات تحت المثانة والبروستاتا وصولاً إلى العمود الفقري لإجراء شق من خلال الحبل الشوكي، وقطع من خلال أي اتصالات متبقية إلى تجويف البطن للسماح بإزالة UGS بالكامل. نقل UGS إلى طبق بيتري ستة سنتيمترات تحتوي على 2-6 ملليلتر من برنامج تلفزيوني تحت مجهر تشريح. واستخدام زوج من ملقط غرامة ومقص microdissection لمسح بعناية كل من الدهون من الجانبين على حد سواء الظهرية والبطينة من نظام الأنسجة دون قص أي أنسجة البروستاتا.عندما تم إزالة كل من الدهون، وسحب المثانة مع ملقط ومكوس المثانة في قاعدتها. وضع الجانب المتبقي من الأنسجة البطنية وعقد قناة واحدة ينتهي مع ملقط، اتبع السفينة إلى قاعدتها مع مقص ومكوس السفينة في قاعدتها. إزالة نفس السفينة على الجانب الآخر وإدراج ملقط بين الحياة المنوية والبروستاتا للسماح بالقنص من أي النسيج الضام المجاورة حسب الضرورة.ثم تتبع vesicles المنوية إلى قاعدتهم في مجرى البول وإزالة الأوعية دون ثقب لهم. عندما تم إزالة كلا من حويصلات، وضع الجانب الظهري الأنسجة حتى فصوص الظهر التي تشبه أجنحة فراشة مرئية. عقد كل فص الظهر مع ملقط، وقطع الأنسجة في قاعدتها مع مقص لجمع الفصوص الظهرية وتحويل الأنسجة إلى الجانب البطني.جمع فصوص الجانبية، والتي هي صغيرة وعادة ما التفاف مجرى البول على الجانب ويتم إسفين بين الفصوص الأمامية، البطنية، والضحلية بنفس الطريقة. جمع فصوص البطن، والتي هي أكبر من فصوص الجانبي والاستلقاء على مجرى البول البطين. ثم قطع والتخلص من مجرى البول لحصاد الفصوص الأمامية.لمعالجة أنسجة البروستاتا لثقافة 3D، نقل الفصوص إلى طبق 10 سنتيمترا تحتوي على اثنين إلى ثلاثة ملليلتر من DMEM، واستخدام مشرط لتمرم أنابيب البروستاتا بدقة ونس قدر الإمكان. نقل شظايا الأنسجة إلى غطاء نقّام نسيج معقّم وإضافة محلول الأنسجة إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر. جلب حجم في أنبوب يصل إلى تسعة ملليلتر مع المتوسطة الطازجة، وإضافة ملليلتر واحد من TenX الكولاجينازل حل الأسهم إلى خليط الأنسجة.بعد دوامة، احتضان الأنبوب مع اهتزاز لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية لتحلل المصفوفة خارج الخلية. في نهاية الحضانة، وجمع الأنسجة عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في مليلتر اثنين من شرائط 05٪ الحارة في EDTA. بعد خمس دقائق من 37 درجة مئوية لتسهيل شق الخلية إلى الخلية والتصاقات من خلية إلى مصفوفة، استخدم رأس أنبوب P1000 مع طرف لوحة واسعة ل triturate الأنسجة ثماني إلى 10 مرات لتفريق أي كتل.كرر الانفصال مع طرف P200 أنبوب الرأس. ثم تحييد التربسين مع ثلاثة ملليلتر من المتوسط الكامل. اخلط 500 وحدة من الحمض النووي DNASE1 في ملاط الأنسجة ومرر المحلل من خمس إلى عشر مرات من خلال حقنة من خمس ملليلتر مجهزة بإبرة من عيار 18، تليها خمس مرات من خلال إبرة من 20 مقياسًا.عندما لا تكون هناك قطع الأنسجة الكبيرة مرئية، تصفية التعليق من خلال مرشح 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. لطلاء الخلية والثقافة، وإعادة تعليق بيليه في 0.5 ملليلتر من خلية ظهارية كاملة البروستاتا متوسطة النمو، وتلميح الخلايا إلى خمس مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر من تركيز متوسط نمو الخلايا الظهارية البروستاتا. خلط الخلايا مع غشاء الطابق السفلي مصفوفة خارج الخلية في حجم اثنين إلى ثلاثة من نسبة الحل، وطبق تعليق الخلية في حاوية ثقافة الخلايا التجريبية المناسبة.ثم ضع الخلايا في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 30 دقيقة. عندما مصفوفة خارج الخلية قد توطدت، تغطية الثقافة مع ما قبل الدافئة كامل البروستاتا خلية ظهارية متوسطة النمو، مع الحرص على عدم إزعاج الغشاء السفلي مصفوفة خارج الخلية سد المكونات. ثم إعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة خمسة إلى 10 أيام ، منعش نصف الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام.لحصاد المجالات، وpirate المتوسطة بعناية دون إزعاج الغشاء السفلي مصفوفة هلام المكونات، وإضافة ملليلتر واحد من حل Disbase ل100 ميكرولترات من غشاء الطابق السفلي مصفوفة خارج الخلية. باستخدام مكشطة الخلية، كشط على طول الجزء السفلي من لوحة لرفع الهلام الغشاء الطابق السفلي خارج الخلية من الجزء السفلي من لوحة في افرحة، والأنابيب حتى حل كامل مرة واحدة لتفريق المكونات إلى قطع أصغر. احتضان قطع المصفوفة الخلوية الإضافية في حاضنة ثقافة الخلية لمدة ساعة إلى ساعتين حتى يذوب غشاء الطابق السفلي تماماً.ثم نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 15 ملليلتر. وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمزيد من التلاعب المصب. تتكون البروستاتا الماوس من أربعة أزواج من الفصوص تقع dorsally وببطين إلى vesicles المنوية ومجرى البول.تتكون فصوص البروستاتا من ملفات تعريف متعددة للغدة ، يتكون كل منها من تجويف ، وتحيط به خلايا ظهارية سرية. أشكال الفصوص ، وتنظيم الخلايا وطبيعة إفراز تختلف من الفص إلى الفص. خلايا البروستاتا المعزولة تبدأ في النمو في organoids في وقت مبكر من أربعة أيام بعد الغشاء السفلي ثقافة مصفوفة خارج الخلية.على مدى الأيام القادمة إلى ستة أيام، تنمو معظم الخلايا في مجالات صلبة مع جزء من المجالات التي تظهر التجويف الجزئي أو الكامل. تظهر spheroids أيضًا تلطخ بيتا قوية في تقاطعات الخلايا إلى الخلية التي تشارك في التعريب مع تلطيخ F-actin. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم جدًا اتباع خطوات الميكروستيون بدقة.على سبيل المثال، عزل فصوص البروستاتا بينما لا تزال تعلق على مجرى البول، حتى تعرف أي الفص الذي يستند إلى حيث هم فيما يتعلق مجرى البول. بعد إجراء التشريح، يمكن استخدام الفصوص المعزولة لتحليل المصب، مثل تسلسل RMA أو النشاف الغربي أو الكبت المناعي. تسمح لك تقنية الثقافة ثلاثية الأبعاد الأساسية بالحصول على مزيد من الرؤى حول آلية سرطان البروستاتا ، لأنه يمكنك مراقبة الحياة باستخدام الزفوات للتغيرات في مورفولوجيا والسلوك وتحديد أي تغييرات في الورم النورمي في نفس الشيء.باختصار، يمكن أن تدمج هذه الأساليب التشريحية وثقافة البروستاتا لمختلف التطبيقات المصب لتوفير معلومات قيمة للتحقيق في آلية سرطان البروستاتا باستخدام نماذج الماوس المعدلة وراثيا.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

نظام الثقافة 3D على أساس إدراج تصفية السريع لالبروستاتا الابتدائية تمايز الخلايا

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

تبخر تخفيض الشرط الثقافة يزيد من القدرة على التكاثر من متعددة الخلايا كروي التشكيل في صفيحة معايرة دقيقة

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

سيكتيونينغ الغدة الثديية يتصاعد كله لتحديد الآفة

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

اختبار في نموذج ثقافة خلية 3D على أساس كروي للرأس والرقبة الحرشفية خلية العلاج

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

نموذج 3D أورجانوتيبيك الميلانوما جلد كروي

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

تقييم صلاحية الخلية والموت في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

إنشاء نماذج Xenograft المستمدة من سرطان المعدة وخطوط الخلايا الأولية

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

نموذج Spheroid 3D كنظام أكثر فسيولوجية للتمييز الليفي المرتبطة بالسرطان والغزو في الدراسات المختبرية

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

تقييم قدره التمايز من الخلايا الظهاريه البروستاتا الماوس باستخدام الثقافة Organoid

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

توصيف آثار مثبطات Migrastatic على غزو الورم 3D Spheroid من قبل عالية الدقة المجهرية البؤرية

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...