Name: identification, histological characterization, and dissection of mouse prostate lobes for in vitro 3d spheroid culture models
Uploaded: 2018-09-18T14:30:00
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这项工作得到了国家癌症研究所 R01CA161018 的资助。

这里描述的所有鼠标实验都是根据 IACUC 州立大学北部医学院的机构批准的协议中所概述的指导原则进行的。
1. 泌尿生殖系统 (UGS) 解剖
注意: 示意图显示在图 1中。
<ol><li>弄死3月大的雄性 C57BL/6 鼠使用2吸入安乐死方法或另一种批准的技术。 注: 在3岁至12月之间的老鼠可以成功地用于实验。年长的老鼠 (> 6 月) 最有可能在 ...

<ol>
	<li>Marks, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Human+Cancers+Consortium+(MMHCC)+from+the+NCI.">Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI.</a> Cancer Research. 65 (9 Supplement), 242-243 (2005).</li><li>Marks, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Human+Cancers+Consortium+(MMHCC)+from+the+NCI.">Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 2 (3-4), 111 (2009).</li><li>Day, C. 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P., Adisetiyo, H., Liang, M., Roy-Burman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+enhance+the+gland-forming+capability+of+prostate+cancer+stem+cells.">Cancer-associated fibroblasts enhance the gland-forming capability of prostate cancer stem cells.</a> Cancer Research. 70 (18), 7294-7303 (2010).</li></ol>

本文概述了小鼠前列腺的解剖方法和单个裂片的鉴定。还描述了在3D 培养中培养小鼠前列腺细胞的方法, 用于体外分析。
解剖协议的一个关键步骤是 (1) 从鼠标中采集整个 UGS, 并在解剖显微镜下分离各个器官。前列腺组织非常小, 周围的 UGS 的其余部分;因此, 在获取所有四对裂片完好无损的情况下, 从体腔直接收割器官几乎是不可能的。因此, 重要的是从老鼠身上收获整?...

科学界一直在试图阐明几十年来人类癌症发展的复杂机制。虽然潜在的关键参与者和药物靶点的识别始于患者细胞和组织研究, 但这种发现的转化应用往往需要使用临床前动物模型。自从建立了人类癌症联盟 (MMHCC) 的老鼠模型, 一个试图描述和统一小鼠癌症特征的委员会以来, 利用基因工程小鼠模型 (GEMMs) 来建模人类癌症的模型已经稳步上升。模型为全世界科学家1,2。老鼠模型满足了机械研究的需要, 在临床前研究的大多数类型的癌症, 了解的发展, 进展, 反应治疗和后天抵抗3。
前列腺癌是男性最常见的癌症, 影响超过16万人, 每年4。这种疾病的侵袭性形式每年要求数以万计的生命。然而, 疾病进展的机制仍然是不清楚的。这导致严重缺乏有效的治疗方案的晚期和转移性前列腺癌, 这证明了高死亡率的高级前列腺癌患者4。因此, 研究前列腺癌的临床前模型越来越需要。然而, 由于老鼠和人前列腺之间的内在差异, GEMMs 的前列腺癌的建模直到2004年引入了酒吧港口分类系统, 才获得普及, 其中概述了小鼠的组织病理学变化。前列腺在基因操作, 肿瘤变化的鉴定和他们的关系到癌症进展的阶段在人5。在研究任何前列腺 GEMM 模型时, 必须考虑到小鼠前列腺的一个重要特征, 那就是存在四种截然不同的裂片: 前、侧、腹和背。叶在组织病理学和基因表达模式上存在显著差异6。Probasin 蛋白表达模式可以不同的裂片之间的年轻后青春期小鼠7, 这必须考虑, 因为基于 GEMM 模型主要是设计使用一个 Probasin 的助剂称为 Pb-Cre47。由此产生的空间和时间差异, 在创新表达往往导致差异的肿瘤启动和进展时限, 以及差异的癌症变化之间的裂片。因此, 在研究前列腺 GEMMs 肿瘤的发展时, 必须考虑到这种差异, 而个别的裂片可能需要单独评估以获得可重现的结果。本文的第一部分介绍了解剖小鼠前列腺的正确方法, 识别和分离每个裂片, 并识别出裂片之间的组织学差异。
而肿瘤生长和组织病理学的分析可以为肿瘤的发展提供有价值的见解, 但并没有提供关于分子机制的大量信息。为了研究肿瘤的发展和进展机制, 对肿瘤细胞的体外分析往往是有益的。多年来, 有几种方法涉及这些细胞的文化, 包括悬浮培养, 3D 文化8和最近, 正规2D 文化9。虽然这些方法中的大多数导致细胞存活率和增殖率很好, 但3D 的文化提供了一个最接近生理条件的环境。在基底膜细胞外基质 (ECM) 中生长的3D 或球形培养中, 完全分化的腔内细胞通常具有极低的生存率;然而, 基底和中间细胞 (主要是干细胞) 能够繁殖和产生细胞簇称为球体10。这使得它适合于癌症研究, 因为上皮癌被认为是来源于干细胞 (俗称癌症干细胞)11。本议定书的第二部分描述了在3D 培养中培养小鼠前列腺细胞的方法。所产生的球体可用于几种下游分析, 包括通过活细胞成像、免疫荧光染色、不同蛋白的 organoid 形态学和行为研究, 以及对化疗反应的研究。治疗。
总体而言, 本协议的目标是通过描述小鼠前列腺的解剖和解剖技术以及球形培养的组织处理和体外分析, 勾勒出在前列腺癌中使用小鼠模型的最佳方法。.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1491px;" width="1491">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit)</td>
			<td style="width:260px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:196px;">MOUSEKIT</td>
			<td style="width:620px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">RPMI medium</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dissection medium (DMEM + 10%FBS)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>10438018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:415px;">PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Collagenase</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">17018029</td>
			<td>Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">DNase I</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001&#160;ROCHE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Syringes and Needles</td>
			<td style="width:260px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fisherbran&#160;Sterile Cell Strainers, 40&#956;m</td>
			<td style="width:260px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PrEGM BulletKit&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Lonza</td>
			<td>CC-3166</td>
			<td>Add all componenets, aliquot and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Matrigel membrane matrix</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dispase II powder</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">17105041</td>
			<td>Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification, histological characterization, and dissection of mouse prostate lobes for in vitro 3d spheroid culture models

基因工程鼠模型 (GEMMs) 是研究大多数类型的人癌症, 包括前列腺癌 (PCa) 的有效的前临床模型。了解小鼠前列腺的解剖和组织学, 对于有效使用和正确描述这种动物模型是很重要的。小鼠前列腺有四不同的裂片, 各有各自的特点。本文对小鼠前列腺叶的解剖和鉴定方法进行了分析。解剖后, 前列腺细胞可以进一步培养,在体外为机械的理解。由于小鼠前列腺原代细胞在体外培养时往往失去正常的特征, 我们在此概述了一种分离细胞并将其生长为3D 球形培养的方法, 这对保持生理细胞的特征。这些3D 文化可用于分析近生理条件下的细胞形态和行为, 调查在疾病发展和进展过程中所涉及的关键蛋白质和通路的变化水平和定位, 并观察对药物治疗的反应。

小鼠前列腺裂片可以被辨认和解剖使用他们的位置关于精囊和尿道。小鼠前列腺由4对背和腹部的裂片组成, 用于精囊和尿道。图 4a和4b (顶部) 显示完整的前列腺的背部和腹部的看法, 连同精囊和尿道。底部的面板 (图 4c和4d) 显示了不同的裂片概述的标识。裂片可与小鼠分离3月。
<p class="jove_content" fo:k...

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Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

体外3D 球形培养模型小鼠前列腺叶的鉴定、组织学特征及解剖

基因工程鼠是研究前列腺癌机制的有用模型。在这里, 我们提出了一个协议, 以识别和解剖小鼠泌尿生殖系统前列腺裂片, 区分他们的组织学, 并分离和培养的原发性前列腺细胞体外作为球体的下游分析。

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

该方法有助于启动前列腺癌的基因工程小鼠模型，并通过体内和体外分析研究前列腺癌机理。该技术的主要优点是，它允许对前列腺癌小鼠模型进行完整的分析，从组织解剖到细胞分离和培养。暴露泌尿系统（UGS）后，用中等钝钳牢牢抓住膀胱，将整个系统从小鼠腹部抬起来。将一把剪刀滑到膀胱和前列腺下，一直滑到脊柱上，通过脊髓进行切口，并切断与腹腔的任何剩余连接，以便切除整个 UGS。在解剖显微镜下将 UGS 转移到含有 2 到 6 毫升 PBS 的六厘米培养皿中。使用一对细钳和微切除剪刀小心地清除组织系统后侧和腹侧的所有脂肪，而无需剪断任何前列腺组织。当所有的脂肪已被移除后，用钳子拉膀胱，并切除其底部的膀胱。将剩余的组织腹侧向上放置，用钳子握住一个管道末端，用剪刀将容器跟随到其底部，并在其底部切除容器。移除另一侧的同一容器，并在骨囊和前列腺之间插入钳子，以便必要时剪断任何相邻的结缔组织。然后追踪在尿道的开创性囊泡，并在不刺穿它们的情况下取出血管。当两个囊泡被切除后，将组织后侧向上放置，以便可以看到类似蝴蝶翅膀的后叶。用钳子握住每个支叶，用剪刀切割其底部的组织，以收集支点叶，将组织转向腹侧。收集侧叶，这是小，通常包裹尿道的一侧，并楔在前叶，内，腰和背叶之间以相同的方式。收集比横向叶大的腹叶，并躺在尿道上。然后切割并丢弃尿道以收获前叶。要处理前列腺组织进行3D培养，请将叶转移到含有2至3毫升DMEM的10厘米培养皿中，并使用手术刀尽可能精细、均匀地切碎前列腺管。将组织片段转移到无菌组织培养罩中，并将组织溶液添加到新的 15 毫升管中。用新鲜介质将管中的体积带到9毫升，并在组织混合物中加入1毫升的 TenX 胶原酶储存溶液。涡旋后，在37摄氏度下用震动孵育管子两小时，以降解细胞外基质。在孵育结束时，通过离心收集组织，并在EDTA中将颗粒重新悬浮在两毫升温暖的05%条中。在5分钟37摄氏度后，为了便于细胞对细胞和细胞对基质粘附的切割，使用P1000管头与宽板尖端三角组织8至10次，以分解任何团块。使用 P200 管头尖端重复分离。然后用三毫升的完整介质中和尝试素。将 500 个单位的 DNASE1 混合到组织浆中，通过装有 18 量针的 5 毫升注射器将溶液通过 5 到 10 次，然后通过 20 量针 5 次。当不再看到大组织碎片时，通过40微米过滤器将悬浮液过滤成50毫升的圆锥管，并通过离心收集细胞。对于细胞电镀和培养，将颗粒重新悬浮在0.5毫升完全前列腺上皮细胞生长介质中，并暗指细胞每毫升前列腺上皮细胞生长介质的5倍10至第五细胞。将细胞与基底膜外细胞基质以2至3个体积的溶液比混合，并在适当的实验细胞培养容器中镀块悬浮液。然后将细胞放在细胞培养箱中30分钟。当细胞外基质凝固后，用预热的完整前列腺上皮细胞生长介质覆盖培养物，注意不要打扰地下室膜外细胞基质塞。然后将细胞返回到细胞培养箱5至10天，每两到三天刷新一半的培养。要收获球体，请小心吸气介质，而不干扰地下室膜外细胞基质凝胶塞，并添加一毫升 Disbase 溶液，用于 100 微升的地下室膜外细胞基质。使用细胞刮刀，沿着板的底部刮擦，将基底膜外细胞凝胶从板的底部提升为上清液，并一次将整个溶液管起，将插头分解成更小的碎片。在细胞培养培养箱中孵育额外的细胞基质片段一到两个小时，直到地下室膜外细胞基质完全溶解。然后将细胞悬浮液转移到15毫升管。通过离心收集细胞，以进一步下游操作。小鼠前列腺由四对叶组成，这些叶位于骨泡和呼吸道上。前列腺叶由多个腺体轮廓组成，每个腺体由流明组成，周围是分泌的上皮细胞。叶的形状、细胞的组织和分泌物的性质因叶而异。分离的前列腺细胞早在地下室膜外细胞基质培养后四天就开始生长成器官。在接下来的一到六天里，大多数细胞成长为固体球体，其中一小部分球体表现出部分或完全流明。球体还演示了一种强β卡泰宁染色在细胞到细胞的交汇点，与F-actin染色共同本地化。在尝试此过程时，必须仔细执行微切除步骤。例如，分离前列腺叶，而他们仍然连接到尿道，所以你知道哪个叶是基于他们在哪里与尿道。在解剖程序之后，分离的叶可用于下游分析，如RMA测序、西游毛病或免疫污染。主要的 3D 培养技术允许您进一步深入了解前列腺癌机制，因为您可以使用球体监测生命形态和行为变化，并识别任何肿瘤变化。总之，这种前列腺解剖和培养方法可以融入到各种下游应用中，为利用基因工程小鼠模型研究前列腺癌的机理提供有价值的信息。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

基于插入 - 滤池3D文化系统原发性前列腺细胞分化

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

科研

癌症研究

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

蒸发减少培养条件的提高多细胞球体形成的微孔板重现

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

切片乳腺全身为病变鉴别

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

基于球形的头颈部鳞状细胞癌3D 细胞培养模型的治疗试验

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

3D 脊髓黑色素瘤球形皮肤模型

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

评估癌细胞3D球形培养中的细胞活力和死亡

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

建立胃癌患者衍生异种移植模型和原细胞系

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

3D球形模型作为癌症相关纤维细胞分化和入侵体内研究的更多生理系统

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

利用有机体培养评价小鼠前列腺皮细胞的分化能力

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

通过高分辨率共聚焦显微镜对3D肿瘤球体入侵的影响表征

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...