Name: identification, histological characterization, and dissection of mouse prostate lobes for in vitro 3d spheroid culture models
Uploaded: 2018-09-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Cancer Institute, R01CA161018 til LK.

Alle mus eksperimenter beskrevet her blev udført efter retningslinjerne i de institutionelle IACUC-godkendte protokoller på SUNY Upstate medicinske universitet.
1. det urogenitale System (UGS) dissektion
Bemærk: Skematiske er præsenteret i figur 1.
<ol><li>Aflive en 3-måned-forhenværende mandlige C57BL/6 mus ved hjælp af metoden CO2 slimhindeirritation eutanasi eller en anden godkendt teknik. Bemærk: Mus i aldere...

<ol>
	<li>Marks, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Human+Cancers+Consortium+(MMHCC)+from+the+NCI.">Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI.</a> Cancer Research. 65 (9 Supplement), 242-243 (2005).</li><li>Marks, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Human+Cancers+Consortium+(MMHCC)+from+the+NCI.">Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 2 (3-4), 111 (2009).</li><li>Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+mouse+cancer+models:+a+maze+of+opportunities+and+challenges.">Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges.</a> Cell. 163 (1), 39-53 (2015).</li><li>Society, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cancer Facts and Figures. , (2018).</li><li>Shappell, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+Pathology+of+Genetically+Engineered+Mice:+Definitions+and+Classification.+The+Consensus+Report+from+the+Bar+Harbor+Meeting+of+the+Mouse+Models+of+Human+Cancer+Consortium+Prostate+Pathology+Committee.">Prostate Pathology of Genetically Engineered Mice: Definitions and Classification. The Consensus Report from the Bar Harbor Meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee.</a> Cancer Research. 64 (6), 2270-2305 (2004).</li><li>Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+signature+of+the+mouse+prostate.">Expression signature of the mouse prostate.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (43), 36442-36451 (2005).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+epithelial+cell-specific+Cre+transgenic+mouse+model+for+tissue-specific+gene+ablation.">Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation.</a> Mechanisms of Development. 101 (1-2), 61-69 (2001).</li><li>Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+multilineage+differentiation+in+vitro+from+murine+prostate+stem+cells.">Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells.</a> Stem Cells. 25 (11), 2760-2769 (2007).</li><li>Hofner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+conditions+for+the+isolation+and+expansion+of+basal+prostate+progenitor+cells+of+mouse+and+human+origin.">Defined conditions for the isolation and expansion of basal prostate progenitor cells of mouse and human origin.</a> Stem Cell Reports. 4 (3), 503-518 (2015).</li><li>Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+cultivation+and+characterization+of+adult+murine+prostate+stem+cells.">Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (4), 702-713 (2010).</li><li>Clarke, M. F., Fuller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+cancer:+two+faces+of+eve.">Stem cells and cancer: two faces of eve.</a> Cell. 124 (6), 1111-1115 (2006).</li><li>Oliveira, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+prostate:+a+basic+anatomical+and+histological+guideline.">The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline.</a> Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).</li><li>Colicino, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravin+regulates+centrosome+function+through+PLK1.">Gravin regulates centrosome function through PLK1.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (5), 532-541 (2018).</li><li>Ittmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+prostate+cancer:+the+consensus+report+of+the+New+York+meeting+of+the+Mouse+Models+of+Human+Cancers+Consortium+Prostate+Pathology+Committee.">Animal models of human prostate cancer: the consensus report of the New York meeting of the Mouse Models of Human Cancers Consortium Prostate Pathology Committee.</a> Cancer Research. 73 (9), 2718-2736 (2013).</li><li>Valkenburg, K. C., Williams, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+prostate+cancer.">Mouse models of prostate cancer.</a> Prostate Cancer. 2011, 895238 (2011).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Abi1/Hssh3bp1+expression+induces+prostatic+intraepithelial+neoplasia+in+the+conditional+Abi1/Hssh3bp1+KO+mice.">Disruption of Abi1/Hssh3bp1 expression induces prostatic intraepithelial neoplasia in the conditional Abi1/Hssh3bp1 KO mice.</a> Oncogenesis. 1, e26 (2012).</li><li>Liao, C. P., Adisetiyo, H., Liang, M., Roy-Burman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+enhance+the+gland-forming+capability+of+prostate+cancer+stem+cells.">Cancer-associated fibroblasts enhance the gland-forming capability of prostate cancer stem cells.</a> Cancer Research. 70 (18), 7294-7303 (2010).</li></ol>

Dette papir beskriver metoder til dissektion af musen prostata og identifikation af individuelle fliger. Også beskrevet er protokol til dyrkning mus prostata celler i en 3D kultur for in vitro- analyse.
Et kritisk trin i dissektion protokol er (1) høst det hele UGS ud af musen og adskille de enkelte organer under et mikroskop for dissektion. Den prostata væv er meget små og er omgivet af resten af UGS; Det er således næsten umuligt at høste orgel direkte fra kroppen hulrum mens...

Det videnskabelige samfund har forsøgt at belyse den komplekse mekanisme af udviklingen af menneskelige kræft i årtier. Identifikation af mulige nøgleaktører og narkotika mål begynder med patientens celler og væv undersøgelser, kræver translationel anvendelsen af sådanne resultater ofte brug af prækliniske dyremodeller. Brugen af gensplejsede mus modeller (GEMMs) til model menneskelige kræftformer steget støt siden oprettelsen af mus modeller af menneskelige kræftformer konsortiet (NCI-MMHCC), et udvalg, der søgte at beskrive og forene Karakteristik af musen kræft modeller for forskere over hele verden1,2. Musemodeller opfylde behovet for Mekanistiske undersøgelser i prækliniske studier af de fleste typer af kræft, for at forstå udviklingen, progression, svar på behandlinger, og erhvervet modstand3.
Prostatakræft er den hyppigst forekommende kræftform hos mænd, der berører mere end 160.000 mænd hvert år4. Aggressive former af sygdommen hævder tusindvis af liv hvert år. Men mekanismen af sygdomsprogression er stadig dårligt forstået. Dette resulterer i en alvorlig mangel på effektive behandlingsmuligheder for avancerede og metastatisk prostatakræft, som det fremgår af den høje dødelighed i fremskreden prostatacancer patienter4. Derfor, er der et voksende behov for prækliniske modeller at studere prostatakræft. Men på grund af de iboende forskelle mellem mus og menneskelig prostata, modellering af prostatakræft i GEMMs ikke vinde popularitet indtil Bar Harbor klassificeringssystem, som blev indført i 2004, som skitserede histopatologiske forandringer i mus prostata ved genmanipulation, identifikation af neoplastiske forandringer og deres relation til stadier af kræft progression i mennesker5. En vigtig egenskab ved musen prostata, der skal tages i betragtning samtidig studerer enhver prostata CLAUSS model er tilstedeværelsen af fire særskilte par lapper: anterior, laterale, ventrale og dorsale. Lapper præsentere væsentlige forskelle i histopatologi og gen udtryk mønster6. Probasin protein udtryk mønster kan variere mellem lapper i unge efter puberteten mus7, der må betragtes da Cre-baserede CLAUSS modeller er for det meste konstrueret ved hjælp af en probasin-baseret promotor kaldet Pb-Cre47. De resulterende rumlige og tidsmæssige forskelle i Cre udtryk ofte føre til forskelle i tumor indledningen og progression tidslinjer samt forskelle i neoplastiske forandringer mellem lapper. Derfor er det vigtigt at tage højde for sådanne forskelle samtidig studerer tumor udvikling i prostata GEMMs, og de enkelte kamre kan skal vurderes særskilt for at opnå reproducerbare resultater. Den første del af denne artikel beskriver de rette metoder til at dissekere en mus prostata, identificere og adskille hver lap og anerkender de histologiske forskelle mellem lapper.
Mens analyse af tumorvækst og histopatologi kan give værdifuld indsigt i tumor udvikling, giver de ikke mange oplysninger om molekylære mekanismer. For at studere mekanismen af tumor udvikling og progression, er det ofte nyttigt at analysere tumor celler in vitro. Flere metoder er blevet foreslået i de år, der involverer kulturer af disse celler, herunder suspension kulturer, 3D kulturer8 og for nylig, regelmæssig 2D kulturer9. De fleste af disse metoder medfører god celle overlevelse og spredning satser, skabe 3D kulturer et miljø, der er tættest på fysiologiske tilstande. I 3D eller klumpformet kulturer dyrkes i en basalmembran ekstracellulære matrix (ECM), har fuldt differentierede luminale cellerne normalt meget lav overlevelsesrate; basal og mellemliggende celler (for det meste stamceller) er imidlertid at udbrede og producere celle klynger kaldet spheroids10. Dette gør den velegnet til en kræft undersøgelse, da epitelial kræft menes at stamme fra stamceller (populært kendt som kræftstamceller)11. Den anden del af denne protokol beskriver en metode til dyrkning af musen prostata celler i 3D kulturer. De resulterende kugler kan bruges til flere typer af downstream analyser, herunder undersøgelse af organoid morfologi og adfærd af levende celle imaging, immunofluorescens farvning for forskellige proteiner, og studiet af svar til kemoterapeutiske behandlinger.
Samlet, målet med denne protokol er at skitsere optimale metoder til at bruge musemodeller i prostatakræft ved at beskrive teknikker for anatomi og dissektion af musen prostata og behandling af væv til klumpformet kulturer og in vitro- analyse .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1491px;" width="1491">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit)</td>
			<td style="width:260px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:196px;">MOUSEKIT</td>
			<td style="width:620px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">RPMI medium</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dissection medium (DMEM + 10%FBS)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>10438018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:415px;">PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Collagenase</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">17018029</td>
			<td>Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">DNase I</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001&#160;ROCHE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Syringes and Needles</td>
			<td style="width:260px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fisherbran&#160;Sterile Cell Strainers, 40&#956;m</td>
			<td style="width:260px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PrEGM BulletKit&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Lonza</td>
			<td>CC-3166</td>
			<td>Add all componenets, aliquot and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Matrigel membrane matrix</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dispase II powder</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">17105041</td>
			<td>Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification, histological characterization, and dissection of mouse prostate lobes for in vitro 3d spheroid culture models

Gensplejsede musemodeller (GEMMs) fungerer som effektiv prækliniske modeller for at undersøge de fleste typer af menneskelige kræftformer, herunder prostatakræft (PCa). Forståelse af anatomi og histologi af musen prostata er vigtigt for effektiv brug og ordentlig karakterisering af sådanne animal modeller. Musen prostata har fire særskilte par kamre, hver med deres egne karakteristika. Denne artikel viser den korrekte metode til dissektion og identifikation af musen prostata lapper for sygdom analyse. Efter dissektion, prostata celler kan være yderligere kultiveret in vitro- for mekanistisk forståelse. Da musen prostata primærelementer tendens til at miste deres normale egenskaber når kulturperler i vitro, vi skitsere her en metode til at isolere cellerne og voksende dem som 3D klumpformet kulturer, som er effektiv for at bevare den fysiologiske Karakteristik af cellerne. Disse 3D kulturer kan bruges til at analysere celle morfologi og adfærd i nær-fysiologiske tilstande, undersøger ændrede niveauer og lokaliseringer af vigtige proteiner og veje er involveret i udviklingen og progression af en sygdom, og ser på svar til medicinsk behandling.

Musen prostata lapper kan identificeres og dissekeret ved hjælp af deres placeringer Sædblærer og urinrøret. Musen prostata består af 4 par lapper beliggende dorsalt og ventrally Sædblærer og urinrøret. Figur 4a og 4b (top) Vis intakt prostata, Sædblærer og urinrøret dorsal og ventral synspunkter. Panelerne bunden (figur 4 c og 4 d) viser de forskellige kamre skitseret for identifikati...

Watch this Scientific Journal Video about Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models at JoVE.com

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Identifikation, histologiske karakteristika og dissektion af musen prostata lapper til i Vitro 3D klumpformet kultur modeller

Gensplejsede mus er nyttige modeller for at undersøge prostatakræft mekanismer. Her præsenterer vi en protokol for at identificere og dissekere prostata lapper fra en mus urogenitale system, differentiere dem baseret på histologi, og isolere og kultur primære prostata celler in vitro- som spheroids for downstream analyser.

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Denne metode kan hjælpe i starten af genetisk manipuleret mus modeller af prostatakræft og undersøgelse af prostatakræft mekanisme gennem in vivo og in vitro analyse. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver mulighed for en komplet analyse af prostatakræft musemodel, hele vejen fra væv dissektion til celleisolering og dyrkning. Efter at have udsat det urogenitale system, eller UGS, fast gribe urinblæren med medium stumpe kraftbuner, og løft hele systemet op fra musen maven.Skub en saks under blæren og prostata hele vejen til rygsøjlen for at foretage et snit gennem rygmarven, og skær gennem eventuelle resterende forbindelser til bughulen for at tillade fjernelse af hele UGS. Ugs overføres til en seks centimeter petriskål, der indeholder to til seks milliliter PBS under et dissekerende mikroskop. Og bruge et par fine arpper og microdissection saks til omhyggeligt at rydde alle fedt fra både dorsale og ventrale sider af vævssystemet uden at klippe nogen prostata væv.Når alt fedtet er fjernet, trække blæren med stænde og punktafgifter blæren på sin base. Den resterende vævsventilalside sættes op og holder en kanal ender med spån, følg beholderen til sin base med en saks og punktafgifter beholderen på sin base. Den samme beholder fjernes på den anden side, og der indsættes syrb mellem sædberne og prostata, så eventuelt tilstødende bindevæv kan klippes.Derefter spore sædlige vesikler til deres base på urinrøret og fjerne fartøjerne uden at punktere dem. Når begge vesikler er blevet fjernet, skal du placere vævsdiskralsiden op, så dorsale lapper, der ligner en sommerfugls vinger, er synlige. Holde hver dorsale lap med snævler, skæres vævet på sin base med en saks til at indsamle dorsale lapper og drej vævet til ventrale side.Saml de laterale lapper, som er små og normalt wrap urinrøret på siden og er kilet mellem den forreste, ventrale, og dorsale lapper på samme måde. Saml ventrale lapper, som er større end de laterale lapper og ligge på urinrøret ventralt. Derefter skæres og kassere urinrøret til at høste de forreste lapper.For at behandle prostatavæv til 3D-kultur, overføre lapperne til en 10-centimeter skål, der indeholder to til tre milliliter DMEM, og bruge en skalpel til at hakke prostata tubuli så fint og jævnt som muligt. Overfør vævsfragmenterne til en steril vævskulturhætte, og tilsæt vævsopløsningen til et nyt 15-milliliterrør. Bring volumen i røret op til ni milliliter med frisk medium, og tilsæt en milliliter TenX collagenase bestand opløsning til vævsblandingen.Efter vortexing, inkubere røret med omrystning i to timer ved 37 grader Celsius at nedbryde den ekstracellulære matrix. Ved inkubationens afslutning opsamres vævet ved centrifugering, og pelletsen suspenderes igen i to milliliter varme 05%strips i EDTA. Efter fem minutter af 37 grader Celsius at lette kløvning af celle-til-celle og celle-til-matrix sammenvoksninger, bruge en P1000 pipehead med en bred bord spids til triturate vævet otte til 10 gange for at bryde op eventuelle klumper.Gentag dissociationen med en P200 pipehead spids. Derefter neutralisere trypsin med tre milliliter komplet medium. Bland 500 enheder AF DNASE1 i vævsslamenry og før opløsningen fem til 10 gange gennem en fem millilitersprøjte udstyret med en 18-gauge nål efterfulgt af fem gange gennem en 20-gauge nål.Når der ikke er flere store vævsstykker, filtreres suspensionen gennem et 40-mikrometerfilter i et konisk rør på 50 milliliter, og cellerne indsamles ved centrifugering. For celleplettering og kultur, re-suspendere pellet i 0,5 milliliter af komplet prostata epitelcelle vækstmedium, og hentyder cellerne til en fem gange 10 til den femte celler pr milliliter prostata epitelcellevækst medium koncentration. Bland cellerne med kældermembran ekstracellulære matrix på en to til tre volumen af opløsningsforhold, og plade celle suspension i den relevante eksperimentelle celle kultur beholder.Placer derefter cellerne i en cellekulturskuvøse i 30 minutter. Når den ekstracellulære matrix er størknet, dække kulturen med forvarperede komplette prostata epitelcellevækstmedium, idet man passe på ikke forstyrrer kældermembranen ekstracellulære matrixstik. Derefter returnere cellerne til cellekultur inkubator i fem til 10 dage, forfriskende halvdelen af mediet hver to til tre dage.At høste kugler, aspirere mediet omhyggeligt uden at forstyrre kælderen membran ekstracellulære matrix gel stik, og tilsæt en milliliter Disbase løsning til 100 mikroliter af kælderen membran ekstracellulære matrix. Brug en celle skraber, skrabe langs bunden af pladen til at løfte kælderen membran ekstracellulære geler fra bunden af pladen i supernatant, og rør op hele opløsningen én gang for at bryde op stikket i mindre stykker. Inkuber de ekstra cellulære matrixstykker i cellekulturskuvøsen i en til to timer, indtil kældermembranens ekstracellulære matrix er helt opløst.Overfør derefter cellesuspensionen til et 15-milliliterrør. Og indsamle cellerne ved centrifugering for yderligere downstream manipulation. Musen prostata er sammensat af fire par lapper placeret dorsally og ventrally til sædblæsere og urinrøret.Prostata lapper er sammensat af flere kirtel profiler, hver består af en lumen, omgivet af sekretoriske epitelceller. Lappernes former, cellernes organisation og udskillelsens art varierer fra lap til lap. De isolerede prostataceller begynder at vokse ind i organoider så tidligt som fire dage efter kældermembranen ekstracellulære matrix kultur.I løbet af de næste en til seks dage, vokser de fleste af cellerne til faste kugler med en brøkdel af kuglerne udviser en delvis eller fuld lumen. De sfæroider også demonstrere en stærk beta catenin farvning på celle-til-celle kryds, der co-lokalisere med F-actin farvning. Mens du forsøger denne procedure, er det meget vigtigt at følge omhyggeligt mikrodissektion trin.For eksempel isolere prostata lapper, mens de stadig er knyttet til urinrøret, så du ved, hvilken lap er, der er baseret på, hvor de er med hensyn til urinrøret. Efter dissektionsproceduren kan de isolerede lapper anvendes til downstream-analyse, såsom RMA-sekvensering, vestlig blotting eller immunstaining. Den primære 3D-kulturteknik giver dig mulighed for at få yderligere indsigt i prostatakræftmekanismen, fordi du kan overvåge livet med sfæriske stoffer for morfologi og adfærdsændringer og identificere eventuelle neoplastiske ændringer i det samme.Sammenfattende kan denne prostata dissektion og kultur metoder indarbejde til forskellige downstream applikationer til at give værdifulde oplysninger til undersøgelse af mekanismen for prostatakræft ved hjælp af genetisk manipuleret musemodeller.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

En hurtig Filterindsats-baserede 3D Kultur System for Primær Prostata Cell Differentiering

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

Fordampning-reducerende Kultur Betingelse Øger Reproducerbarhed af flercellet Sfæroide Formation i mikrotiterplader

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Sektion Mammary Gland Hele Montage til Lesion Identifikation

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Terapi test i en klumpformet-baseret 3D celle kultur Model for hoved og hals planocellulært karcinom

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

En 3D Organotypic melanom klumpformet hudmodel

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Vurdering cellelevedygtighed og død i 3D Spheroid kulturer af kræftceller

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablering af gastrisk Cancer patient afledte xenograft-modeller og primære cellelinjer

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

En 3D Spheroid model som et mere fysiologisk system for kræft-associeret fibroblaster differentiering og invasion in vitro undersøgelser

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Evaluering af differentierings kapaciteten af mus prostata Epiteliale celler ved hjælp af Organoid kultur

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering af virkningerne af Migrastatiske hæmmere på 3D tumor Spheroid invasion af høj opløsning Konfokal mikroskopi

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...