Name: identification, histological characterization, and dissection of mouse prostate lobes for in vitro 3d spheroid culture models
Uploaded: 2018-09-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המענק מ מכון הסרטן הלאומי, R01CA161018 לדבר.

כל הניסויים העכבר המתוארים כאן בוצעו על פי הנחיות המפורטות הפרוטוקולים שאושרו על-ידי IACUC מוסדי באוניברסיטה הרפואי SUNY בצפון המדינה.
1. ניתוח מערכת השתן (UGS)
הערה: התרשים מוצג באיור1.
<ol><li>בן 3 חודשים זכר C57BL/6 עכבר באמצעות שיטת המתת חסד inhalational2</su...

<ol>
	<li>Marks, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Human+Cancers+Consortium+(MMHCC)+from+the+NCI.">Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI.</a> Cancer Research. 65 (9 Supplement), 242-243 (2005).</li><li>Marks, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Human+Cancers+Consortium+(MMHCC)+from+the+NCI.">Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 2 (3-4), 111 (2009).</li><li>Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+mouse+cancer+models:+a+maze+of+opportunities+and+challenges.">Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges.</a> Cell. 163 (1), 39-53 (2015).</li><li>Society, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cancer Facts and Figures. , (2018).</li><li>Shappell, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+Pathology+of+Genetically+Engineered+Mice:+Definitions+and+Classification.+The+Consensus+Report+from+the+Bar+Harbor+Meeting+of+the+Mouse+Models+of+Human+Cancer+Consortium+Prostate+Pathology+Committee.">Prostate Pathology of Genetically Engineered Mice: Definitions and Classification. The Consensus Report from the Bar Harbor Meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee.</a> Cancer Research. 64 (6), 2270-2305 (2004).</li><li>Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+signature+of+the+mouse+prostate.">Expression signature of the mouse prostate.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (43), 36442-36451 (2005).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+epithelial+cell-specific+Cre+transgenic+mouse+model+for+tissue-specific+gene+ablation.">Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation.</a> Mechanisms of Development. 101 (1-2), 61-69 (2001).</li><li>Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+multilineage+differentiation+in+vitro+from+murine+prostate+stem+cells.">Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells.</a> Stem Cells. 25 (11), 2760-2769 (2007).</li><li>Hofner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+conditions+for+the+isolation+and+expansion+of+basal+prostate+progenitor+cells+of+mouse+and+human+origin.">Defined conditions for the isolation and expansion of basal prostate progenitor cells of mouse and human origin.</a> Stem Cell Reports. 4 (3), 503-518 (2015).</li><li>Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+cultivation+and+characterization+of+adult+murine+prostate+stem+cells.">Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (4), 702-713 (2010).</li><li>Clarke, M. F., Fuller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+cancer:+two+faces+of+eve.">Stem cells and cancer: two faces of eve.</a> Cell. 124 (6), 1111-1115 (2006).</li><li>Oliveira, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+prostate:+a+basic+anatomical+and+histological+guideline.">The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline.</a> Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).</li><li>Colicino, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravin+regulates+centrosome+function+through+PLK1.">Gravin regulates centrosome function through PLK1.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (5), 532-541 (2018).</li><li>Ittmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+prostate+cancer:+the+consensus+report+of+the+New+York+meeting+of+the+Mouse+Models+of+Human+Cancers+Consortium+Prostate+Pathology+Committee.">Animal models of human prostate cancer: the consensus report of the New York meeting of the Mouse Models of Human Cancers Consortium Prostate Pathology Committee.</a> Cancer Research. 73 (9), 2718-2736 (2013).</li><li>Valkenburg, K. C., Williams, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+prostate+cancer.">Mouse models of prostate cancer.</a> Prostate Cancer. 2011, 895238 (2011).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Abi1/Hssh3bp1+expression+induces+prostatic+intraepithelial+neoplasia+in+the+conditional+Abi1/Hssh3bp1+KO+mice.">Disruption of Abi1/Hssh3bp1 expression induces prostatic intraepithelial neoplasia in the conditional Abi1/Hssh3bp1 KO mice.</a> Oncogenesis. 1, e26 (2012).</li><li>Liao, C. P., Adisetiyo, H., Liang, M., Roy-Burman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+enhance+the+gland-forming+capability+of+prostate+cancer+stem+cells.">Cancer-associated fibroblasts enhance the gland-forming capability of prostate cancer stem cells.</a> Cancer Research. 70 (18), 7294-7303 (2010).</li></ol>

מאמר זה מתאר שיטות ניתוח הערמונית עכבר וזיהוי של האונות נפרדות. תיאר גם הוא הפרוטוקול עבור culturing בתאי הערמונית עכבר תרבות 3D לניתוח במבחנה .
שלב קריטי בפרוטוקול הקרע הוא (1) לקצור את UGS כולו מתוך העכבר הפרדת האיברים בודדים מתחת למיקרוסקופ לנתיחה. רקמת הערמונית הוא מאוד קטן...

הקהילה המדעית מנסה להבהיר את מנגנון מורכב של התפתחות סרטן אנושי במשך עשרות שנים. ואילו זיהוי של שחקני המפתח פוטנציאליים סמים מטרות מתחיל עם החולה תאים, רקמות מחקרים, היישום translational של ממצאים כאלה לעיתים קרובות דורשת את השימוש במודלים ניסויים פרה-קליניים. השימוש של עכברים מהונדסים גנטית מודלים (GEMMs) כדי סרטן אנושיים דגם עלתה בהתמדה מאז הקמת העכבר מודלים של האדם סרטן Consortium (NCI-MMHCC), ועדה אשר ביקשו לתאר ולאחד את מאפייני העכבר סרטן מודלים עבור מדענים ברחבי העולם1,2. העכבר מודלים למלא את הצורך ללימודי מכניסטית במחקרים קליניים של רוב סוגי סרטן, להבנת התפתחות, התקדמות, מענה טיפולי, ונרכשה ההתנגדות3.
סרטן הערמונית הוא הסרטן הנפוצות אצל גברים, להשפיע על גברים מעל 160,000 בכל שנה4. צורות אגרסיבי של המחלה טוענים עשרות אלפי אנשים כל שנה. עם זאת, המנגנון של התקדמות המחלה עדיין ממעטים להבין. התוצאה היא חוסר רציני של אפשרויות טיפול יעיל עבור סרטן הערמונית מתקדם ולא גרורתי, כפי שמעידים אחוזי התמותה הגבוהים חולי סרטן הערמונית מתקדם4. לפיכך, יש צורך הולך וגדל עבור מודלים קליניים ללמוד סרטן הערמונית. עם זאת, בשל ההבדלים הטבועים בין העכבר על הערמונית אנושי, מידול של סרטן הערמונית אצל GEMMs לא לנפוצים בשימוש עד מערכת סיווג ב"באר הארבור הוצג ב-2004, אשר התווה שינויים histopathological העכבר הערמונית על מניפולציה גנטית, זיהוי של שינויים אמצעים, והקשר שלהם בשלבים של התקדמות סרטן בני5. מאפיין חשוב אחד של הערמונית עכבר שיש לקחת בחשבון תוך כדי לימוד כל דגם GEMM הערמונית הוא הנוכחות של ארבעה זוגות ברורים של אונות: קדמי, לרוחב, הגחון ו הגבי. האונות מציגים הבדלים משמעותיים ב- histopathology וג'ין ביטוי דפוס6. חלבון probasin ביטוי דפוס יכול להשתנות בין האונות ב עכברים צעירים שלאחר גיל ההתבגרות7, אשר יש לקחת בחשבון מאז מודלים מבוססי-Cre GEMM מיועדים בעיקר באמצעות promotor מבוסס על probasin שנקרא Pb-Cre47. ההבדלים יכולות וכתוצאה מכך Cre ביטוי לעיתים קרובות להוביל הבדלים בין צירי זמן, החניכה, התקדמות, גידול, כמו גם הבדלים בין אמצעים שינויים בין האונות. לפיכך, חשוב להביא בחשבון הבדלים כאלה תוך כדי לימוד התפתחות גידולים בערמונית GEMMs, האונות נפרדות ייתכן צורך להעריך בנפרד על מנת להשיג תוצאות לשחזור. החלק הראשון של מאמר זה מתאר את השיטות נכונה לנתח בלוטת ערמונית העכבר, לזהות להפריד בין האונה כל ושל לזהות את ההבדלים היסטולוגית בין האונות.
בזמן הניתוח של הגידול, histopathology יכול לספק ערך תובנות להתפתחות הגידול, הם אינם מספקים מידע רב אודות המנגנונים המולקולריים. ללמוד את המנגנון של התפתחות גידולים והתקדמות, הוא לעיתים קרובות שימושי לנתח את תאי הגידול בתוך חוץ גופית. מספר שיטות שהוצעו במהלך השנים המערבות תרביות של תאים אלה, לרבות השעיה תרבויות, תרבויות תלת-ממד8 ובתרבויות לאחרונה, 2D קבוע9. בעוד רוב השיטות האלה כתוצאה בשיעורי ההישרדות והתפשטות תאים טובה, התרבויות 3D לספק סביבה הקרובה ביותר בתנאים פיזיולוגיים. 3D או ספרואיד תרבויות גדל מטריצה חוץ-תאית קרום המרתף (ECM), התאים luminal הבדיל לחלוטין בדרך כלל יש שיעור הישרדות נמוך מאוד; עם זאת, התאים הבזליים וביניים (בעיקר תאי גזע) מסוגלים להפיץ ולייצר אשכולות תא שנקרא spheroids10. דבר זה הופך מתאימים למחקר סרטן מאז סרטן אפיתל הסברה שמקורם בתאי גזע (הידוע בכינויו תאי הגזע הסרטניים)11. החלק השני של פרוטוקול זה מתאר שיטה culturing תאי הערמונית עכבר בתרבויות תלת-ממד. הכדורים וכתוצאה מכך יכול לשמש עבור מספר סוגי ניתוחים במורד הזרם, המחקר של מורפולוגיה תא צורב והתנהגות לתא חי הדמיה, immunofluorescence מכתים חלבונים שונים, כולל המחקר של התגובות כימותרפיות טיפולים.
בסך הכל, המטרה של פרוטוקול זה היא להתוות את שיטות האופטימלי עבור באמצעות העכבר מודלים ב סרטן הערמונית על ידי המתארת את האנטומיה וטכניקות דיסקציה של הערמונית עכבר, העיבוד של הרקמה ספרואיד תרבויות וניתוח במבחנה .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1491px;" width="1491">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit)</td>
			<td style="width:260px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:196px;">MOUSEKIT</td>
			<td style="width:620px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">RPMI medium</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dissection medium (DMEM + 10%FBS)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>10438018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:415px;">PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Collagenase</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">17018029</td>
			<td>Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">DNase I</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001&#160;ROCHE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Syringes and Needles</td>
			<td style="width:260px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fisherbran&#160;Sterile Cell Strainers, 40&#956;m</td>
			<td style="width:260px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PrEGM BulletKit&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Lonza</td>
			<td>CC-3166</td>
			<td>Add all componenets, aliquot and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Matrigel membrane matrix</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dispase II powder</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">17105041</td>
			<td>Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification, histological characterization, and dissection of mouse prostate lobes for in vitro 3d spheroid culture models

מודלים מהונדס גנטית עכבר (GEMMs) משמשים כמודלים ניסויים פרה-קליניים יעיל על חקירת רוב סוגי סרטן אנושי, כולל סרטן הערמונית (PCa). הבנת אנטומיה, היסטולוגיה של הערמונית עכבר חשוב עבור שימוש יעיל ו נאות אפיון כזה חייתיים. הערמונית עכבר יש ארבעה זוגות ברורים של אונות, כל אחד עם תכונות משלהם. מאמר זה מדגים את השיטה הנכונה של ניתוח וזיהוי של האונות הערמונית עכבר לניתוח במחלה. לנתיחה שלאחר, תאי הערמונית יכולים להיות עוד יותר בתרבית במבחנה על ההבנה מכניסטית. מאז העכבר הערמונית ראשי תאים נוטות לאבד המאפיינים שלהם נורמלי כאשר בתרבית במבחנה, אנו מכינים כאן שיטה לבודד את התאים, גדל אותם כמו תרבויות ספרואיד 3D, אשר נמצא יעיל לשם שמירה על פיזיולוגית המאפיינים של התאים. תרבויות אלה 3D יכול לשמש עבור ניתוח תא מורפולוגיה, רמות ההתנהגות בתנאים ליד-פיזיולוגיים, חוקרת משתנה, הגרסא המקומית של חלבונים מפתח, המעורבים בהתפתחות והתקדמות של מחלה, מסתכל תגובות טיפולים תרופות.

האונות הערמונית העכבר ניתן לזהות, גזור באמצעות את מיקומם ביחס vesicles הזרע של השופכה. הערמונית עכבר מורכב 4 זוגות של האונות הממוקם dorsally, ventrally שלפוחית הזרע, השופכה. איור 4a , 4b (למעלה) מראים את הגבי ותצוגת הגחון של הערמונית ללא פגע, יחד עם שלפוחית הזרע ו ?...

Watch this Scientific Journal Video about Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models at JoVE.com

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

זיהוי ואפיון היסטולוגית, דיסקציה של האונות הערמונית עכבר במודלים תרבות חוץ גופית ספרואיד תלת-ממד

עכברים מהונדסים גנטית הם מודלים שימושי עבור חוקר סרטן הערמונית מנגנונים. כאן אנו מציגים פרוטוקול לזהות, לנתח אונות הערמונית ממערכת השתן העכבר, להבדיל אותם בהתבסס על היסטולוגיה, לבודד ושל תרבות את תאי הערמונית הראשית in vitro לקשרי כמו spheroids עבור ניתוחים במורד הזרם.

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

שיטה זו יכולה לעזור בתחילת מודלים עכבר מהונדסים גנטית של סרטן הערמונית וחקירה של מנגנון סרטן הערמונית באמצעות in vivo וניתוח במבחנה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ניתוח מלא של מודל העכבר סרטן הערמונית, כל הדרך מניתוח רקמות לבידוד תאים ו culturing. לאחר חשיפת מערכת urogenital, או UGS, בחוזקה לתפוס את שלפוחית השתן עם מטלחים קהה בינוני, ולהרים את המערכת כולה מהבטן העכבר.החלק זוג מספריים מתחת לשלפוחית השתן והערמונית כל הדרך אל עמוד השדרה כדי לבצע חתך דרך חוט השדרה, וחתוך דרך כל הקשרים הנותרים לחלל הבטן כדי לאפשר הסרה של UGS כולו. מעבירים את ה-UGS לצלחת פטרי באורך שישה ס"מ המכילה שניים עד שישה מיליליטר של PBS תחת מיקרוסקופ ניתוח. ולהשתמש בזוג מטלפים עדין ומספריים microdissection כדי לנקות בזהירות את כל השומן משני הצדדים הגביים הגחוניים של מערכת הרקמה מבלי לחיתוך כל רקמת הערמונית.כאשר כל השומן הוסר, למשוך את שלפוחית השתן עם מלקחים בלו שלפוחית השתן בבסיסו. מניחים את הצד הגחון רקמה הנותרים למעלה ומחזיק צינור אחד מסתיים עם מלקחיים, בצע את הכלי לבסיס שלה עם מספריים ובלה את הכלי בבסיסו. הסר את אותו כלי בצד השני ולהכניס את המדפים בין ורידים מהותיים הערמונית כדי לאפשר חיתוך של כל רקמת חיבור סמוכה לפי הצורך.לאחר מכן עקבו אחר הנוצים החשובים לבסיסם בשופכה והוציאו את כלי הדם מבלי לנקב אותם. כאשר שני הווסתים הוסרו, מניחים את הצד הגבי של הרקמה למעלה כך האונות הגביות הדומות כנפי פרפר גלויים. מחזיק כל אונה הגבית עם מדפים, לחתוך את הרקמה בבסיס שלה עם מספריים כדי לאסוף את האונות הגביות ולהפוך את הרקמה לצד הגחוני.לאסוף את האונות הצדדיות, שהם קטנים ובדרך כלל לעטוף את השופכה בצד והם תקועים בין האונות הקדמיות, הגחון, הגב באותו אופן. לאסוף את האונות הגחון, אשר גדולים יותר האונות הרוחביות לשכב על השופכה גחון. ואז לחתוך ולהשליך את השופכה כדי לקצור את האונות הקדמיות.כדי לעבד את רקמת הערמונית לתרבות תלת-מימדית, מעבירים את האונות לתבשיל באורך 10 ס"מ המכיל שניים עד שלושה מיליליטר של DMEM, ולהשתמש באזמל כדי לטחון את צינוריות הערמונית בצורה דקה ושקולה ככל האפשר. מעבירים את שברי הרקמה למכסה המנוע של תרבות הרקמה הסטרילית ומוסיפים את ת פתרון הרקמה לצינור חדש של 15 מיליליטר. הביאו את הנפח בצינור עד תשעה מיליליטר עם מדיום טרי, ומוסיפים מיליליטר אחד של פתרון מלאי קולגנס TenX לתערובת הרקמה.לאחר המערבולת, דגירה הצינור עם רועד במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס כדי להשפיל את מטריצה חוץ תאית. בסוף הדגירה, לאסוף את הרקמה על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את גלולה בשני מיליליטר של חם 05% רצועות EDTA. לאחר חמש דקות של 37 מעלות צלזיוס כדי להקל על ההיצמדות מתא לתא ותא למטריצה, השתמש ראש צינור P1000 עם קצה לוח רחב כדי triturate הרקמה שמונה עד 10 פעמים כדי לשבור את כל הגושים.חזור על הדיסוציאציה עם קצה ראש צינור P200. ואז לנטרל את טריפסין עם שלושה מיליליטר של מדיום שלם. מערבבים 500 יחידות של DNASE1 לתוך תרחיף הרקמה ולהעביר את הפתרון חמש עד 10 פעמים דרך מזרק חמישה מיליליטר מצויד מחט 18 מד, ואחריו חמש פעמים דרך מחט 20 מד.כאשר לא נראים עוד חתיכות רקמה גדולות, מסננים את ההשעיה דרך מסנן של 40 מיקרומטר לצינור חרוטי של 50 מיליליטר, ואוסף את התאים באמצעות צנטריפוגה. עבור ציפוי תאים ותרבות, להשעות מחדש את גלולה ב 0.5 מיליליטר של מדיום צמיחת תא אפיתל הערמונית מלאה, ולהרומז על התאים חמש פעמים 10 לתאים החמישי למיליליטר של ריכוז בינוני צמיחת תא אפיתל הערמונית. מערבבים את התאים עם מטריצה חוץ תאית קרום מרתף בנפח של שניים עד שלושה נפח של יחס פתרון, צלחת המתלה התא במיכל תא הניסוי המתאים.ואז למקם את התאים באינקובטור תרבות התא במשך 30 דקות. כאשר המטריצה החוץ-תאית התגבשה, מכסים את התרבות עם מדיום גידול תאי אפיתל מלא מחומם מראש של הערמונית, דואגים לא להפריע לתקע המטריצה החוץ-תאית של קרום המרתף. ואז להחזיר את התאים לאנקובטור תרבות התא במשך חמישה עד 10 ימים, מרענן מחצית המדיום כל יומיים עד שלושה ימים.כדי לקצור כדורים, שאפו את המדיום בזהירות מבלי להפריע לתקע ג'ל מטריצה חוץ-תאית של קרום המרתף, והוסיפו מיליליטר אחד של פתרון Disbase עבור 100 מיקרוליטרים של מטריצה חוץ-תאית של קרום מרתף. באמצעות מגרד תא, לגרד לאורך החלק התחתון של הצלחת כדי להרים את ג'לים חוץ תאיים קרום המרתף מתחתית הצלחת לתוך supernatant, צינור את הפתרון כולו פעם אחת כדי לשבור את התקע לחתיכות קטנות יותר. חדירה את חתיכות מטריצה הסלולר הנוסף באינקובטור תרבות התא במשך שעה עד שעתיים עד מטריצה חוץ תאית קרום המרתף נמס לחלוטין.ואז להעביר את ההשעיה התא לצינור 15 מיליליטר. ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה למניפולציה במורד הזרם. ערמונית העכבר מורכבת מארבעה זוגות של אונות הממוקמות באופן דורסי ומאוורר לווסיקלים והשופכה החשובים.האונות הערמונית מורכבות פרופילי בלוטה מרובים, כל אחד מורכב לומן, מוקף בתאי אפיתל הפרשה. צורות האונות, ארגון התאים ואופי הפרשתן משתנים בין האונה לאונה. תאי הערמונית המבודדים מתחילים לגדול לאברנואידים כבר ארבעה ימים לאחר תרבות המטריצה החוץ-תאית של קרום המרתף.במהלך הימים עד ששת הימים הבאים, רוב התאים גדלים לכדורים מוצקים עם שבריר מהעולמות המציגים לומן חלקי או מלא. הספרואידים גם מדגימים כתם בטא קטנין חזק בצמתים התא לתא כי במשותף לוקליזציה עם כתמי F-actin. בעת ניסיון הליך זה, חשוב מאוד לעקוב בקפדנות אחר שלבי המיקרו-דיסקטוריה.לדוגמה, לבודד את האונות הערמונית בזמן שהם עדיין מחוברים השופכה, כך שאתה יודע איזו אונה היא אשר מבוסס על איפה הם ביחס השופכה. בעקבות הליך הניתוח, האונות המבודדות יכולות לשמש לניתוח במורד הזרם, כגון רצף RMA, כתמים מערביים או כשל חיסוני. טכניקת התרבות הראשונית 3D מאפשר לך לקבל תובנות נוספות לתוך מנגנון סרטן הערמונית, כי אתה יכול לפקח על החיים עם כדוריות עבור מורפולוגיה ושינויים בהתנהגות ולזהות כל שינויים neoplastic באותו.לסיכום, זה ניתוח הערמונית ושיטות תרבות יכול להיות משולב יישומים שונים במורד הזרם כדי לספק מידע רב ערך לחקר המנגנון של סרטן הערמונית באמצעות מודלים עכבר מהונדסים גנטית.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

מסנן ראפיד הכנס מבוססת מערכת 3D תרבות התמיינות תאי ערמונית ראשית

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

אידוי צמצום מצב התרבות מגביר את השחזור של גיבוש התאי אליפטית צלחות microtiter טובות

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

חתך בלוטות החלב שלמות מלא עבור זיהוי הנגע

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

טיפול בדיקות במודל תרבות המבוסס ספרואיד Cell תלת-ממד עבור קרצינומה של תאים קשקשיים בצוואר ואחראי

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

מודל העור מלנומה Organotypic 3D ספרואיד

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

הערכת הכדאיות תא ומוות ב 3D בתרבויות ספרואיד של תאים סרטניים

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

הקמת החולה סרטן קיבה-מודלים נגזרים הנגזרות וקווי התא הראשי

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

3D מודל ספרואיד כמו מערכת פיזיולוגית יותר עבור סרטן הקשורים בידול פיברותקיעות והפלישה ללימודי חוץ גופית

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

הערכת יכולת בידול של העכבר תאים אפיתל הערמונית באמצעות תרבות אורגאיד

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

אפיון ההשפעות של מעכבי Migrastatic על הפלישה 3D הגידול ספרואיד על ידי מיקרוסקופ Confocal וקד ברזולוציה גבוהה

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...