Name: identification, histological characterization, and dissection of mouse prostate lobes for in vitro 3d spheroid culture models
Uploaded: 2018-09-18T14:30:00
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Questo lavoro è stato supportato dalla concessione dal National Cancer Institute, R01CA161018 di LK.

Tutti gli esperimenti del mouse descritti qui sono stati eseguiti secondo le linee guida delineate nei protocolli approvati IACUC istituzionali presso SUNY Upstate Medical University.
1. la dissezione del sistema urogenitale (UGS)
Nota: Lo schema è presentato nella Figura 1.
<ol><li>Eutanasia di un 3-mese-vecchio maschio C57BL/6 del mouse utilizzando il metodo di eutanasia da inalazione di CO2 o un'altra tecnica approvata....

<ol>
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P., Adisetiyo, H., Liang, M., Roy-Burman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+enhance+the+gland-forming+capability+of+prostate+cancer+stem+cells.">Cancer-associated fibroblasts enhance the gland-forming capability of prostate cancer stem cells.</a> Cancer Research. 70 (18), 7294-7303 (2010).</li></ol>

Questa carta descrive i metodi per la dissezione della prostata del mouse e l'identificazione dei singoli lobi. È anche descritto il protocollo per coltura in una cultura 3D per l'analisi in vitro delle cellule della prostata del mouse.
Un passo fondamentale nel protocollo di dissezione è raccolta l'intera UGS fuori il mouse (1) e separando i singoli organi sotto un microscopio di dissezione. Il tessuto della prostata è molto piccola e circondata dal resto del UGS; così, è pratic...

La comunità scientifica ha cercato di chiarire il meccanismo complesso di sviluppo umano del cancro per decenni. Considerando che l'identificazione di potenziali giocatori chiavi e bersagli farmacologici inizia con le cellule pazienti e gli studi del tessuto, l'applicazione traslazionale di tali risultati spesso richiede l'uso di modelli animali preclinici. L'uso di topi geneticamente ingegnerizzati modelli (GEMM) ai cancri umani modello è sempre aumentata dall'istituzione del Mouse modelli di umano cancri Consorzio (NCI-MMHCC), un comitato che ha cercato di descrivere e unificare caratteristiche del cancro del mouse modelli per gli scienziati in tutto il mondo1,2. Modelli murini di soddisfano l'esigenza degli studi meccanicistici in studi pre-clinici della maggior parte dei tipi di cancro, per comprendere lo sviluppo, la progressione, la risposta ai trattamenti e acquisito resistenza3.
Carcinoma della prostata è il cancro più frequente negli uomini, che interessa oltre 160.000 uomini ogni anno4. Forme aggressive della malattia sostengono decine di migliaia di vite ogni anno. Tuttavia, il meccanismo della progressione di malattia è ancora capito male. Ciò provoca una grave mancanza di opzioni di trattamento efficace per carcinoma della prostata avanzato e metastatico, come testimonia l'elevata mortalità in pazienti di carcinoma della prostata avanzato4. Quindi, c'è un crescente bisogno di modelli pre-clinici per lo studio del carcinoma della prostata. Tuttavia, a causa delle differenze intrinseche tra il mouse e la prostata umana, modellazione di carcinoma della prostata in GEMM non ha guadagnato popolarità fino a quando il sistema di classificazione di Bar Harbor è stato introdotto nel 2004, che ha descritto i cambiamenti istopatologici nel topo prostata su manipolazioni genetiche, identificazione di alterazioni neoplastiche e la loro relazione alle fasi della progressione del cancro in esseri umani5. Una caratteristica importante della prostata del mouse che deve essere preso in considerazione durante lo studio di qualsiasi modello GEMM della prostata è la presenza di quattro coppie distinte di lobi: anteriore, laterale, ventrale e dorsale. I lobi presentano differenze significative in istopatologia e gene expression pattern6. Modello di espressione della proteina probasina può variare tra i lobi di giovani post-pubertà topi7, che deve essere considerato poiché modelli GEMM Cre-basato per lo più sono progettati utilizzando un promotore probasina-based chiamato Pb-Cre47. Le differenze risultanti spaziale e temporale di Cre espressione spesso portano a differenze nelle cronologie di iniziazione e progressione del tumore come pure le differenze nei cambiamenti neoplastici fra i lobi. Quindi, è importante tenere conto di tali differenze mentre si studia lo sviluppo del tumore nella prostata GEMM, e i lobi individuali possono devono essere valutati separatamente per ottenere risultati riproducibili. La prima parte di questo articolo descrive i metodi adeguati per sezionare una prostata del topo, identificare e separare ogni lobo e riconoscere le differenze istologiche fra i lobi.
Mentre l'analisi della crescita del tumore e l'istopatologia può fornire informazioni preziose nello sviluppo del tumore, non forniscono molte informazioni su meccanismi molecolari. Per studiare il meccanismo di sviluppo del tumore e la progressione, è spesso utile analizzare le cellule del tumore in vitro. Diversi metodi sono stati suggeriti nel corso degli anni che coinvolgono culture di queste cellule, incluse le colture in sospensione, culture 3D8 e recentemente, regolari 2D culture9. Considerando che la maggior parte di questi metodi si traducono in tassi di sopravvivenza e proliferazione delle cellule buone, le culture 3D forniscono un ambiente che è più vicino a condizioni fisiologiche. In 3D o sferoide colture cresciute in una matrice extracellulare (ECM) di membrana basale, le cellule completamente differenziate luminale hanno solitamente molto basso tasso di sopravvivenza; Tuttavia, le cellule basali e intermedi (principalmente cellule staminali) sono in grado di propagare e produrre aggregati di cellule chiamati sferoidi10. Questo lo rende adatto per uno studio del cancro poiché i cancri epiteliali sono creduti per provenire dalle cellule staminali (popolarmente note come le cellule staminali tumorali)11. La seconda parte del presente protocollo descrive un metodo per la coltura di cellule della prostata del mouse nelle culture 3D. Le sfere risultante possono essere utilizzate per diversi tipi di analisi a valle, tra cui lo studio della morfologia organoid e comportamento da live cell imaging, immunofluorescenza che macchia per diverse proteine e lo studio delle risposte ai chemioterapici trattamenti.
Nel complesso, l'obiettivo del presente protocollo è quello di delineare i metodi ottimali per l'utilizzo di modelli murini nel carcinoma della prostata descrivendo le tecniche di anatomia e dissezione della prostata del mouse e l'elaborazione del tessuto per analisi in vitro e sferoide culture .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1491px;" width="1491">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit)</td>
			<td style="width:260px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:196px;">MOUSEKIT</td>
			<td style="width:620px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">RPMI medium</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dissection medium (DMEM + 10%FBS)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>10438018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:415px;">PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Collagenase</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">17018029</td>
			<td>Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">DNase I</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001&#160;ROCHE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Syringes and Needles</td>
			<td style="width:260px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fisherbran&#160;Sterile Cell Strainers, 40&#956;m</td>
			<td style="width:260px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PrEGM BulletKit&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Lonza</td>
			<td>CC-3166</td>
			<td>Add all componenets, aliquot and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Matrigel membrane matrix</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dispase II powder</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">17105041</td>
			<td>Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification, histological characterization, and dissection of mouse prostate lobes for in vitro 3d spheroid culture models

Modelli murini geneticamente (GEMM) fungono da efficace modelli pre-clinici per indagare la maggior parte dei tipi di cancri umani, compreso il carcinoma della prostata (PCa). Comprendere l'anatomia e istologia della prostata del mouse è importante per l'uso efficiente e corretta caratterizzazione di tali modelli animali. La prostata del topo ha distinto quattro paia di lobi, ciascuno con le proprie caratteristiche. Questo articolo viene illustrato il metodo corretto di dissezione e identificazione dei lobi della prostata del mouse per l'analisi di malattia. Post-dissezione, le cellule della prostata possono essere ulteriormente coltivate in vitro per la comprensione meccanicistica. Dal mouse cellule primarie della prostata tendono a perdere le loro caratteristiche normali quando coltivate in vitro, descriviamo qui un metodo per isolare le cellule e loro coltivazione come culture sferoide 3D, che è efficace per preservare la fisiologica caratteristiche delle cellule. Queste culture 3D possono essere utilizzate per analizzare la morfologia delle cellule e comportamento in condizioni di quasi-fisiologiche, indagando alterato livelli e localizzazioni di proteine chiave e pathways coinvolti nello sviluppo e progressione di una malattia e guardando risposte ai trattamenti farmacologici.

I lobi della prostata del mouse possono essere identificati e sezionato utilizzando le loro posizioni per quanto riguarda le vescicole seminali e l'uretra. La prostata del topo è composto da 4 paia di lobi situati dorsalmente e ventralmente alle vescicole seminali e uretra. Figura 4a e 4b (in alto) mostrano la vista dorsale e ventrale della prostata intatta, insieme con le vescicole seminali e l'uretra. I pannelli di fondo (<strong class="xf...

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Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Identificazione, caratterizzazione istologica e dissezione dei lobi della prostata Mouse per In Vitro sferoide 3D modelli di coltura

Topi geneticamente modificati sono modelli utili per studiare i meccanismi di carcinoma della prostata. Qui presentiamo un protocollo per identificare e sezionare i lobi della prostata da un sistema urogenitale del mouse, differenziarli basato sull'istologia e isolare e coltura primaria di cellule della prostata in vitro come sferoidi per analisi successive.

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Questo metodo può aiutare all'inizio di modelli di topi geneticamente modificati del cancro alla prostata e allo studio del meccanismo del cancro alla prostata attraverso analisi in vivo e in vitro. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente un'analisi completa del modello di topo tumorale della prostata, dalla dissezione dei tessuti all'isolamento e alla coltura cellulare. Dopo aver esposto il sistema urogenitale, o UGS, afferrare saldamente la vescica urinaria con forcelle smussate medie e sollevare l'intero sistema dall'addome del topo.Far scorrere un paio di forbici sotto la vescica e la prostata fino alla colonna vertebrale per fare un'incisione attraverso il midollo spinale e tagliare tutte le connessioni rimanenti alla cavità addominale per consentire la rimozione dell'intero UGS. Trasferire l'UGS in una piastra di Petri di sei centimetri contenente da due a sei millilitri di PBS al microscopio sezionato. E usa un paio di forcelle sottili e forbici a microdisezione per cancellare attentamente tutto il grasso dai lati dorsale e ventrale del sistema tissutale senza tagliare alcun tessuto prostatico.Quando tutto il grasso è stato rimosso, tirare la vescica con le farse e asportare la vescica alla sua base. Posizionare il lato ventrale del tessuto rimanente verso l'alto e tenere un condotto termina con le forcep, seguire il vaso fino alla sua base con forbici e asportare il vaso alla sua base. Rimuovere lo stesso vaso dall'altra parte e inserire le forcep tra le vescicole seminali e la prostata per consentire lo snipping di qualsiasi tessuto connettivo adiacente, se necessario.Quindi traccia le vescicole seminali fino alla loro base all'uretra e rimuovi i vasi senza forarli. Quando entrambe le vescicole sono state rimosse, posizionare il lato dorsale del tessuto verso l'alto in modo che siano visibili i lobi dorsali che assomigliano alle ali di una farfalla. Tenendo ogni lobo dorsale con le forcelle, tagliare il tessuto alla sua base con le forbici per raccogliere i lobi dorsali e girare il tessuto verso il lato ventrale.Raccogli i lobi laterali, che sono piccoli e di solito avvolgono l'uretra sul lato e sono incuneati tra i lobi anteriore, ventrale e dorsale allo stesso modo. Raccogli i lobi ventrali, che sono più grandi dei lobi laterale e giacciono sull'uretra ventralmente. Quindi tagliare e scartare l'uretra per raccogliere i lobi anteriori.Per elaborare il tessuto prostatico per la coltura 3D, trasferire i lobi in un piatto di 10 centimetri contenente da due a tre millilitri di DMEM e utilizzare un bisturi per tritare i tubuli prostatico nel modo più fine e uniforme possibile. Trasferire i frammenti di tessuto in una cappa sterile per la coltura tissutale e aggiungere la soluzione tissutale a un nuovo tubo da 15 millilitri. Portare il volume nel tubo fino a nove millilitri con mezzo fresco e aggiungere un millilitro di soluzione di stock di collagenasi TenX alla miscela tissutale.Dopo il vortice, incubare il tubo con tremori per due ore a 37 gradi Celsius per degradare la matrice extracellulare. Al termine dell'incubazione, raccogliere il tessuto mediante centrifugazione e sospendere di nuovo il pellet in due millilitri di strisce calde allo 05% in EDTA. Dopo cinque minuti di 37 gradi Celsius per facilitare la fenditura delle aderenze da cellula a cellula e da cellula a matrice, utilizzare una testa di tubo P1000 con una punta larga per triturare il tessuto da otto a 10 volte per rompere eventuali grumi.Ripetete la dissociazione con una punta della testa di tubo P200. Quindi neutralizzare la triptina con tre millilitri di mezzo completo. Mescolare 500 unità di DNASE1 nel liquame tissutale e passare la soluzione da cinque a 10 volte attraverso una siringa da cinque millilitri dotata di un ago calibro 18, seguita da cinque volte attraverso un ago calibro 20.Quando non sono visibili più pezzi di tessuto di grandi dimensioni, filtrare la sospensione attraverso un filtro da 40 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Per la placcatura cellulare e la coltura, sospendere il pellet in 0,5 millilitri di mezzo completo di crescita delle cellule epiteliali della prostata e alludono le cellule a una concentrazione media di crescita delle cellule epiteliali cinque volte 10 al quinto per millilitro della concentrazione media di crescita delle cellule epiteliali della prostata. Mescolare le cellule con la matrice extracellulare della membrana basale con un rapporto tra due e tre volumi di soluzione e placcare la sospensione cellulare nell'appropriato contenitore sperimentale di coltura cellulare.Quindi posizionare le cellule in un incubatore di coltura cellulare per 30 minuti. Quando la matrice extracellulare si è solidificata, coprire la coltura con un mezzo di crescita epiteliale prostatico completo pre-riscaldato, facendo attenzione a non disturbare la spina della matrice extracellulare della membrana basale. Quindi riportare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per cinque o 10 giorni, rinfrescando metà del mezzo ogni due o tre giorni.Per raccogliere le sfere, aspirare il mezzo con attenzione senza disturbare la spina in gel a matrice extracellulare della membrana basale e aggiungere un millilitro di soluzione Disbase per 100 microlitri di matrice extracellulare a membrana basale. Utilizzando un raschietto cellulare, raschiare lungo il fondo della piastra per sollevare i gel extracellulari della membrana basale dal fondo della piastra nel supernatante e pipere l'intera soluzione una volta per rompere la spina in pezzi più piccoli. Incubare i pezzi della matrice cellulare extra nell'incubatore di coltura cellulare per una o due ore fino a quando la matrice extracellulare della membrana basale non si è completamente sciolta.Quindi trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri. E raccogliere le cellule per centrifugazione per un'ulteriore manipolazione a valle. La prostata del topo è composta da quattro paia di lobi situati dorsalmente e ventralmente alle vescicole seminali e all'uretra.I lobi della prostata sono composti da più profili ghiandolare, ognuno composto da un lume, circondato da cellule epiteliali secretorie. Le forme dei lobi, l'organizzazione delle cellule e la natura della secrezione variano da lobo a lobo. Le cellule prostatiche isolate iniziano a crescere in organoidi già quattro giorni dopo la coltura della matrice extracellulare della membrana basale.Nei successivi uno o sei giorni, la maggior parte delle cellule cresce in sfere solide con una frazione delle sfere che mostrano un lume parziale o pieno. Gli sferoidi dimostrano anche una forte colorazione beta catenina alle giunzioni da cellula a cellula che co-localizzano con la colorazione F-actin. Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante seguire meticolosamente i passaggi di microdisezione.Ad esempio, isolare i lobi della prostata mentre sono ancora attaccati all'uretra, in modo da sapere quale lobo è che si basa su dove si trovano rispetto all'uretra. Seguendo la procedura di dissezione, i lobi isolati possono essere utilizzati per l'analisi a valle, come il sequenziamento RMA, il gonfiore occidentale o l'immunosocienza. La tecnica primaria della coltura 3D consente di ottenere ulteriori informazioni sul meccanismo del cancro alla prostata, perché è possibile monitorare la vita con gli sferoidi per i cambiamenti morfologici e comportamentali e identificare eventuali cambiamenti neoplastici nello stesso.In sintesi, questo metodo di dissezione e coltura della prostata può essere incorporato in varie applicazioni a valle per fornire preziose informazioni per indagare il meccanismo del cancro alla prostata utilizzando modelli di topo geneticamente modificati.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Un sistema di coltura 3D Rapid Cartuccia filtro-based per la prostata primaria cellulare Differenziazione

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

Evaporazione di riduzione Cultura Condizione Aumenta la riproducibilità dei multicellulare Spheroid Formazione in micropiastre

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Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Valutare la vitalità cellulare e la morte nelle colture di sferoidi 3D delle cellule tumorali

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Stabilimento di modelli Xenograft derivati dal paziente derivato dal paziente e linee cellulari primarie

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Un modello esplosivo 3D come sistema più fisiologico per la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro e gli studi sull'invasione in vitro

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Valutazione della capacità di differenziazione delle cellule epiteliali della prostata del topo utilizzando la cultura organoide

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Caratterizzazione degli effetti degli inibitori espastatici sull'invasione 3D dello spheroid del tumore mediante microscopia confocale ad alta risoluzione

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...