Name: identification, histological characterization, and dissection of mouse prostate lobes for in vitro 3d spheroid culture models
Uploaded: 2018-09-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av stipend fra National Cancer Institute, R01CA161018 til LK.

Alle mus eksperimenter beskrevet her ble utført i henhold til retningslinjene i institusjonelle IACUC-godkjent protokollene på SUNY storbyen medisinske universitet.
1. Urogenital System (UGS) disseksjon
Merk: Skjematiske vises i figur 1.
<ol><li>Euthanize en 3-måneden-gamle mannlige C57BL/6 mus ved hjelp av metoden CO2 inhalasjon-anestesimiddel euthanasia eller en annen godkjent teknikk. Merk: Mus mellom 3 og 12 måne...

<ol>
	<li>Marks, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Human+Cancers+Consortium+(MMHCC)+from+the+NCI.">Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI.</a> Cancer Research. 65 (9 Supplement), 242-243 (2005).</li><li>Marks, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Human+Cancers+Consortium+(MMHCC)+from+the+NCI.">Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 2 (3-4), 111 (2009).</li><li>Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+mouse+cancer+models:+a+maze+of+opportunities+and+challenges.">Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges.</a> Cell. 163 (1), 39-53 (2015).</li><li>Society, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cancer Facts and Figures. , (2018).</li><li>Shappell, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+Pathology+of+Genetically+Engineered+Mice:+Definitions+and+Classification.+The+Consensus+Report+from+the+Bar+Harbor+Meeting+of+the+Mouse+Models+of+Human+Cancer+Consortium+Prostate+Pathology+Committee.">Prostate Pathology of Genetically Engineered Mice: Definitions and Classification. The Consensus Report from the Bar Harbor Meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee.</a> Cancer Research. 64 (6), 2270-2305 (2004).</li><li>Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+signature+of+the+mouse+prostate.">Expression signature of the mouse prostate.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (43), 36442-36451 (2005).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+epithelial+cell-specific+Cre+transgenic+mouse+model+for+tissue-specific+gene+ablation.">Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation.</a> Mechanisms of Development. 101 (1-2), 61-69 (2001).</li><li>Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+multilineage+differentiation+in+vitro+from+murine+prostate+stem+cells.">Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells.</a> Stem Cells. 25 (11), 2760-2769 (2007).</li><li>Hofner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+conditions+for+the+isolation+and+expansion+of+basal+prostate+progenitor+cells+of+mouse+and+human+origin.">Defined conditions for the isolation and expansion of basal prostate progenitor cells of mouse and human origin.</a> Stem Cell Reports. 4 (3), 503-518 (2015).</li><li>Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+cultivation+and+characterization+of+adult+murine+prostate+stem+cells.">Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (4), 702-713 (2010).</li><li>Clarke, M. F., Fuller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+cancer:+two+faces+of+eve.">Stem cells and cancer: two faces of eve.</a> Cell. 124 (6), 1111-1115 (2006).</li><li>Oliveira, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+prostate:+a+basic+anatomical+and+histological+guideline.">The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline.</a> Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).</li><li>Colicino, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravin+regulates+centrosome+function+through+PLK1.">Gravin regulates centrosome function through PLK1.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (5), 532-541 (2018).</li><li>Ittmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+prostate+cancer:+the+consensus+report+of+the+New+York+meeting+of+the+Mouse+Models+of+Human+Cancers+Consortium+Prostate+Pathology+Committee.">Animal models of human prostate cancer: the consensus report of the New York meeting of the Mouse Models of Human Cancers Consortium Prostate Pathology Committee.</a> Cancer Research. 73 (9), 2718-2736 (2013).</li><li>Valkenburg, K. C., Williams, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+prostate+cancer.">Mouse models of prostate cancer.</a> Prostate Cancer. 2011, 895238 (2011).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Abi1/Hssh3bp1+expression+induces+prostatic+intraepithelial+neoplasia+in+the+conditional+Abi1/Hssh3bp1+KO+mice.">Disruption of Abi1/Hssh3bp1 expression induces prostatic intraepithelial neoplasia in the conditional Abi1/Hssh3bp1 KO mice.</a> Oncogenesis. 1, e26 (2012).</li><li>Liao, C. P., Adisetiyo, H., Liang, M., Roy-Burman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+enhance+the+gland-forming+capability+of+prostate+cancer+stem+cells.">Cancer-associated fibroblasts enhance the gland-forming capability of prostate cancer stem cells.</a> Cancer Research. 70 (18), 7294-7303 (2010).</li></ol>

Dette dokumentet beskriver metodene for Disseksjon av musen prostata og identifikasjon av personlige lobes. Også beskrevet er protokollen for dyrking musen prostata celler i en 3D kultur for i vitro analyse.
En avgjørende skritt i disseksjon protokollen er (1) høsting av hele UGS av musen og skille organene under disseksjon mikroskop. Prostate vev er svært liten og omgitt av resten av UGS; Dermed er det praktisk talt umulig å høste orgelet direkte fra kroppens hulrom mens skaffe...

Det vitenskapelige samfunnet har forsøkt å belyse kompleks mekanisme menneskelige hudkreft i flere tiår. Mens identifisering av potensielle nøkkelspillere og narkotika mål begynner med pasienten celler og vev studier, krever translasjonsforskning anvendelsen av slike funn ofte bruk av pre-klinisk dyremodeller. Bruk av genmodifiserte mus modeller (GEMMs) til modell kreft hos mennesker har stadig økt siden musen modeller av menneskelig kreft Consortium (NCI-MMHCC), en komité som forsøkte å beskrive og forene kjennetegner musen kreft modeller for forskere verden over1,2. Musen modeller oppfylle behovet for mekanistisk studier i pre kliniske studier av de fleste typer kreft, for å forstå utviklingen, progresjon, svar på behandlinger, og kjøpte motstand3.
Prostatakreft er hyppigst forekommende kreft i menn, påvirker over 160 000 menn hvert år4. Aggressive former av sykdommen hevder titusenvis av liv hvert år. Men er mekanismen av sykdomsprogresjon fremdeles dårlig forstått. Dette resulterer i en alvorlig mangel på effektive behandlingstilbud for avanserte og metastatisk prostatakreft, noe som gjenspeiles av den høye dødeligheten i avansert prostata kreft pasienter4. Derfor er det et økende behov for pre-klinisk modeller å studere prostatakreft. Men på grunn av den iboende forskjellen mellom musen og menneskelig prostata få modellering av prostata kreft i GEMMs ikke popularitet til Bar Harbor klassifikasjonssystem ble introdusert i 2004, som skissert histopathological endringer i musen prostata på genetisk manipulasjon, identifikasjon av neoplastic endringer og deres forhold til stadier av kreft i mennesker5. En viktig karakteristikk av musen prostata som må tas i betraktning når studere noen prostata GEMM modell er tilstedeværelsen av fire forskjellige parene av fliker: fremre, lateral, ventral og dorsal. Lobes presenterer betydelige forskjeller i histopatologi og gene expression mønster6. Probasin protein uttrykksmønster kan variere mellom flikene i unge etter puberteten mus7, som må vurderes grobunn-baserte GEMM modeller er hovedsakelig laget ved hjelp av en probasin-baserte promotor kalles Pb-Cre47. Resulterende romlige og tidsmessige forskjellene i grobunn uttrykk ofte føre til forskjeller i svulst initiering og progresjon tidslinjer som forskjeller i neoplastic endringer mellom lobes. Derfor er det viktig å ta hensyn til slike forskjeller mens han studerte tumor utvikling i prostata GEMMs, og personlige lobes må vurderes separat for å oppnå reproduserbar resultater. Den første delen av denne artikkelen beskriver metodene riktig å dissekere musen prostatakreft, identifisere og skille hver lobe og gjenkjenne histologiske forskjellene mellom lobes.
Mens analyse av tumor vekst og histopatologi kan gi verdifull innsikt i tumor utvikling, gir de ikke mye informasjon om molekylære mekanismer. For å studere mekanismen av tumor utvikling og progresjon, er det ofte nyttig å analysere tumor celler i vitro. Flere metoder er foreslått årene som involverer kulturer av disse cellene, inkludert suspensjon kulturer, 3D kulturer8 og nylig vanlige 2D kulturer9. Mens de fleste av disse metodene resultere i god celle overlevelse og spredning priser, gir 3D kulturer et miljø som ligner fysiologiske forhold. I 3D eller spheroid kulturer dyrket i en kjeller membran ekstracellulær matrix (EFM), har fullt differensiert luminal cellene vanligvis svært lav overlevelse; men er basale og mellomliggende cellene (hovedsakelig stamceller) kjøpedyktig Overfør og produsere celle klynger kalt spheroids10. Dette gjør det egnet for en kreft studie siden epithelial kreft antas å stamme fra stamceller (populært kjent som kreft stamceller)11. Den andre delen av denne protokollen beskriver en metode for dyrking musen prostata celler i 3D kulturer. Den resulterende kuler kan brukes for flere typer nedstrøms analyser, inkludert studiet av organoid morfologi og oppførsel av levende celle imaging, immunofluorescence flekker for ulike proteiner, og studiet av Svar å chemotherapeutic behandlinger.
Samlet er mål denne protokollen å skissere optimal metoder for å bruke musen modeller i prostata kreft ved å beskrive anatomi og disseksjon teknikker av musen prostata og behandling av vevet for spheroid kulturer og i vitro analyse .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1491px;" width="1491">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit)</td>
			<td style="width:260px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:196px;">MOUSEKIT</td>
			<td style="width:620px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">RPMI medium</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dissection medium (DMEM + 10%FBS)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>10438018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:415px;">PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Collagenase</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">17018029</td>
			<td>Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">DNase I</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001&#160;ROCHE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Syringes and Needles</td>
			<td style="width:260px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fisherbran&#160;Sterile Cell Strainers, 40&#956;m</td>
			<td style="width:260px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PrEGM BulletKit&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Lonza</td>
			<td>CC-3166</td>
			<td>Add all componenets, aliquot and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Matrigel membrane matrix</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dispase II powder</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">17105041</td>
			<td>Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification, histological characterization, and dissection of mouse prostate lobes for in vitro 3d spheroid culture models

Genmodifiserte musen modeller (GEMMs) være effektiv pre-klinisk modeller for å undersøke de fleste typer kreft hos mennesker, inkludert prostatakreft (PCa). Forstå anatomi og histology av musen prostata er viktige for effektiv og riktig karakteristikk av slike dyr modeller. Musen prostata har fire forskjellige parene av fliker, hver med sine egne egenskaper. Denne artikkelen viser den passende metoden for disseksjon og identifisering av musen prostata lobes for sykdom analyse. Etter disseksjon, prostata celler kan være mer kultivert i vitro for mekanistisk forståelse. Siden musen prostata primære celler tendens til å miste deres vanlige egenskaper når kulturperler i vitro, vi skissere her en metode for å isolere cellene og voksende dem som 3D-formet kulturer, som er effektive for å bevare det fysiologiske egenskapene til cellene. Disse 3D kulturer kan brukes til å analysere celle morfologi og atferd i nær-fysiologiske forhold, undersøker endret nivåer og lokaliseringer viktige proteiner og veier involvert i utviklingen og progresjon av en sykdom, og ser på Svar å medikamentelle behandlinger.

Musen prostata lobes kan identifiseres og dissekert ved hjelp av deres steder med hensyn til sædblærene og urinrøret. Musen prostata består av 4 parene av fliker ligger på ryggen og ventrally sædblærene og urinrøret. Figur 4a og 4b (øverst) viser visningene dorsal og ventrale til intakt prostata, sædblærene og urinrøret. Den nedre paneler (Figur 4 c og 4 d) vise ulike lobes skissert f...

Watch this Scientific Journal Video about Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models at JoVE.com

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Identifikasjon og histologiske karakteristikken Disseksjon av musen prostata Lobes for i Vitro 3D Spheroid kultur modeller

Genmodifiserte mus er nyttige modeller for å undersøke prostatakreft mekanismer. Her presenterer vi en protokoll for å identifisere og dissekere prostata lobes fra en mus urogenital system, skille dem basert på histology, og isolere og kultur primære prostata celler i vitro som spheroids for nedstrøms analyser.

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Denne metoden kan hjelpe i starten av genmodifiserte musemodeller av prostatakreft og undersøkelse av prostatakreftmekanisme gjennom in vivo og in vitro analyse. Den største fordelen med denne teknikken er at den gir mulighet for en fullstendig analyse av prostatakreftmusmodellen, hele veien fra vevsdeksjon til celleisolering og kultering. Etter å ha avslørt det urogenielle systemet, eller UGS, griper du godt urinblæren med middels stumpe tang, og løfter hele systemet opp fra muselivet.Skyv en saks under blæren og prostata helt til ryggraden for å gjøre et snitt gjennom ryggmargen, og kutt gjennom eventuelle gjenværende forbindelser til bukhulen for å tillate fjerning av hele UGS. Overfør UGS til en seks centimeter lang petriskål som inneholder to til seks milliliter PBS under et dissekerende mikroskop. Og bruk et par fine tang og mikrodisseksjonsaks for å forsiktig fjerne alt fettet fra både dorsale og ventrale sider av vevssystemet uten å klippe prostatavev.Når alt fettet er fjernet, trekk blæren med tangen og avgiftsdirektoratet blæren ved basen. Plasser de resterende vev ventral side opp og holde en kanal ender med tang, følg fartøyet til basen med saks og avgiftsdirektoratet fartøyet på basen. Fjern det samme fartøyet på den andre siden og sett inn tangen mellom sædvognene og prostata for å tillate utklipp av et tilstøtende bindevev etter behov.Spor deretter sædvognene til basen ved urinrøret og fjern karene uten å punktere dem. Når begge vesikler er fjernet, plasser vevsvelrsalsiden opp slik at dorsale fliker som ligner en sommerfuglvinger er synlige. Hold hver dorsal lobe med tang, kutt vevet ved basen med saks for å samle dorsalappene og snu vevet til ventral side.Samle lateral lobes, som er små og vanligvis vikle urinrøret på siden og er kilt mellom fremre, ventral, og dorsal fliker på samme måte. Samle ventral lobes, som er større enn lateral lobes og ligger på urinrøret ventrally. Klipp deretter og kast urinrøret for å høste fremre fliker.For å behandle prostatavevet for 3D-kultur, overfør flene til en 10-centimeters tallerken som inneholder to til tre milliliter DMEM, og bruk en skalpell til å hakke prostatatubuli så fint og jevnt som mulig. Overfør vevsfragmentene til en steril vevskulturhette og tilsett vevsløsningen til et nytt 15-milliliter rør. Ta volumet i røret opp til ni milliliter med friskt medium, og tilsett en milliliter TenX collagenase lagerløsning til vevsblandingen.Etter vortexing, inkubere røret med risting i to timer ved 37 grader Celsius for å forringe den ekstracellulære matrisen. På slutten av inkubasjonen, samle vevet ved sentrifugering og re-suspendere pellet i to milliliter varme 05% strimler i EDTA. Etter fem minutter med 37 grader Celsius for å lette spalten av celle-til-celle- og celle-til-matriseadhesjoner, bruk et P1000-rørhode med en bred bordspiss for å triturere vevet åtte til 10 ganger for å bryte opp klumper.Gjenta dissosiasjonen med en P200 pipehead-spiss. Nøytraliser deretter trypsinen med tre milliliter med komplett medium. Bland 500 enheter DNASE1 i vevsslamen og send oppløsningen fem til 10 ganger gjennom en fem milliliter sprøyte utstyrt med en 18-gauge nål, etterfulgt av fem ganger gjennom en 20-gauge nål.Når ikke flere store vevsbiter er synlige, filtrerer du suspensjonen gjennom et 40-mikrometerfilter i et konisk rør på 50 milliliter, og samler cellene ved sentrifugering. For celleplating og kultur, re-suspendere pellet i 0,5 milliliter av komplett prostata epitelcellevekst medium, og hense cellene til en fem ganger 10 til femte celler per milliliter prostata epitelcellevekst middels konsentrasjon. Bland cellene med kjellermembran ekstracellulær matrise med et to til tre volum av løsningsforhold, og plate cellesuspensjonen i riktig eksperimentell cellekulturbeholder.Plasser deretter cellene i en cellekultur inkubator i 30 minutter. Når den ekstracellulære matrisen har størknet, dekk kulturen med forhåndsvarmet komplett prostata epitelcellevekstmedium, og vær forsiktig så du ikke forstyrrer kjellermembranen ekstracellulær matriseplugg. Deretter returnerer cellene til cellekulturinkubatoren i fem til 10 dager, forfriskende halvparten av mediet hver to til tre dager.For å høste kuler, aspirer mediet forsiktig uten å forstyrre kjellermembranen ekstracellulær matrisegelplugg, og legg til en milliliter Disbase-løsning for 100 mikroliter kjellermembran ekstracellulær matrise. Bruk en celleskraper til å skrape langs bunnen av platen for å løfte kjellermembranen ekstracellulære geler fra bunnen av platen inn i det overnaturlige, og rør opp hele løsningen en gang for å bryte opp pluggen i mindre biter. Inkuber de ekstra cellulære matrisebitene i cellekulturinkubatoren i en til to timer til kjellermembranen ekstracellulær matrise er helt oppløst.Overfør deretter cellefjæringen til et 15-milliliter rør. Og samle cellene ved sentrifugering for videre nedstrøms manipulasjon. Musen prostata består av fire par fliker som ligger dorsalt og ventrikt til sædlysiklene og urinrøret.Prostataappene består av flere kjertelprofiler, hver består av en lumen, omgitt av sekretoriske epitelceller. Figurene av lobene, organiseringen av cellene og arten av sekresjonen varierer fra lobe til flik. De isolerte prostatacellene begynner å vokse til organoider så tidlig som fire dager etter kjellermembran ekstracellulær matrisekultur.I løpet av de neste en til seks dagene vokser de fleste cellene til faste kuler med en brøkdel av kulene som viser en delvis eller full lumen. Spheroidene viser også en sterk beta catenin farging på celle-til-celle veikryss som co-lokalisere med F-actin farging. Mens du prøver denne prosedyren, er det svært viktig å følge omhyggelig mikrodisseksjonstrinnene.For eksempel isolere prostata fliker mens de fortsatt er festet til urinrøret, slik at du vet hvilken flik som er som er basert på hvor de er med hensyn til urinrøret. Etter disseksjonsprosedyren kan de isolerte flikene brukes til nedstrømsanalyse, for eksempel RMA-sekvensering, vestlig blotting eller immunstaining. Den primære 3D-kulturteknikken lar deg få ytterligere innsikt i prostatakreftmekanismen, fordi du kan overvåke livet med sfæroider for morfologi og atferdsendringer og identifisere eventuelle neoplastiske endringer i samme.Oppsummert kan denne prostata disseksjon og kultur metoder innlemme ulike nedstrøms applikasjoner for å gi verdifull informasjon for å undersøke mekanismen for prostatakreft ved hjelp av genmodifiserte musemodeller.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

En Rapid filter Sett baserte 3D Kultur System for Primær prostatakreft celledifferensiering

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

Fordampning reduserende Kultur Forhold Øker reproduserbarhet av Flercellede spheroid Dannelse i mikrotiterplater

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Seksjon Mammary Gland Whole Mount for Lesion Identification

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Terapi Testing i en Spheroid-basert 3D celle kultur modell for hodet og nakken Squamous celle Carcinoma

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

3D Organotypic melanom Spheroid huden modell

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Vurdering Cell levedyktighet og død i 3D spheroid kulturer av kreftceller

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablering av magekreft pasient-avledet Xenograft modeller og primær celle Lines

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

En 3D spheroid modell som en mer fysiologisk system for kreft-Associated fibroblaster differensiering og Invasion in vitro studier

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Vurderer differensiering kapasitet på Mouse prostata epitelceller bruke Organoid kultur

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Karakterisering av effekter av Migrastatic hemmere på 3D tumor spheroid Invasion av høy oppløsning Konfokalmikroskopi mikroskopi

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...