Name: identification, histological characterization, and dissection of mouse prostate lobes for in vitro 3d spheroid culture models
Uploaded: 2018-09-18T14:30:00
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Este trabalho foi financiado pela concessão do National Cancer Institute, R01CA161018 de LK.

Todos os experimentos de rato aqui descritos foram realizados de acordo com as orientações descritas nos protocolos institucionais IACUC-aprovado na SUNY Upstate Medical University.
1. a dissecação do sistema Urogenital (UGS)
Nota: O diagrama esquemático é apresentado na Figura 1.
<ol><li>Eutanásia em 3 meses masculino C57BL/6 mouse usando o método de eutanásia por inalação de CO2 ou outra técnica aprovada. N...

<ol>
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O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+prostate+cancer.">Mouse models of prostate cancer.</a> Prostate Cancer. 2011, 895238 (2011).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Abi1/Hssh3bp1+expression+induces+prostatic+intraepithelial+neoplasia+in+the+conditional+Abi1/Hssh3bp1+KO+mice.">Disruption of Abi1/Hssh3bp1 expression induces prostatic intraepithelial neoplasia in the conditional Abi1/Hssh3bp1 KO mice.</a> Oncogenesis. 1, e26 (2012).</li><li>Liao, C. P., Adisetiyo, H., Liang, M., Roy-Burman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+enhance+the+gland-forming+capability+of+prostate+cancer+stem+cells.">Cancer-associated fibroblasts enhance the gland-forming capability of prostate cancer stem cells.</a> Cancer Research. 70 (18), 7294-7303 (2010).</li></ol>

Este artigo descreve os métodos para a dissecção da próstata do rato e identificação dos lobos individuais. Também descrito é o protocolo para cultivo de células da próstata de rato em uma cultura 3D para análise em vitro .
Um passo crítico no protocolo de dissecação é colheita o UGS todo fora o mouse (1) e separando os órgãos individuais sob um microscópio de dissecação. O tecido da próstata é muito pequeno e cercado pelo resto do UGS; assim, é praticamente imp...

A comunidade científica tem sido a tentativa de elucidar o mecanismo complexo de desenvolvimento de câncer humano há décadas. Considerando que a identificação de potenciais jogadores-chave e alvos de drogas começa com estudos de tecidos e células do pacientes, a aplicação translacional de tais achados, muitas vezes requer o uso de modelos animais pré-clínicos. O uso de camundongos geneticamente modificados modelos (GEMMs) para cânceres humanos modelo aumentou firmemente desde o estabelecimento do Mouse modelos de humano cancros consórcio (NIC-MMHCC), um comitê que procurava descrever e unificar as características de câncer rato modelos para os cientistas em todo o mundo1,2. Modelos de mouse cumprir a necessidade de estudos mecanicistas em estudos pré-clínicos da maioria dos tipos de câncer, para compreender o desenvolvimento, a progressão, a resposta aos tratamentos e adquiriram resistência3.
Câncer de próstata é o câncer mais comumente ocorrem em homens, afetando mais de 160.000 homens cada ano4. Formas agressivas da doença reivindicam dezenas de milhares de vidas por ano. No entanto, o mecanismo de progressão da doença ainda seja mal compreendido. Isso resulta em uma séria falta de opções de tratamento eficaz para o cancro da próstata avançado e metastático, como evidenciado pela alta taxa de mortalidade em pacientes de câncer de próstata avançado4. Portanto, há uma necessidade crescente de modelos pré-clínicos estudar o câncer de próstata. No entanto, devido as diferenças inerentes entre o rato e a próstata humana, modelagem de câncer de próstata em GEMMs não ganhou popularidade até o sistema de classificação de Bar Harbor foi introduzido em 2004, que delineou as alterações histopatológicas no mouse próstata aquando da manipulação genética, identificação de alterações neoplásicas e sua relação com estágios de progressão de câncer em seres humanos5. Uma característica importante da próstata do rato que deve ser levada em consideração enquanto estudava qualquer modelo GEMM da próstata é a presença de quatro pares distinto dos lobos: anterior, lateral, ventral e dorsal. Os lóbulos apresentam diferenças significativas na histopatologia e gene expressão padrão6. Padrão de expressão de proteínas probasin pode variar entre lóbulos no jovem pós-puberdade ratos7, que deve ser considerado desde modelos baseados em Cre GEMM destinam-se principalmente usando um promotor baseada em probasin chamado Pb-Cre47. As diferenças espaciais e temporais resultantes em Cre expressão muitas vezes levam a diferenças nos cronogramas de iniciação e progressão do tumor, bem como diferenças nas alterações neoplásicas entre os lóbulos. Portanto, é importante dar conta de tais diferenças, enquanto estudava o desenvolvimento do tumor na próstata GEMMs, e os lóbulos individuais podem precisar ser avaliado separadamente para obter resultados reprodutíveis. A primeira parte deste artigo descreve os métodos apropriados para dissecar uma próstata de rato, identificar e separar cada lóbulo e reconhecer as diferenças histológicas entre os lóbulos.
Enquanto a análise do crescimento do tumor e a histopatologia pode fornecer insights valiosos sobre o desenvolvimento do tumor, eles não fornecem muitas informações sobre mecanismos moleculares. Para estudar o mecanismo de desenvolvimento do tumor e progressão, muitas vezes é útil analisar o tumor de células in vitro. Vários métodos têm sido sugeridos ao longo dos anos que envolvem culturas destas células, incluindo culturas de suspensão, culturas 3D8 e recentemente, 2D regular culturas9. Considerando que a maioria desses métodos resulta em taxas de sobrevivência e proliferação de células boas, as culturas 3D fornecem um ambiente mais próximo de condições fisiológicas. Em 3D ou esferoide culturas cultivadas em uma membrana basal da matriz extracelular (ECM), as células totalmente diferenciadas luminal geralmente têm taxa de sobrevivência muito baixo; no entanto, as células basais e intermediárias (principalmente as células-tronco) são capazes de se propagar e produzir aglomerados de células chamados de esferoides10. Isso o torna adequado para um estudo de câncer desde cancros epiteliais acredita-se que se originam de células-tronco (popularmente conhecidas como câncer células-tronco)11. A segunda parte do presente protocolo descreve um método para o cultivo de células da próstata do rato em culturas 3D. As esferas resultantes podem ser usadas para diversos tipos de análises a jusante, incluindo o estudo da morfologia de organoides e comportamento por célula viva da imagem latente, mancha de proteínas diferentes e o estudo de respostas para quimioterápicos tratamentos.
No geral, o objetivo do presente protocolo é delinear o ideais métodos para usar modelos de rato no cancro da próstata, descrevendo as técnicas de anatomia e dissecação da próstata do rato e o processamento do tecido para culturas de esferoide e análise em vitro .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1491px;" width="1491">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit)</td>
			<td style="width:260px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:196px;">MOUSEKIT</td>
			<td style="width:620px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">RPMI medium</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dissection medium (DMEM + 10%FBS)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>10438018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:415px;">PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Collagenase</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">17018029</td>
			<td>Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">DNase I</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001&#160;ROCHE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Syringes and Needles</td>
			<td style="width:260px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fisherbran&#160;Sterile Cell Strainers, 40&#956;m</td>
			<td style="width:260px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PrEGM BulletKit&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Lonza</td>
			<td>CC-3166</td>
			<td>Add all componenets, aliquot and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Matrigel membrane matrix</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dispase II powder</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">17105041</td>
			<td>Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification, histological characterization, and dissection of mouse prostate lobes for in vitro 3d spheroid culture models

Modelos do rato geneticamente modificados (GEMMs) servem como modelos pré-clínicos eficazes para investigar a maioria dos tipos de cânceres humanos, incluindo o câncer de próstata (PCa). Compreender a anatomia e histologia da próstata do rato é importante para a utilização eficiente e adequada caracterização de tais modelos animais. A próstata de rato tem quatro pares distinto de lóbulos, cada um com características próprias. Este artigo demonstra o método apropriado de dissecação e identificação dos lobos da próstata do rato para análise da doença. Pós-dissecação, as células da próstata podem ser ainda mais cultivadas em vitro para compreensão mecanicista. Desde o rato próstata células primárias tendem a perder suas características normais quando cultivadas em vitro, nós esboçamos aqui um método para isolar as células e cultivá-las como culturas de esferoide 3D, que é eficaz para preservar o fisiológico características das células. Essas culturas 3D podem ser usadas para analisar a morfologia da célula e níveis de comportamento em condições fisiológicas perto, investigando alterado e localizações das principais proteínas e vias envolvidas no desenvolvimento e progressão de uma doença e olhando para respostas para tratamentos com drogas.

Os lobos da próstata do rato podem ser identificados e dissecados usando suas localizações em relação as vesículas seminais e a uretra. A próstata do rato é composta de 4 pares de lobos localizada dorsalmente e ventralmente para as vesículas seminais e a uretra. Figura 4a e 4b (topo) mostram os pontos de vista dorsais e ventrais da próstata intacto, junto com as vesículas seminais e a uretra. Os painéis de fundo (<strong class="xf...

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Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Identificação, caracterização histológica e dissecação dos lobos da próstata do rato para em Vitro Spheroid 3D modelos de cultura

Camundongos geneticamente modificados são modelos úteis para investigar mecanismos de câncer de próstata. Aqui nós apresentamos um protocolo para identificar e dissecar os lobos da próstata de um sistema urogenital do rato, diferenciá-los com base em histologia e isolar e cultura primária de células da próstata em vitro como esferoides para análises a jusante.

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Este método pode ajudar no início de modelos de camundongos geneticamente modificados de câncer de próstata e investigação do mecanismo de câncer de próstata através de análise in vivo e in vitro. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite uma análise completa do modelo de camundongos cancerosos de próstata, desde a dissecção tecidual até o isolamento celular e a cultura. Depois de expor o sistema urogenital, ou UGS, segure firmemente a bexiga urinária com fórceps médios e levante todo o sistema do abdômen do rato.Deslize um par de tesouras sob a bexiga e próstata até a coluna para fazer uma incisão através da medula espinhal, e corte todas as conexões restantes com a cavidade abdominal para permitir a remoção de todo o UGS. Transfira o UGS para uma placa de Petri de seis centímetros contendo dois a seis mililitros de PBS sob um microscópio dissecador. E use um par de fórceps finos e tesouras de microdisseção para limpar cuidadosamente toda a gordura dos lados dorsal e ventral do sistema tecidual sem cortar nenhum tecido da próstata.Quando toda a gordura tiver sido removida, puxe a bexiga com os fórceps e extirpe a bexiga em sua base. Coloque o lado ventral do tecido restante para cima e segurando uma extremidade do duto com as fórceps, siga o vaso até sua base com uma tesoura e extirpe o vaso em sua base. Remova o mesmo vaso do outro lado e insira os fórceps entre as vesículas seminal e a próstata para permitir o corte de qualquer tecido conjuntivo adjacente conforme necessário.Em seguida, rastreie os vesículos seminais até sua base na uretra e remova os vasos sem perfurar-os. Quando ambas as vesículas tiverem sido removidas, coloque o lado dorsal do tecido para cima para que os lobos dorsais que se assemelham às asas de uma borboleta sejam visíveis. Segurando cada lobo dorsal com fórceps, corte o tecido em sua base com uma tesoura para coletar os lóbulos dorsais e gire o tecido para o lado ventral.Colete os lóbulos laterais, que são pequenos e geralmente envolvem a uretra ao lado e ficam presos entre os lobos anterior, ventral e dorsal da mesma forma. Colete os lóbulos ventral, que são maiores que os lóbulos laterais e deite-se na uretra ventrally. Em seguida, corte e descarte a uretra para colher os lóbulos anteriores.Para processar o tecido da próstata para a cultura 3D, transfira os lóbulos para um prato de 10 centímetros contendo dois a três mililitros de DMEM, e use um bisturi para picar os túbulos da próstata da forma mais fina e uniforme possível. Transfira os fragmentos de tecido para uma capa de cultura tecidual estéril e adicione a solução de tecido a um novo tubo de 15 mililitros. Leve o volume no tubo até nove mililitros com meio fresco, e adicione um mililitro de solução de estoque de colagenase TenX à mistura de tecido.Após o vórtice, incubar o tubo com agitação por duas horas a 37 graus Celsius para degradar a matriz extracelular. No final da incubação, recolham o tecido por centrifugação e suspendam a pelota em dois mililitros de tiras quentes de 05% em EDTA. Após cinco minutos de 37 graus Celsius para facilitar o corte das aderências célula-a-célula e célula-matriz, use uma pipehead P1000 com uma ponta de placa larga para triturar o tecido oito a dez vezes para quebrar qualquer aglomerado.Repita a dissociação com uma ponta p200 pipehead. Em seguida, neutralize o trypsin com três mililitros de meio completo. Misture 500 unidades de DNASE1 no chorume tecidual e passe a solução cinco a dez vezes através de uma seringa de cinco mililitros equipada com uma agulha calibre 18, seguida por cinco vezes através de uma agulha de calibre 20.Quando não houver mais pedaços de tecido grande visível, filtre a suspensão através de um filtro de 40 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros e colete as células por centrifugação. Para o revestimento celular e cultura, suspenda a pelota em 0,5 mililitros de meio completo de crescimento epitelial da próstata, e aludir as células a cinco vezes 10 a 5 células por mililitro de concentração média de crescimento de células epiteliais da próstata. Misture as células com a matriz extracelular da membrana do porão a um volume de dois a três volumes de razão de solução, e plaque a suspensão celular no recipiente de cultura celular experimental apropriado.Em seguida, coloque as células em uma incubadora de cultura celular por 30 minutos. Quando a matriz extracelular se solidificar, cubra a cultura com meio de crescimento completo de células epiteliais da próstata pré-aquecida, tomando cuidado para não perturbar o plug da matriz extracelular da membrana do porão. Em seguida, devolva as células à incubadora de cultura celular por cinco a dez dias, refrescando metade do meio a cada dois ou três dias.Para colher esferas, aspire o meio cuidadosamente sem perturbar o plug de gel de matriz extracelular da membrana do porão, e adicione um mililitro de solução Disbase para 100 microliters de membrana extracelular da membrana do porão. Usando um raspador de célula, raspe ao longo da parte inferior da placa para levantar os géis extracelulares da membrana do porão da parte inferior da placa para o supernaente, e encanar toda a solução uma vez para quebrar o plugue em pedaços menores. Incubar as peças de matriz celular extra na incubadora de cultura celular por uma a duas horas até que a matriz extracelular da membrana do porão tenha se dissolvido completamente.Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros. E coletar as células por centrifugação para mais manipulação a jusante. A próstata do rato é composta por quatro pares de lóbulos localizados dorsalmente e ventricamente para os vesículos seminal e uretra.Os lobos da próstata são compostos por múltiplos perfis de glândulas, cada um composto por um lúmen, cercado por células epiteliais secretary. As formas dos lóbulos, a organização das células e a natureza da secreção variam de lobo ao lobo. As células isoladas da próstata começam a crescer em organoides até quatro dias após a cultura da matriz extracelular da membrana do porão.Durante os próximos um a seis dias, a maioria das células cresce em esferas sólidas com uma fração das esferas exibindo um lúmen parcial ou completo. Os esferoides também demonstram uma forte coloração beta catenin nas junções célula-célula que co-localizam com a coloração F-actin. Ao tentar este procedimento, é muito importante seguir meticulosamente as etapas de microdisseção.Por exemplo, isole os lóbulos da próstata enquanto eles ainda estão ligados à uretra, então você sabe qual lóbulo é o que se baseia em onde eles estão em relação à uretra. Após o procedimento de dissecção, os lóbulos isolados podem ser usados para análise a jusante, como sequenciamento rma, mancha ocidental ou imunostaining. A técnica primária de cultura 3D permite que você obtenha mais insights sobre o mecanismo do câncer de próstata, porque você pode monitorar a vida com esferoides para mudanças de morfologia e comportamento e identificar quaisquer alterações neoplásicas no mesmo.Em resumo, esses métodos de dissecção e cultura da próstata podem estar incorporando a várias aplicações a jusante para fornecer informações valiosas para investigar o mecanismo do câncer de próstata usando modelos de camundongos geneticamente modificados.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Um sistema de cultura 3D baseado em Inserir Filtro Rápido para próstata primário Diferenciação Celular

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

Pesquisa do câncer

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

A evaporação de redução de Cultura condição aumenta a reprodutibilidade da Formação multicelular esferoidal em placas de microtitulação

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Seção de mamíferos mamários completos para identificação de lesões

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Terapia de testes em um modelo de cultura celular 3D baseado no Spheroid para cabeça e pescoço Carcinoma de células escamosas

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Um modelo de pele Melanoma de Organotypic 3D esferoide

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Avaliando a viabilidade celular e morte em 3D culturas esferóides de células cancerosas

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Estabelecimento de modelos de xenoenxertos derivados de câncer gástrico e linhas celulares primárias

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Um modelo de spheroid 3D como um sistema mais fisiológico para fibroblastos associados ao cancro diferenciação e invasão in vitro estudos

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Avaliando a capacidade de diferenciação das células epitelias da próstata do camundongo usando a cultura organóide

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Caracterização dos efeitos de inibidores de Migrastatic na invasão do spheroid do tumor 3D pela microscopia confocal de alta resolução

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...