Name: identification, histological characterization, and dissection of mouse prostate lobes for in vitro 3d spheroid culture models
Uploaded: 2018-09-18T14:30:00
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Este trabajo fue apoyado por la beca del Instituto Nacional del cáncer, R01CA161018 de LK.

Todos los experimentos de ratón descritos aquí fueron realizados según las directrices descritas en los protocolos institucionales aprobado por el IACUC en SUNY Upstate Medical University.
1. la disección del Sistema Urogenital (UGS)
Nota: El esquema se presenta en la figura 1.
<ol><li>Eutanasia a un ratón C57BL/6 macho de 3 meses utilizando el método de eutanasia por inhalación de CO2 u otra técnica aprobada. No...

<ol>
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P., Adisetiyo, H., Liang, M., Roy-Burman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+enhance+the+gland-forming+capability+of+prostate+cancer+stem+cells.">Cancer-associated fibroblasts enhance the gland-forming capability of prostate cancer stem cells.</a> Cancer Research. 70 (18), 7294-7303 (2010).</li></ol>

Este documento describe los métodos de disección de la próstata del ratón e identificación de los lóbulos individuales. También se describe, es el protocolo para el cultivo de células de próstata de ratón en una cultura 3D para análisis en vitro .
Un paso crítico en el protocolo de disección es cosechar el UGS todo fuera del ratón (1) y separar los órganos individuales bajo un microscopio de disección. El tejido de la próstata es muy pequeño y rodeado por el resto de...

La comunidad científica ha estado tratando de aclarar el complejo mecanismo de desarrollo de cáncer en humanos por décadas. Considerando que la identificación de potenciales actores y dianas farmacológicas comienza con estudios de tejido y células del paciente, la aplicación traslacional de tales hallazgos a menudo requiere el uso de modelos animales preclínicos. El uso de ratones modificados genéticamente modelos (GEMMs) a cánceres humanos modelo ha aumentado constantemente desde el establecimiento del ratón modelos de humano cánceres consorcio (NCI-MMHCC), una Comisión que pretendía describir y unificar las características del cáncer de ratón modelos para los científicos en todo el mundo1,2. Modelos de ratón satisfacen la necesidad de estudios mecanísticos en los estudios preclínicos de la mayoría de los tipos de cáncer, para entender el desarrollo, progresión, respuesta a tratamientos y adquirieron resistencia3.
El cáncer de próstata es el cáncer que ocurre más comúnmente en hombres, afectando a más de 160.000 hombres cada año4. Formas agresivas de la enfermedad dicen decenas de miles de vidas cada año. Sin embargo, el mecanismo de progresión de la enfermedad es todavía mal entendido. Esto resulta en una grave falta de opciones de tratamiento eficaz para cáncer de próstata avanzado y metastásico, como lo demuestra la alta tasa de mortalidad en pacientes de cáncer de próstata avanzado4. Por lo tanto, existe una creciente necesidad de modelos preclínicos estudiar el cáncer de próstata. Sin embargo, debido a las diferencias inherentes entre el ratón y el humano de la próstata, modelado del cáncer de próstata en GEMMs no ganó popularidad hasta que el sistema de clasificación de Bar Harbor fue introducido en 2004, que se describe cambios histopatológicos en el ratón próstata en manipulación genética, la identificación de cambios neoplásticos y su relación con las etapas de la progresión del cáncer en los seres humanos5. Una característica importante de la próstata del ratón que debe tenerse en cuenta al estudiar cualquier modelo de GEMM la próstata es la presencia de cuatro distintos pares de lóbulos: anterior, lateral, ventral y dorsal. Los lóbulos presentan diferencias significativas en la histopatología y gene expresión patrón6. Patrón de expresión de la proteína probasin puede variar entre los lóbulos en ratones jóvenes post pubertad7, que debe ser considerado ya que Cre de GEMM modelos están diseñados en su mayoría utilizando un promotor basada en probasin llamado Cre4 Pb7. Las diferencias espaciales y temporales resultantes en Cre expresión a menudo conducen a diferencias en los plazos de iniciación y progresión del tumor así como las diferencias en cambios neoplásicos entre los lóbulos. Por lo tanto, es importante tener en cuenta esas diferencias mientras estudiaba el desarrollo del tumor en la próstata GEMMs y los lóbulos individuales deben evaluarse por separado para lograr resultados reproducibles. La primera parte de este artículo describe los métodos apropiados para disecar una próstata de ratón, identificar y separar cada lóbulo y reconocer las diferencias histológicas entre los lóbulos.
Mientras que el análisis del crecimiento del tumor y la histopatología puede proporcionar información valiosa en el desarrollo del tumor, no brindan mucha información acerca de los mecanismos moleculares. Para estudiar el mecanismo de desarrollo del tumor y la progresión, a menudo es útil analizar el tumor las células in vitro. Varios métodos se han sugerido sobre los años que implican cultivos de estas células, incluyendo suspensión culturas, culturas 3D8 y recientemente, 2D regulares culturas9. Mientras que la mayoría de estos métodos resulta en tasas de supervivencia y proliferación celular bien, las culturas 3D proporcionan un entorno más cercano a las condiciones fisiológicas. En 3D o esferoide culturas cultivadas en una matriz extracelular (ECM) de la membrana basal, las células luminales completamente diferenciadas generalmente tienen muy baja tasa de supervivencia; sin embargo, las células basales e intermedias (sobre todo células) son capaces de difundir y producir racimos de célula llamados esferoides10. Esto hace conveniente para un estudio de cáncer ya que se creen que proceden de las células madre (popularmente conocidas como las células madre cancerosas)11los cánceres epiteliales. La segunda parte de este protocolo describe un método para el cultivo de las células de próstata mouse en culturas 3D. Las esferas resultantes se pueden utilizar para varios tipos de análisis de aguas abajo, incluyendo el estudio de la morfología de organoides y el comportamiento de células vivas imágenes, inmunofluorescencia, tinción de proteínas diferentes y el estudio de las respuestas a la quimioterapia tratamientos.
En general, el objetivo de este protocolo es exponer métodos óptimos para el uso de modelos de ratón en el cáncer de próstata mediante la descripción de las técnicas de disección y anatomía de la próstata del ratón y el procesamiento del tejido para análisis en vitro y esferoide culturas .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1491px;" width="1491">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit)</td>
			<td style="width:260px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:196px;">MOUSEKIT</td>
			<td style="width:620px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">RPMI medium</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dissection medium (DMEM + 10%FBS)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>10438018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:415px;">PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Collagenase</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">17018029</td>
			<td>Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">DNase I</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001&#160;ROCHE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Syringes and Needles</td>
			<td style="width:260px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fisherbran&#160;Sterile Cell Strainers, 40&#956;m</td>
			<td style="width:260px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PrEGM BulletKit&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Lonza</td>
			<td>CC-3166</td>
			<td>Add all componenets, aliquot and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Matrigel membrane matrix</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dispase II powder</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">17105041</td>
			<td>Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification, histological characterization, and dissection of mouse prostate lobes for in vitro 3d spheroid culture models

Modelos de ratón modificados genéticamente (GEMMs) sirven como eficaces modelos preclínicos para investigar muchos tipos de cánceres humanos, incluido el cáncer de próstata (PCa). Comprender la anatomía y la histología de la próstata del ratón es importante para el uso eficiente y adecuada caracterización de dichos modelos animales. La próstata del ratón tiene cuatro distintos pares de lóbulos, cada uno con sus propias características. Este artículo muestra el método correcto de disección e identificación de lóbulos próstata mouse para el análisis de la enfermedad. Disección posterior, las células de la próstata pueden ser más culta en vitro para comprensión mecanicista. Desde el ratón próstata células primarias tienden a perder sus características normales cuando cultivo en vitro, esbozamos aquí un método para aislar las células y crecen como cultivos 3D esferoide, que es eficaz para preservar el fisiológico características de las células. Estas culturas 3D pueden utilizarse para analizar la morfología de la célula y los niveles de comportamiento en condiciones fisiológicas cerca, investigando alterado y localizaciones de proteínas clave y vías que intervienen en el desarrollo y la progresión de una enfermedad y mirando respuestas a tratamientos farmacológicos.

Los lóbulos de próstata del ratón pueden ser identificados y disecaron usando sus ubicaciones con respecto a las vesículas seminales y la uretra. La próstata del ratón está compuesto por 4 pares de lóbulos situados dorsalmente y ventralmente a las vesículas seminales y la uretra. Figura 4a y 4b (arriba) muestran las vistas dorsales y ventrales de la próstata intacta, junto con las vesículas seminales y uretra. Los paneles de la par...

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Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Identificación, caracterización histológica y disección de ratón próstata lóbulos para modelos In Vitro esferoide 3D cultura

Ratones modificados genéticamente son modelos útiles para la investigación de mecanismos del cáncer de próstata. Aquí presentamos un protocolo para identificar y disecar la próstata lóbulos de un mouse del Sistema urogenital, diferenciarlas basados en la histología y aislar y cultura primaria células prostáticas en vitro como esferoides para análisis posteriores.

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Este método puede ayudar en el inicio de modelos de ratón genéticamente diseñados de cáncer de próstata y la investigación del mecanismo de cáncer de próstata a través de análisis in vivo e in vitro. La principal ventaja de esta técnica es que permite un análisis completo del modelo de ratón de cáncer de próstata, desde la disección de tejido hasta el aislamiento celular y el cultivo. Después de exponer el sistema urogenital, o UGS, agarre firmemente la vejiga urinaria con fórceps contundentes medios y levante todo el sistema desde el abdomen del ratón.Deslice un par de tijeras debajo de la vejiga y la próstata hasta la columna vertebral para hacer una incisión a través de la médula espinal, y corte a través de las conexiones restantes a la cavidad abdominal para permitir la extracción de todo el UGS. Transfiera el UGS a un plato Petri de seis centímetros que contenga de dos a seis mililitros de PBS bajo un microscopio diseccionante. Y usa un par de fórceps finos y tijeras de microdisección para eliminar cuidadosamente toda la grasa de los lados dorsal y ventral del sistema tisular sin cortar ningún tejido prostático.Cuando se haya extraído toda la grasa, tire de la vejiga con los fórceps e insu situes la vejiga en su base. Coloque el lado ventral del tejido restante hacia arriba y sosteniendo un conducto termina con los fórceps, siga el recipiente hasta su base con tijeras e excime el vaso en su base. Retire el mismo vaso en el otro lado e inserte los fórceps entre las vesículas seminales y la próstata para permitir el recorte de cualquier tejido conectivo adyacente según sea necesario.A continuación, trace las vesículas seminales hasta su base en la uretra y retire los vasos sin perforarlos. Cuando ambas vesículas hayan sido removidas, coloque el lado dorsal del tejido hacia arriba para que los lóbulos dorsales que se asemejan a las alas de una mariposa sean visibles. Sosteniendo cada lóbulo dorsal con fórceps, corte el tejido en su base con tijeras para recoger los lóbulos dorsales y gire el tejido hacia el lado ventral.Recoger los lóbulos laterales, que son pequeños y generalmente envuelven la uretra en el lado y se atatan entre los lóbulos anterior, ventral y dorsal de la misma manera. Recoger los lóbulos ventrales, que son más grandes que los lóbulos laterales y se encuentran en la uretra ventralmente. Luego corta y desecha la uretra para cosechar los lóbulos anteriores.Para procesar el tejido prostático para el cultivo 3D, transfiera los lóbulos a un plato de 10 centímetros que contenga de dos a tres mililitros de DMEM, y use un bisturí para picar los túbulos de próstata de la forma más fina y uniforme posible. Transfiera los fragmentos de tejido a una capucha de cultivo de tejido estéril y agregue la solución de tejido a un nuevo tubo de 15 mililitros. Lleve el volumen en el tubo hasta nueve mililitros con medio fresco, y agregue un mililitro de solución de stock de colagenasa TenX a la mezcla de tejido.Después del vórtice, incubar el tubo con agitación durante dos horas a 37 grados Celsius para degradar la matriz extracelular. Al final de la incubación, recoger el tejido por centrifugación y volver a suspender el pellet en dos mililitros de tiras cálidas del 05% en EDTA. Después de cinco minutos de 37 grados Celsius para facilitar el corte de las adherencias de celda a célula y de celda a matriz, utilice un cabezal P1000 con una punta de tablero ancha para triturar el tejido de ocho a 10 veces para romper cualquier grumos.Repita la disociación con una punta de cabezal P200. A continuación, neutralizar la trippsina con tres mililitros de medio completo. Mezclar 500 unidades de DNASE1 en la suspensión de tejido y pasar la solución de cinco a 10 veces a través de una jeringa de cinco mililitros equipada con una aguja de calibre 18, seguida de cinco veces a través de una aguja de calibre 20.Cuando no se visiblen más piezas de tejido grandes, filtre la suspensión a través de un filtro de 40 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros, y recoja las células por centrifugación. Para el enchapado celular y el cultivo, vuelva a suspender el pellet en 0,5 mililitros de medio de crecimiento de células epiteliales de próstata completa, y alude las células a cinco veces 10 a las quintas células por mililitro de concentración media de crecimiento de células epiteliales de próstata. Mezclar las células con matriz extracelular de membrana del sótano en un volumen de dos a tres de relación de solución, y placar la suspensión celular en el recipiente de cultivo celular experimental apropiado.Luego coloque las células en una incubadora de cultivo celular durante 30 minutos. Cuando la matriz extracelular se haya solidificado, cubra el cultivo con medio de crecimiento de células epiteliales de próstata completo precalecido, teniendo cuidado de no perturbar el tapón de matriz extracelular de membrana del sótano. Luego devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante cinco a 10 días, actualizando la mitad del medio cada dos o tres días.Para cosechar esferas, aspirar el medio cuidadosamente sin alterar el tapón de gel de matriz extracelular de membrana del sótano, y añadir un mililitro de solución Disbase para 100 microlitros de matriz extracelular de membrana sótano. Usando un rascador de células, raspe a lo largo de la parte inferior de la placa para levantar los geles extracelulares de membrana del sótano desde la parte inferior de la placa en el sobrenadante, y pipetee toda la solución una vez para romper el tapón en trozos más pequeños. Incubar las piezas de matriz celular adicionales en la incubadora de cultivo celular durante una o dos horas hasta que la matriz extracelular de la membrana del sótano se haya disuelto por completo.A continuación, transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros. Y recoger las células por centrifugación para una mayor manipulación aguas abajo. La próstata de ratón se compone de cuatro pares de lóbulos situados dorsal y ventralmente a las vesículas seminales y la uretra.Los lóbulos prostáticos se componen de múltiples perfiles de la glándula, cada uno compuesto de un lumen, rodeados de células epiteliales secretores. Las formas de los lóbulos, la organización de las células y la naturaleza de la secreción varían de lóbulo a lóbulo. Las células de próstata aisladas comienzan a crecer en organoides tan pronto como cuatro días después del cultivo de matriz extracelular de la membrana del sótano.Durante los siguientes uno a seis días, la mayoría de las células crecen en esferas sólidas con una fracción de las esferas que exhiben un lumen parcial o completo. Los esferoides también demuestran una fuerte tinción de catenina beta en las uniones de célula a célula que se co-localizan con la tinción de F-actina. Al intentar este procedimiento, es muy importante seguir meticulosamente los pasos de microdisección.Por ejemplo, aísle los lóbulos prostáticos mientras todavía están unidos a la uretra, para que sepas qué lóbulo es el que se basa en dónde están con respecto a la uretra. Después del procedimiento de disección, los lóbulos aislados se pueden utilizar para el análisis posterior, como la secuenciación de RMA, la hinchazón occidental o la inmunosumanencia. La técnica de cultivo 3D primario le permite obtener más información sobre el mecanismo de cáncer de próstata, ya que puede monitorear la vida con esferoides para cambios de morfología y comportamiento e identificar cualquier cambio neoplásico en el mismo.En resumen, esta disección de próstata y métodos de cultivo pueden ser incorporados a varias aplicaciones posteriores para proporcionar información valiosa para investigar el mecanismo del cáncer de próstata utilizando modelos de ratón genéticamente diseñados.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Un sistema de cultivo en 3D basado en Insertar rápido de filtro para la próstata primario Diferenciación Celular

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

La evaporación de reducción de Cultura condición aumenta la reproducibilidad del esferoide multicelular Formación en placas de microtitulación

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Seccionando los Montes Enteros de las Glándulas Mamarias para la Identificación de Lesiones

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Terapia de prueba en un modelo de cultivo celular 3D basado en el esferoide para cabeza y cuello de células escamosas

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Un modelo de piel Organotypic Melanoma 3D esferoide

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Evaluación de la viabilidad celular y la muerte en cultivos esferoides 3D de células cancerosas

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Establecimiento de modelos de xenoinjerto saqueos derivados del paciente y líneas celulares primarias

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Un modelo de esferoides 3D como un sistema más fisiológico para la diferenciación de fibroblastos asociados al cáncer y estudios de invasión in Vitro

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Evaluación de la capacidad de diferenciación de las células epiteliales de próstata de ratón utilizando el cultivo organoide

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Caracterización de los efectos de los inhibidores migratorios en la invasión de esferoides de tumores 3D por microscopía confocal de alta resolución

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...