Name: identification, histological characterization, and dissection of mouse prostate lobes for in vitro 3d spheroid culture models
Uploaded: 2018-09-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models at JoVE.com

Bu eser Ulusal Kanser Enstitüsü, R01CA161018 LK için hibe tarafından desteklenmiştir.

Burada açıklanan tüm fare deneyleri kurumsal IACUC onaylı protokolleri SUNY şehir dışında Tıp Üniversitesi'nde özetlenen yönergelere göre yapıldı.
1. ürogenital sistem (UGS) diseksiyon
Not: Şematik resim 1' de sunulmuştur.
<ol><li>CO2 inhalational ötenazi yöntemi veya başka bir onaylanmış teknik kullanarak 3 aylık erkek C57BL/6 fare ötenazi. Not: Fareler 3 ve 12 ay yaşları arasında başarılı...

<ol>
	<li>Marks, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Human+Cancers+Consortium+(MMHCC)+from+the+NCI.">Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI.</a> Cancer Research. 65 (9 Supplement), 242-243 (2005).</li><li>Marks, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Human+Cancers+Consortium+(MMHCC)+from+the+NCI.">Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) from the NCI.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 2 (3-4), 111 (2009).</li><li>Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+mouse+cancer+models:+a+maze+of+opportunities+and+challenges.">Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges.</a> Cell. 163 (1), 39-53 (2015).</li><li>Society, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cancer Facts and Figures. , (2018).</li><li>Shappell, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+Pathology+of+Genetically+Engineered+Mice:+Definitions+and+Classification.+The+Consensus+Report+from+the+Bar+Harbor+Meeting+of+the+Mouse+Models+of+Human+Cancer+Consortium+Prostate+Pathology+Committee.">Prostate Pathology of Genetically Engineered Mice: Definitions and Classification. The Consensus Report from the Bar Harbor Meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee.</a> Cancer Research. 64 (6), 2270-2305 (2004).</li><li>Berquin, I. M., Min, Y., Wu, R., Wu, H., Chen, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+signature+of+the+mouse+prostate.">Expression signature of the mouse prostate.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (43), 36442-36451 (2005).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+epithelial+cell-specific+Cre+transgenic+mouse+model+for+tissue-specific+gene+ablation.">Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation.</a> Mechanisms of Development. 101 (1-2), 61-69 (2001).</li><li>Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+multilineage+differentiation+in+vitro+from+murine+prostate+stem+cells.">Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells.</a> Stem Cells. 25 (11), 2760-2769 (2007).</li><li>Hofner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+conditions+for+the+isolation+and+expansion+of+basal+prostate+progenitor+cells+of+mouse+and+human+origin.">Defined conditions for the isolation and expansion of basal prostate progenitor cells of mouse and human origin.</a> Stem Cell Reports. 4 (3), 503-518 (2015).</li><li>Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+cultivation+and+characterization+of+adult+murine+prostate+stem+cells.">Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (4), 702-713 (2010).</li><li>Clarke, M. F., Fuller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+and+cancer:+two+faces+of+eve.">Stem cells and cancer: two faces of eve.</a> Cell. 124 (6), 1111-1115 (2006).</li><li>Oliveira, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+prostate:+a+basic+anatomical+and+histological+guideline.">The mouse prostate: a basic anatomical and histological guideline.</a> Bosnian Journal of Basic Medical Sciences. 16 (1), 8-13 (2016).</li><li>Colicino, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gravin+regulates+centrosome+function+through+PLK1.">Gravin regulates centrosome function through PLK1.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (5), 532-541 (2018).</li><li>Ittmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+prostate+cancer:+the+consensus+report+of+the+New+York+meeting+of+the+Mouse+Models+of+Human+Cancers+Consortium+Prostate+Pathology+Committee.">Animal models of human prostate cancer: the consensus report of the New York meeting of the Mouse Models of Human Cancers Consortium Prostate Pathology Committee.</a> Cancer Research. 73 (9), 2718-2736 (2013).</li><li>Valkenburg, K. C., Williams, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+prostate+cancer.">Mouse models of prostate cancer.</a> Prostate Cancer. 2011, 895238 (2011).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Abi1/Hssh3bp1+expression+induces+prostatic+intraepithelial+neoplasia+in+the+conditional+Abi1/Hssh3bp1+KO+mice.">Disruption of Abi1/Hssh3bp1 expression induces prostatic intraepithelial neoplasia in the conditional Abi1/Hssh3bp1 KO mice.</a> Oncogenesis. 1, e26 (2012).</li><li>Liao, C. P., Adisetiyo, H., Liang, M., Roy-Burman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+enhance+the+gland-forming+capability+of+prostate+cancer+stem+cells.">Cancer-associated fibroblasts enhance the gland-forming capability of prostate cancer stem cells.</a> Cancer Research. 70 (18), 7294-7303 (2010).</li></ol>

Bu kağıt fare prostat diseksiyon ve bireysel loblar tanımlaması için yöntemleri özetlenmektedir. Ayrıca fare Prostat hücreleri vitro analiz için 3D bir kültür kültür protokolüdür.
Bir kritik diseksiyon Protokolü (1) fare dışında tüm UGS hasat ve diseksiyon mikroskop altında bireysel organları ayıran adımdır. Prostat doku çok küçük ve UGS geri kalanı ile çevrili; Böylece, tüm dört çift lob sağlam tedarik ederken doğrudan doğruya--dan vücut boşlu...

Bilimsel topluluk yıllardır insan kanseri gelişiminin karmaşık mekanizma aydınlatmak kurmaya çalışıyor. Oysa potansiyel anahtar oyuncular ve uyuşturucu hedefleri tanımlaması hasta hücre ve doku çalışmaları ile başlar, translasyonel uygulama gibi bulgular genelde önceden klinik hayvan modelleri kullanılmasını gerektirir. Genetik fareler modelleri (GEMMs) modeli insan kanser için fare modelleri, insan kanser Konsorsiyumu (ncı-MMHCC), hangi tarif ve fare kanser özellikleri birleştirmek için aranan bir komite kurulması beri sayısı giderek kullanımı modeller için bilim adamları Dünya çapında1,2. Fare modelleri mekanik çalışmalar kanser gelişme, ilerleme, yanıt-e doğru tedaviler, anlamak için çoğu türleri önceden klinik çalışmalarda ihtiyacını yerine getirmek ve direnç3satın aldı.
Prostat kanseri erkeklerde her yıl4üzerinde 160.000 erkekleri etkileyen en sık meydana gelen kanserdir. Hastalığın agresif formlarını on binlerce her yıl hayatını iddia. Ancak, hastalık progresyon mekanizma hala kötü anlaşılmaktadır. Etkili tedavi seçenekleri Gelişmiş ve metastatik prostat kanseri, yüksek ölüm oranı gelişmiş prostat kanseri hastalar4kanıtladığı gibi ciddi bir eksikliği sonuçlanır. Bu nedenle, prostat kanseri eğitim önceden klinik modeller için büyüyen bir ihtiyaç vardır. Bar Harbor sınıflandırma sistemi fare histopatolojik değişikliklerin anahatları 2004 ' te kullanılmaya başlanan kadar ancak, fare ve insan prostat arasında içsel farklılıklar nedeniyle modelleme GEMMs prostat kanserinin popülerlik elde değil Prostat genetik manipülasyon, neoplastik değişiklikler tanımlaması ve insanlar5ilerlemesinde kanseri aşamaları onların ilişkisi üzerine. Bir önemli herhangi bir prostat et modeli eğitim sırasında dikkate alınması gereken fare prostat özelliğidir lob dört ayrı çift varlığı: ön, yan, ventral ve dorsal. Loblar histopatoloji ve gen ifade deseni6önemli farklılıklar mevcut. Probasin protein ifade deseninin Cre tabanlı et modelleri çoğunlukla tasarlanmıştır beri hangi probasin tabanlı promotor kullanarak Pb-Cre47adı verilen düşünülmelidir genç sonrası ergenlik fareler7, loblar arasında değişebilir. Cre ifade kez ortaya çıkan kayma ve temporal farklılıkları tümör başlama ve ilerleme zaman çizelgeleri farklılıkları yanı sıra neoplastik değişiklikler farklılıkları loblar arasında yol. Bu nedenle, tümör geliştirme prostat GEMMs okurken bu tür farklılıklar için hesap önemlidir ve bireysel loblar tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için ayrı ayrı değerlendirilmesi gerekebilir. Bu makalenin ilk bölümünde bir fare prostat incelemek, tanımlamak ve her lob ayırmak ve loblar histolojik farklılıkları tanımak için uygun yöntemleri açıklar.
Tümör büyüme ve histopatoloji Analizi değerli tümör geliştirme kazandırabileceğini iken, onlar moleküler mekanizmaları hakkında çok fazla bilgi vermeyin. Tümör gelişimi ve ilerlemesi mekanizması çalışmaya, genellikle tümör hücreleri içinde vitroanaliz etmek yararlı olduğu. Birkaç yöntem süspansiyon kültürler, 3D kültürler8 de dahil olmak üzere bu hücreleri kültürleri içeren yıllar içinde tavsiye ettiler ve son zamanlarda, normal 2D9kültürler. Bu yöntemlerin çoğu iyi hücre hayatta kalma ve nükleer silahların yayılmasına karşı fiyatlarına neden ise 3D kültürler için fizyolojik şartlarda en yakın olan bir ortam sağlamak. Membran hücre dışı matriks (ECM) içinde yetiştirilen 3D veya küresel kültürlerde tamamen farklı luminal hücreleri genellikle çok düşük sağkalım oranı var; Ancak, Bazal ve orta düzey hücreleri (çoğunlukla kök hücre) yayar ve pulcuklarının10denilen hücre kümeleri oluşturmak edebiliyoruz. Epitel kanser kök hücreleri (halk kanser kök hücreleri da bilinen)11' den kaynaklanan inanılıyor bu yana bu bir kanser çalışma için uygun yapar. Bu iletişim kuralı ikinci bölümü 3D kültürlerde fare prostat hücre kültürü çalışmalarının bir yöntem açıklanır. Elde edilen küreler aşağı akım analizleri, insan organoid Morfoloji ve canlı hücre, farklı proteinler için boyama ayirt Imaging davranışı ve kemoterapötik yanıtlarını çalışmanın da dahil olmak üzere çeşitli türleri için kullanılabilir tedaviler.
Genel olarak, bu iletişim kuralının amacı fare prostat anatomi ve diseksiyon teknikleri ve küresel kültür ve vitro analiz için doku işleme açıklayarak prostat kanserinde fare modelleri kullanmak için en iyi yöntemleri anahat etmektir .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1491px;" width="1491">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit)</td>
			<td style="width:260px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:196px;">MOUSEKIT</td>
			<td style="width:620px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:260px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">RPMI medium</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dissection medium (DMEM + 10%FBS)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>10438018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:415px;">PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">10010031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Collagenase</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">17018029</td>
			<td>Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">DNase I</td>
			<td style="width:260px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001&#160;ROCHE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Syringes and Needles</td>
			<td style="width:260px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Fisherbran&#160;Sterile Cell Strainers, 40&#956;m</td>
			<td style="width:260px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PrEGM BulletKit&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Lonza</td>
			<td>CC-3166</td>
			<td>Add all componenets, aliquot and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Matrigel membrane matrix</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Dispase II powder</td>
			<td style="width:260px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:196px;">17105041</td>
			<td>Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification, histological characterization, and dissection of mouse prostate lobes for in vitro 3d spheroid culture models

Genetiği fare modelleri (GEMMs) en tip-in insan kanser, prostat kanseri (PCa) dahil olmak üzere araştırma için etkili önceden klinik modelleri olarak hizmet vermektedir. Anatomi ve histoloji fare prostat anlama, hayvan tür modeller uygun karakterizasyonu ve verimli kullanım için önemlidir. Fare prostat dört ayrı çift lob, her biri kendi özellikleri vardır. Bu makalede, diseksiyon uygun yöntem ve fare prostat lob hastalığı analiz için kimlik gösterilir. Sonrası diseksiyon, prostat hücreler kültürlü vitro mekanik anlamak için daha fazla olabilir. Fare beri prostat primer hücre normal özellikleri kaybolur gideriz ne zaman kültürlü vitro, biz anahat burada hücreleri izole ve onları fizyolojik korumak için etkili olduğu 3D küresel kültürler büyüyen bir yöntem hücre özellikleri. Bu 3D kültürler hücre morfolojisi ve değiştirilmiş davranışı soruşturma fizyolojik koşullarda düzeyleri ve yerelleştirmeler anahtar proteinlerin ve yollarının geliştirilmesinde rol ve hastalığın ilerleme çözümlemek ve bakmak için kullanılabilir ilaç tedavileri için yanıt.

Fare prostat loblar belirlenebilir ve seminal veziküller ve üretra ile ilgili konumlarını kullanarak disseke. Fare prostat 4 çift seminal veziküller ve üretra lob dorsally yer alan ve ventrally oluşur. Şekil 4a ve 4b (ilk) olduğu gibi prostat, seminal veziküller ve üretra ile birlikte dorsal ve ventral görünümlerini göstermek. (Şekil 4 c ve 4 d) alt paneller için kimlik özetlen...

Watch this Scientific Journal Video about Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models at JoVE.com

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Kimlik, histolojik karakterizasyonu ve için fare Vitro 3D küresel kültür modelleri prostat lob diseksiyonu

Genetik fareler prostat kanseri mekanizmaları araştıran için yararlı modellerdir. Burada bir fare ürogenital sistemden prostat loblar incelemek, Histoloji üzerinde göre ayırt etmek ve yalıtmak ve pulcuklarının aşağı akım analizleri için olarak birincil Prostat hücreleri vitro kültür için bir iletişim kuralı mevcut.

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

Bu yöntem, prostat kanserinin genetiği değiştirilmiş fare modellerinin başlangıcında yardımcı olabilir ve in vivo ve in vitro analiz yoluyla prostat kanseri mekanizmasının araştırılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, doku diseksiyonundan hücre izolasyonuna ve kültüre kadar prostat kanseri fare modelinin tam bir analizini sağlamasıdır. Ürogenital sistemi veya UGS maruz kaldıktan sonra, sıkıca orta künt forseps ile idrar kesesi kavramak, ve fare karın tüm sistemi yukarı kaldırın.Omurilik yoluyla bir kesi yapmak için mesane ve prostat altında makas bir çift slayt ve tüm UGS kaldırılmasına izin vermek için karın boşluğuna kalan bağlantıları keserek. UGS'yi, iki ila altı mililitre PBS içeren altı santimetrelik petri kabına, bir diseksiyon mikroskobu altında aktarın. Ve ince forseps ve mikrodissection makas bir çift kullanın dikkatle herhangi bir prostat dokusu snipping olmadan doku sisteminin hem dorsal ve ventral taraf tüm yağ temizlemek için.Tüm yağ çıkarıldığında, forceps ile mesane çekin ve tabanında mesane çıkarmak. Kalan doku ventral tarafı yerleştirin ve bir kanal tutarak forceps ile biter, makas ile tabanına gemi takip ve tabanında gemi çıkarmak. Diğer tarafta aynı damarı çıkarın ve gerekli olarak herhangi bir bitişik bağ dokusunun snipping izin vermek için seminal veziküller ve prostat arasında forceps yerleştirin.Daha sonra seminal vezikülleri üretradaki üslerine kadar takip edin ve damarları delmeden çıkarın. Her iki vezikül çıkarıldığında, bir kelebeğin kanatlarına benzeyen dorsal loblar görünür böylece doku dorsal tarafı yerleştirin. Forceps ile her dorsal lob tutarak, dorsal lobları toplamak ve ventral tarafına doku açmak için makas ile tabanında doku kesti.Küçük ve genellikle yan üretra sarın ve aynı şekilde ön, ventral ve dorsal loblar arasında sıkışmış olan lateral loblar, toplamak. Lateral loblardan daha büyük olan ve üretra ventral rallisi üzerinde yatan ventral lobları toplayın. Sonra kesip ön lobları hasat üretra atın.3D kültür için prostat dokusunu işlemek için, DMEM 2-3 mililitre içeren 10 santimetrelik bir çanak lobları transfer ve ince ve eşit olarak prostat tübülleri kıyma için bir neşter kullanın. Doku parçalarını steril doku kültürüne aktarın ve doku çözeltisini yeni 15 mililitrelik bir tüpe ekleyin. Taze orta ile dokuz mililitre ye kadar tüp hacmi getirin ve doku karışımı için TenX kollajenaz stok çözeltisi bir mililitre ekleyin.Girdap sonra, ekstrasellüler matris düşürmek için 37 santigrat derece iki saat sallayarak tüp kuluçka. Kuluçka sonunda, santrifüj ile doku toplamak ve EDTA sıcak% 05 şeritler iki mililitre pelet yeniden askıya. Hücreden hücreye ve hücreden matris yapışıklıklarının ayrılmasını kolaylaştırmak için 37 santigrat derecelik beş dakika dan sonra, herhangi bir kümeleri ayırmak için dokuyu sekiz ila 10 kez triturate için geniş bir tahta ucu ile bir P1000 pipehead kullanın.P200 pipehead ucu ile dissosiation tekrarlayın. Sonra tam orta üç mililitre ile tripsin nötralize. Doku bulamacının içine 500 ünite DNASE1'i karıştırın ve çözeltiyi 18 kalibrelik bir iğneyle donatılmış beş mililitrelik şırıngadan 5 ila 10 kez geçirin ve ardından 20 kalibrelik bir iğneyle beş kez geçirin.Daha fazla büyük doku parçası görünmediğinde, süspansiyonu 40 mikrometrelik bir filtreden 50 mililitrelik konik bir tüpe filtreleyin ve hücreleri santrifüj le toplayın. Hücre kaplaması ve kültürü için, tam prostat epitel hücre büyüme ortamının 0,5 mililitre pelet yeniden askıya, ve beş kez hücreleri ima 10 prostat epitel hücre büyüme orta konsantrasyon mililitre başına beşinci hücrelere. Hücreleri 2-3 hacimlik çözelti oranıyla bazal membran ekstrasellüler matrisle karıştırın ve hücre süspansiyonunu uygun deneysel hücre kültür kabına koyun.Sonra hücreleri 30 dakika boyunca bir hücre kültürü kuluçka yerleştirin. Hücre dışı matriks katılaşmış olduğunda, önceden ısıtılmış komple prostat epitel hücre büyüme ortamı ile kültür kapağı, bodrum membran ekstrasellüler matris fişi rahatsız değil dikkat. Daha sonra hücreleri 5-10 gün boyunca hücre kültürünü niçin kuvöze geri döndürün, her iki ila üç günde bir ortamın yarısını serinletin.Küreleri hasat etmek için, orta dikkatle bodrum membran ekstrasellüler matris jel fiş rahatsız etmeden orta aspire, ve 100 mikrolitre bodrum membran ekstrasellüler matris için Disbase çözeltisi bir mililitre ekleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, üstnatant içine plakanın alt kısmından bodrum membran ekstrasellüler jelleri kaldırmak için plakanın alt boyunca kazıyın ve daha küçük parçalara fişi kırmak için bir kez tüm çözüm boru. Hücre kültürü kuluçka makinesindeki ekstra hücresel matris parçalarını, hücre dışı matriks tamamen eriyene kadar 1-2 saat kuluçkaya yatırın.Sonra hücre süspansiyonuna 15 mililitrelik bir tüp e aktarın. Ve daha aşağı manipülasyon için santrifüj ile hücreleri toplamak. Fare prostatı meni vezikülleri ve üretra için dorsally ve ventrally bulunan loblar dört çift oluşur.Prostat lobları birden fazla bez profilleri oluşur, her bir lümen oluşan, salgı epitel hücreleri ile çevrili. Lobların şekilleri, hücrelerin organizasyonu ve salgının doğası lobdan loba değişir. İzole prostat hücreleri, hücre dışı bazal matris kültüründen dört gün sonra organoidler halinde büyümeye başlar.Sonraki bir ila altı gün içinde, hücrelerin çoğu kısmi veya tam lümen sergileyen kürelerin bir kısmı ile katı küreler halinde büyür. Spheroidler ayrıca F-aktin boyama ile birlikte lokalize hücre-hücre kavşaklarında güçlü bir beta catenin boyama göstermektedir. Bu prosedürü çalışırken, mikrodiseksiyon adımlarını titizlikle takip etmek çok önemlidir.Örneğin, prostat loblarını hala üretraya bağlıyken izole edin, böylece üretra ile ilgili olarak hangi lobun nerede olduğunu bilirsiniz. Diseksiyon işlemini takiben, izole loblar rma dizilemesi, Batı lekeleme veya immünboyama gibi downstream analizi için kullanılabilir. Birincil 3D kültür tekniği prostat kanseri mekanizması hakkında daha fazla bilgi edinmenizi sağlar, çünkü morfoloji ve davranış değişiklikleri için küresel yaşam izleyebilir ve aynı neoplastik değişiklikleri tanımlayabilirsiniz.Özetle, bu prostat diseksiyonu ve kültür yöntemleri genetik olarak tasarlanmış fare modelleri kullanarak prostat kanseri mekanizmasını araştırmak için değerli bilgiler sağlamak için çeşitli downstream uygulamaları dahil edilebilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Primer Prostat Hücre Farklılaşma için hızlı Filtre Ekle tabanlı 3D Kültür Sistemi

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

Buharlaşma azaltıcı Kültür Durumu Mikrotiter Tabaklar Multisellüler Sfero Oluşumunun Tekrarlanabilirlik artırır

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Lezyon Tanımlaması için Meme Bandı Bütün Dağılımları

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Baş ve boyun Skuamöz hücreli karsinom için bir küresel tabanlı 3D hücre kültür modelinde test terapi

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

3D Organotypic Melanom küresel Cilt modeli

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Hücre viability ve ölüm kanser hücrelerinin 3D Küroid kültürlerde değerlendirilmesi

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Mide kanseri hasta-türetilen xenograft modelleri ve primer hücre hatları kurulması

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Kanser Ilişkili fibroblastlar farklılaşma ve Invazyon In vitro etütler için daha fizyolojik bir sistem olarak bir 3D Küroid modeli

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Organoid Kültürü Kullanarak Fare Prostat Epitel Hücrelerinin Ayırt Etme Kapasitesinin Değerlendirilmesi

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Migrastatik İnhibitörlerin 3Boyutlu Tümör Spheroid İnvazyonu Üzerine Etkilerinin Yüksek Çözünürlüklü Konfokal Mikroskopi Ile Karakterizasyonu

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...