Name: lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine
Uploaded: 2018-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine at JoVE.com

يشكر المؤلفون دوان [مياكسنر] للخبرة في أداء حقن الوريد البابي، ستيف كراج، جوان بيدرسون، وهيلين لوري للدعم أثناء الإجراءات الجراحية. هذا العمل كان تدعمها مؤسسة مينيسوتا لمستشفى الأطفال و "الطب التجديدي" مينيسوتا. تم تمويل R.D.H. من خلال جائزة DK106056 K01 المعاهد الوطنية للصحة ومركز عيادة مايو كلينيك "جائزة تنمية مهنة الطب التجديدي".

جميع الإجراءات الحيوان أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية واستعراض ووافق على "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) قبل إجراء الدراسة. الإجراءات الموصوفة هنا أجريت على الخنازير الذكور والإناث من المزرعة بيضاء كبيرة (50% أبيض كبير Landrace/50% الخلفية الوراثية) تصل إلى 3 أشهر من العمر ا...

<ol>
	<li>Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+metabolism+and+expanded+newborn+screening:+review+and+update.">Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).</li><li>Hansen, K., Horslen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+liver+disease+in+children.">Metabolic liver disease in children.</a> Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).</li><li>Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+for+inborn+errors+of+metabolism:+advancing+towards+the+clinic.">Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic.</a> BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).</li><li>Brunetti-Pierri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+inborn+errors+of+liver+metabolism:+progress+towards+clinical+applications.">Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications.</a> Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).</li><li>Carlson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+TALEN-mediated+gene+knockout+in+livestock.">Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).</li><li>Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+enzymic+defects+in+hereditary+tyrosinemia.">On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+3-dimensional+imaging+of+liver+regeneration+in+a+mouse+model+of+hereditary+tyrosinemia+type+1+using+the+sodium+iodide+symporter+gene.">Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene.</a> Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curative+ex+vivo+liver-directed+gene+therapy+in+a+pig+model+of+hereditary+tyrosinemia+type+1.">Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1.</a> Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).</li><li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272 (5259), 263-267 (1996).</li><li>Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors:+from+virology+to+transgene+expression.">Viral vectors: from virology to transgene expression.</a> British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).</li><li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+basic+to+translational.">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li><li>Chowdhury, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+improvement+of+hypercholesterolemia+after+ex+vivo+gene+therapy+in+LDLR-deficient+rabbits.">Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits.</a> Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).</li><li>Elgilani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Phenotype+Characterization+of+a+Large-Animal+Model+of+Hereditary+Tyrosinemia+Type+1.">Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1.</a> The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).</li><li>Patyshakuliyeva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+utilization+and+metabolism+is+highly+differentiated+in+Agaricus+bisporus.">Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus.</a> BMC Genomics. 14, 663 (2013).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumarylacetoacetate+hydrolase+deficient+pigs+are+a+novel+large+animal+model+of+metabolic+liver+disease.">Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease.</a> Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).</li></ol>

ويصف هذا التقرير السابقين فيفو جينات ذاتي علاج نهج لعلاج نموذجا الخنزير HT-1. أنها تنطوي ظهرت جزئية، تليها السابقين فيفو تتمثل العزلة وتوصيل لعزل خلايا الكبد بالفيروس لينتي تحمل التحوير التصحيحية. ثم يتم زرع خلايا الكبد ذاتي المصوبة العودة إلى الحيوان فاه قاصرة عن طريق الوريد الب...

أخطاء فطرية من الأيض في الكبد هي عائلة من الأمراض الوراثية التي تؤثر مجتمعة ما يصل إلى 1 في 800 مولود حي1. كثير من هذه الأمراض هي عيوب وحيدة الجين2 ويمكن الشفاء من الناحية الوظيفية بإدخال عدد كاف من خلايا الكبد3نسخة مصححة واحدة من الجينات المتأثرة. يختلف حسب المرض4 النسبة المئوية الفعلية لخلايا الكبد التي يحتاج إلى تصحيح وهو يعتمد إلى حد كبير على طبيعة البروتين من ترميز، على سبيل المثال، أغلبه بروتينات مقابل هيولى. في معظم الحالات، هو جزيئي فعالية أي علاج للأمراض الأيضية بسهولة من خلال وجود المؤشرات الحيوية غالباً ما تتوفر في الدورة الدموية.
HT-1 هو خطأ وراثي في التمثيل الغذائي في الكبد ناجم عن خلل في فوماريلاسيتواسيتاتي هيدرولاز (فاه)5، الانزيمية الخطوة الأخيرة في عملية التمثيل الغذائي تيروزين6. يؤدي نقص فاه للبناء من نواتج الأيض السامة في الكبد يمكن أن يسبب فشل الكبد الحاد والموت أو في شكل المرض المزمن يمكن أن يسبب تليف الكبد وسرطانه الخلية الكبدية. المرض سريرياً تديره إدارة 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (نتبك)، مثبط جزيء صغير من إنزيم المنبع من فاه في التمثيل الغذائي تيروزين. المرض ويوفر بيئة مثالية لاختبار أساليب العلاج الجيني، كتصحيح ناجحة حتى عدد صغير من خلايا الكبد في نهاية المطاف سيؤدي إلى إعادة تعمير الكبد الكامل مع الخلايا المصححة في نماذج حيوانية كل صغيرة وكبيرة 7 , 8. وهذا يحدث بسبب تصحيح خلايا تتمتع بميزة بقاء عميقة على الخلايا التي لم يتم تصحيحها بسبب تراكم نواتج الأيض السامة في الأخير. فقدان خلايا الكبد غير المصححة يسمح للتوسيع الانتقائي لخلايا الكبد المصوبة تتسق مع قدرة التجدد في الكبد. يمكن أن يتبع العلاج بسهولة بقياس الانخفاض في تعميم مستويات التيروزين وسوكسينيلاسيتوني بعد زرع الأعضاء.
يجب أن يكون الهدف من هذا النهج بغية تبرير الطبيعة الغازية من الإجراءات، التي تشمل ظهرت جزئي، علاج دائم. ولذلك، تستخدم النسخ المتماثل غير كفء ناقلات لينتيفيرال نظراً لأنهم سوف ستابلي دمج الجينوم تتمثل9. ضمان إيصال الجينات المصححة لجميع الخلايا الوليدة كالكبد ينمو ويتسع ليحل محل الفقدان السريع للخلايا التي لم يتم تصحيحها. وهذا مفيد على ناقلات (إف) الفيروسية الغدد المرتبطة، والتي توجد أساسا ابيسوميس التي يمكن فقط أن تنتقل إلى خلية ابنه واحدة أثناء الانقسام10 وبالتالي فقدان أي أثر للعلاج في غضون أسابيع.
على الرغم من أن مجموعة متنامية من الأدب يدعم سلامة lentivirus11، المخاوف عبر أحداث سمية جينية تخفف عن طريق الحد من توصيل الخلايا المضيفة لبيئة التي تسيطر عليها في المختبر . ابدأ عناصره هو عرض الحرة ناقل المضيف عندما يتم تنفيذ هذا الأسلوب، الحد من التعرض لخلايا الكبد التي سيتم إعادة عرض مع الزرع الذاتي عن طريق الوريد البابي.
يصف هذا التقرير أسلوب العمليات الجراحية و السابقين فيفو الإجراءات المستخدمة لعزل خلايا الكبد للجينات العلاج السابقين فيفو و الزرع الذاتي اللاحقة12 لعلاج الخنازير HT-18. تتضمن عملية كاملة 1) ظهرت جزئي الذي يخدم كمصدر لخلايا الكبد وتحفيز النمو للكبد للمضيف، 2) عزل خلايا الكبد من الكبد قصت تليها السابقين فيفو تصحيح الجينات، وأخيراً 3) إعادة خلايا الكبد تصحيحها مرة أخرى في البلد المضيف. الطريقة الموصوفة تنطبق على جميع نماذج حيوانية كبيرة مع إدخال بعض التعديلات، ولكن فقط تفتقر إلى فاه خنزير13 سوف تتميز ببيئة انتقائية لخلايا الكبد المصوبة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC)</td>
			<td style="width:139px;">Yecuris</td>
			<td style="width:127px;">20-0027</td>
			<td style="width:109px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B12STS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B5SHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 60</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA60AMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 45</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA45AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 30</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>SIG30AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo catch bag</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>173050G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0 PDS</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z340H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J459H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J426H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dermabond</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Sterile Dressing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Williams&#8217;-E Powder&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ME16060P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8875-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1679-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA (g/L)</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>45172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(N-A-C, g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2 2H2O (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D (mg/mL)</td>
			<td>Crescent Chemical</td>
			<td>17456.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexamethasone</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>NDC6337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine

العلاج الجيني اختيار مثالي لعلاج العديد من أخطاء فطرية من الأيض في الكبد. السابقين فيفو، ناقلات لينتيفيرال قد استخدمت بنجاح في معالجة العديد من الأمراض المكونة للدم في البشر، كما يوفر الاستخدام التعبير التحوير مستقرة بسبب متجه القدرة على الاندماج في جينوم مضيف. هذا الأسلوب يوضح التطبيق السابقين فيفو العلاج الجيني لخلايا الكبد لنموذج حيوانات كبيرة من نوع tyrosinemia الوراثية أنا. تتكون هذه العملية من 1) عزل خلايا الكبد الأولية من الحيوان ذاتي الجهات المانحة والمتلقية، 2) السابقين فيفو إيصال الجينات عن طريق توصيل تتمثل مع ناقل لينتيفيرال، وزرع خلايا الكبد تصحيحها عن طريق بوابة 3) ذاتي حقن الوريد. ويعتمد نجاح الأسلوب عموما عند إزالة كفاءة والعقيمة لاستئصال الكبد، حذراً في التعامل مع العينة قصت لعزل خلايا الكبد سليمة كافية لتوصيل إعادة انجرافتينج، ونسبة عالية من الخلايا المعزولة، و الإجراءات الجراحية معقمة في جميع أنحاء للوقاية من العدوى. عطل فني في أي من هذه الخطوات سيؤدي منخفضة الغلة من خلايا الكبد ترانسدوسيد صالحة للزرع الذاتي أو العدوى من الحيوان المانح والمتلقي. نموذج الخنزير tyrosinemia الوراثية النوع البشري 1 (HT-1) المختارة لهذا النهج فريد قابلة لمثل هذا أسلوب، حتى نسبة مئوية صغيرة من انجرافتمينت خلايا تم تصحيحها سيؤدي إلى إعادة تعمير الكبد مع الخلايا السليمة التي تستند إلى قوي ميزة انتقائية على خلايا الكبد الأم مريضة. على الرغم من أن هذا التحديد النمو لن يكون صحيحاً لجميع المؤشرات، هذا النهج هو أساس للتوسع إلى دلائل أخرى ويسمح بالتلاعب بهذه البيئة معالجة أمراض إضافية، سواء داخل الكبد وما بعدها، في حين التحكم في التعرض لناقلات الأمراض الفيروسية والفرصة لسمية خارج الهدف وتوموريجينيسيتي.

استئصال الكبد وزرع ذاتي تمثيلاً تخطيطياً في الشكل 1. في مجموعة تمثيلية من الخنازير 5 الذي خضع لاستئصال الكبد، وكان معظم غلة > المطلوب 1 × 109 خلايا الكبد مع حوالي 80% البقاء (الجدول 2)، توفير الكثير من الخلايا لأي نوع من أنواع التلاعب، بما في ذلك ا...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine at JoVE.com

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

يهدف هذا البروتوكول لوصف تتمثل الخنزير العزلة و السابقين فيفو إيصال الجينات لعلاج نماذج لأمراض التمثيل الغذائي عن طريق زرع الخلايا ذاتي. على الرغم من أن هذا النموذج خاصة تتمتع بمزايا فريدة من نوعها لصالح العلاج الناجح، التطبيق مؤسسة ذات صلة لمعالجة أمراض إضافية والمؤشرات.

العلاج الجيني بوساطة ناقلات لينتيفيرال من خلايا الكبد فيفو السابقين للزرع الذاتي في الخنازير

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

السابقين فيفو العلاج الجيني وزرع الخلايا الذاتية لعلاج الأخطاء غير مولود من التمثيل الغذائي في الكبد هو بديل مهم لعلاج هذه الاضطرابات. ويسمح لنا ليس فقط لعلاج هذه الاضطرابات، ولكن معرفة الكتلة الحيوية اللازمة لتكون قادرة على تحقيق نتيجة علاجية. هذا النهج يتجنب أيضا العواقب الهامة للكبت المناعي وغيرها من العواقب مع أنواع مختلفة من العلاجات.في السياق الحالي، نحن نستخدم هذا النهج لعلاج التيروزين الدمية الوراثية نوع 1. ومع ذلك، فإن الفكرة هي أن هذا سيكون نهج منصة لعلاج العديد من أمراض الكبد المختلفة مع الحد الأدنى من التغيير. من المهم أن تكون قادرًا على تصور هذه التقنية لأن هناك بعض التقلبات عندما يتعلق الأمر بتصور كفاءة الضخ ، وهو أمر ضروري للحصول على خلايا الكبد القابلة للتطبيق للزرع.إجراء العمليات الجراحية التي أجراها روبرت كايزر وجوزيف ليلغارد. عزل الخلية التي يؤديها زيجي دو، بروس أميوت. تم تنقية الخلايا UAU والخلايا الحية السابقة من الخلايا التي تم القيام بها من قبل كيتلين VanLith.تم إعداد الحيوانات والإعدادية OR من قبل كاري ألن ولوري هيلين. لتنفيذ إدخال موقع الميناء الأولي، قم بإجراء تقنية هاسون المفتوحة إلى أومبيليكوس من تخدير، ما يصل إلى ثلاثة أشهر، كبيرة، خنزير مزرعة بيضاء. إدخال trocar 12 ملليمتر في تجويف البطن، حيث الصفاق مرئي.عندما يكون التروكر في مكانه، مرر نطاق 30 درجة من 5 ملليمترات من خلال منفذ الدخول وينزّم البطن بثاني أكسيد الكربون إلى 15 ملليمترا من الزئبق. تحت التصور المباشر مع الكاميرا بالمنظار، ضع 2 منافذ إضافية 5 ملليمتر، والتثليث على الفص الجانبي الأيسر للكبد. ووضع منظار البطن في واحد من المنافذ الجديدة.تحديد الجزء الجانبي الأيسر من الكبد عند نقطة الشق الرئيسي للفص الأيسر الذي يفصل بين الأجزاء الوسطية والشريحة الجانبي الأيسر. واستخدم دباسة جراحية لتأمين الهياكل الوعائية والوريد الكبدي على طول هذا الشق. Transect parenchyma من خلال هذا الشق باستخدام عمليات إطلاق متتالية و 60، 45، أو 30 ملليمتر أحمال الأوعية الدموية الطويلة.عندما يكتمل ال استئصال، تقييم بقايا الكبد لضمان هدسات كافية واستخدام المسكات بالمنظار وكيس استرجاع الأنسجة بالمنظار لاسترداد قسم الكبد. الآن، قم بإزالة المنافذ واستخدم خياطة حجم صفر متقطع لفافية خط الوسط. خياطة 2-0 تشغيل لطبقة الجلد العميقة.وخياطة 4-0 جارية للطبقة تحتية، لإغلاق شق منفذ 12 ملليمتر في الطبقات الثلاث. ثم أغلق المنافذ الخمسة ملليمتر في طبقة واحدة مع 2-0 الغرز. ووضع ضمادة معقمة على الشقوق.لعزل الكبد، أولاً ربط مضخة مُتعالِيّة تُضَمّل لتقديم حلول التشتت، التي يتم الحفاظ عليها في حمام مائي 43 درجة مئوية، إلى القثطارات التي يجب وضعها في الأوعية الكبيرة المكشوفة لقسم الكبد. رئيس المضخة والأنابيب مع محلول اثنين من perfusion، ما يصل إلى موقف وقف الديك للتبديل بين الضخ واحد و perfusion تسليم حل اثنين إلى الأنسجة. والتبديل في وقف الديك إلى موضع واحد perfusion.ثم رئيس بقية مجموعة أنابيب. ملء تماما فخ فقاعة مضمنة لمنع إدخال فقاعات الهواء في الأنسجة. بعد ذلك، قم بعمل شق مستعرض نظيف، عمودي على الدورة الدموية الكبدية للكشف عن المقاطع العرضية لأسعان الوريد المدخل والأوردة الكبدية للقسطرة.واستخدم قسطرة مريحة لقسطرة الأوردة المتاحة المكشوفة. عندما تكون القسطرة في مكانها، اثقب أنسجة الكبد التي تم استئصالها مع التسريب الدافئ حل واحد بمعدل تدفق 100 ملليمتر في الدقيقة. نقل أنبوب المنفذ من الوريد إلى الوريد كل 30 إلى 60 ثانية.وباستخدام أنبوب الإخلاء لإزالة العازلة الزائدة من علبة الأنسجة. بعد ركوب الدراجات في جميع الأوردة المتاحة لمدة 15 إلى 20 دقيقة، والتحول إلى التسريب حل اثنين في ظل نفس الظروف. باستخدام مضخة العودة لإعادة تدوير محلول الضخ الثاني إلى الخزان ، بمعدل تدفق أبطأ ، لإعادة الإدارة إلى الأنسجة.تحقق من درجة حرارة سطح فخ فقاعة و, أو الكبد كل خمس دقائق تقريبا للتأكد من أن خلايا الكبد لا يحصلون على البرد. عندما يبيض الكبد بعد حوالي 30 دقيقة من الضخ ، قم بنقل الأنسجة إلى وعاء معقمة ، ملفوفة بأغطية معقمة ، ووضع الحاوية في غطاء لثقافة الخلية للحفاظ على العقم أثناء معالجة الكبد. يجب أن يتم عزل الكولاجين من خلايا الكبد وفك الخلية تماما حتى لا تحصل على تكتل الخلايا مما يقلل من صلاحية الخلايا وتواتر نقل.غمر الكبد مع الكبد غسل المتوسطة وسحب مقص عبر الجزء العلوي من الأنسجة لتعطيل كبسولة الكبد. ارتداء قفازات معقمة، تدليك الكبد بلطف لإطلاق خلايا الكبد في الوسط. وتصفية الأنسجة فائقة، من خلال الشاش العقيم، في زجاجات أجهزة الطرد المركزي 200 ملليلتر.جمع الكبدات المصفاة عن طريق الطرد المركزي. تجميع الخلايا في 150 ملليلتر من الكبد الطازج غسل المتوسطة في زجاجة واحدة 200 ملليلتر لغسل 2 إضافية. و بعد الخلايا بعد الطرد المركزي الثالثثم، تخفيف الخلايا إلى 1 مرات 10 إلى الخلايا الكبدية التاسعة لكل ملليلتر تركيز ملحي. لزرع تلقائي من خلايا الكبد المعزولة، استخدم محول ميغاهرتز اثنين-خمسة لتحديد الوريد المدخل عبر الموجات فوق الصوتية وتوجيه إبرة خمسة بوصة، 18 مقياس نحو الوريد المدخل الرئيسي، تقريبي إلى تشعب انها. تحميل الخلايا في حقنة 60 ملليلتر، وفقا لحجم الخلية الإجمالية وإرفاق الحقنة إلى الإبرة، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات.بعد ذلك ، قم بالاكتئاب ببطء في المكبس المحاقن ليغرس يدويًا ما يصل إلى 1 مرة إلى 10 مرات إلى الخلايا الكبدية التاسعة من خلال الوريد البواب باستخدام قسطرة التسريب لمراقبة ضغط المسامية أثناء الزرع. عندما يتم تسليم جميع الخلايا، قم بإزالة القسطرة ومراقبة الوريد المدخل لوجود أحداث خثارية وتدفق أمامي عن طريق الموجات فوق الصوتية. في مجموعة تمثيلية من خمسة خنازير، خضع ذلك استئصال الكبد، وكان معظم الغلة من أكبر من 10 إلى الكبد التاسع مع ما يقرب من 80٪ قابلية البقاء.توفير عدد كاف من الخلايا لأي نوع من التلاعب المطلوب، بما في ذلك العلاج الجيني. الثقافة اللاحقة للجزء غير المزروع من هذه الخلايا الكبدية المعدة، أظهرت قابلية جيدة للحياة والالتصاق مع مورفولوجيا الكبد نموذجية 46 ساعة بعد تحويلها والطلاء الأولي. يختلف النقّة الأولية حسب عدد الخلايا التي أعيد إدخالها أثناء عملية الزرع.هذه الخزعات التمثيلية توضح جدولا زمنيا لتوسيع الخلايا المصححة بالجينات. فريدة من نوعها للأمراض, مثل التيروزينيميا الوراثية نوع 1, التي تتمتع ضغط مختارة إيجابية للخلايا السليمة. هذا التوسع هو عادة بعد 12 شهرا من زرع.مرة واحدة في زرع fumary fumtoacetate المياه خروج المغلوب الحيوان قد حققت حوالي 20٪ إعادة السكان من الكبد تصحيحها داخل الكبد، ومستويات التيروزين سوف تطبيع بالمقارنة مع الحيوانات البرية من نوع. في حين أن الحيوانات غير المصححة تظهر ارتفاعًا كبيرًا في كل من فوسفاتاز القلوية وspartate transaminase مقارنة بالحيوانات البرية ، فإن العلاج الجيني السابق vivo يعيد مستويات إنزيمات المصل هذه إلى طبيعتها. علاوة على ذلك ، يتم تعطيل صحة الأيض في الكبد العام في خنازير الضربة القاضية غير المعالجة ، كما هو موضح في الارتفاعات في الأمونيا المتداولة التي يتم تصحيحها بعد إعادة التعداد مع خلايا الكبد المعالجة.من المهم أن نتذكر مع استخدام هذه التقنية للتعامل مع الأنسجة والتلاعب بها بعناية وبزهر قدر الإمكان. زيادة التعامل مع أو التلاعب في الأنسجة، ويؤدي إلى انخفاض صلاحية الخلايا وانخفاض العائد. ويمكن أيضاً أن ينطبق هذا النهج على الأشخاص المهتمين بدراسة توزيع القوس وعدم كفاءة الرسم البياني في تقنيات وضع العلامات، وذلك باستخدام تقنيات أخرى خارج بروتوكولات النقل الفيروسي.لا تنسى أن العمل مع ناقلات الفيروسية يمكن أن تكون خطرة، وذلك باتباع إجراءات السلامة الحيوية المناسبة، فضلا عن ارتداء معدات الحماية الشخصية أمر ضروري عند استخدام هذه التقنيات.

Research

JoVE Journal

Medicine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

فيفو السابقين الثقافة من الأنسجة للمريض وفحص الجينات التسليم

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

فيفو الناب في العضلات وظيفة الفحص

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

إنشاء والدعوة للأورام الشبكية الإنسان في الفئران أن نقص المناعة

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

الإنتاج والكشف عن أنواع الاكسجين التفاعلية (ريوس) في السرطان

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

وسيلة جديدة لإدارة الجراحية داخل الرغامى وكلاء الحيويه في نموذج الفأر الجنينية

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

الجدد في جزيرة تشكيل الكبد من الفئران من السكري من مساعد التي تعتمد على الغدانية نقل الجينات بوساطة ناقلات

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Matrix-assisted Autologous Chondrocyte Transplantation for Remodeling and Repair of Chondral Defects in a Rabbit Model

مصفوفة بمساعدة زرع خلية غضروفية ذاتي لإعادة عرض وإصلاح العيوب غضروفي في نموذج الأرنب

Articular cartilage defects are considered a major health problem because articular cartilage has a limited capacity for self-regeneration 1. Untreated ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

خارج الموقع سوي الحرارة آلة الإرواء من الأكباد المانحة

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

سوي الحرارة<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; الإرواء الكلى للحفاظ على الكلى الطعوم قبل الزرع

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...