Name: lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine
Uploaded: 2018-11-04T13:00:00
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作者感谢 duane meixner 在执行门静脉静脉注射方面的专业知识, steve krage、joanne pederson 和 lori hillin 在外科手术期间的支持。这项工作得到了明尼苏达州儿童医院基金会和明尼苏达州再生医学的支持。r. d. h. 的资金来自 nih k01 dk106056 奖和梅奥再生医学职业发展中心奖。

所有动物程序都是按照机构准则进行的, 并在研究行为之前得到机构动物护理和使用委员会 (iacuc) 的审查和批准。这里描述的程序是在3个月以下被认为健康和适合手术的男性和女性大型白色农场猪 (50% landrace\ 50% 大白遗传背景) 身上进行的。 除非机构兽医护理人员认为动物不兼容, 否则动物是在社会中居住的。 动物每天吃两次适当水平的食物, 每天至少由护理人员观察一次临床体征。
<p class="jov...

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本报告介绍了一种治疗猪 ht-1 模型的体外自体基因治疗方法。它包括部分肝切除术, 其次是体外肝细胞分离和分离肝细胞与伦蒂病毒携带纠正转基因。经修正的自体肝细胞然后通过门静脉8移植回 fah 缺乏的动物。虽然所述方法适用于所有经过一定修改的大型动物模型, 但缺乏 fah 的猪具有对校正细胞13,15具有高度选择性的独...

肝脏代谢的先天错误是一个遗传性疾病的家族, 共同影响多达每800例活产 1.其中许多疾病是单一基因缺陷2 , 可以通过将受影响基因的单一纠正副本引入足够数量的肝细胞3来功能治愈。需要纠正的肝细胞的实际百分比因疾病4而异, 在很大程度上取决于其编码的蛋白质的性质, 例如, 排泄蛋白与细胞质的关系。在大多数情况下, 任何代谢疾病治疗的疗效都很容易通过循环中经常存在的生物标志物来检测。
ht-1 是由富马3-1 乙酸水拉酶 (fah)5的缺陷引起的肝脏代谢的先天错误, 是酪氨酸代谢的最后一步。fah 缺乏导致肝脏中有毒代谢物的积累, 可导致急性肝功能衰竭和死亡, 或慢性形式的疾病可导致肝硬化和肝细胞癌。本病通过 2-(2-硝基-4-四氟甲基苯甲酰)-1, 3-环己二酮 (ntbc) 的管理进行临床管理, 这是一种小分子抑制剂的一种酶上游 fah 在酪氨酸代谢。这种疾病为测试基因治疗方法提供了一个理想的环境, 因为即使是少数肝细胞的成功矫正, 最终也会导致整个肝脏的重新繁殖, 在大小动物模型中都有修正的细胞7.,8. 出现这种情况的原因是, 由于毒性代谢物在未纠正的细胞中积累, 经校正的细胞具有深刻的生存优势。未矫正肝细胞的丢失允许与肝脏再生能力一致的修正肝细胞选择性扩张。治疗后, 可以很容易地测量移植后循环酪氨酸和琥珀酰丙酮水平的下降。
为了证明该程序的侵入性, 其中包括部分肝切除术, 这种方法的目标必须是持久的治疗。因此, 复制不称职的慢病毒载体被使用, 因为他们将稳定地融入肝细胞基因组9。确保随着肝脏的生长和扩张, 将修正后的基因传递给所有的子细胞, 以取代未矫正细胞的快速丢失。这是有利的腺病毒相关 (aav) 载体, 主要存在作为会代体, 只能通过一个单一的子细胞在有丝分裂10 , 从而失去任何效果的治疗在几个星期内。
尽管越来越多的文献支持慢病毒11的安全性, 但通过将宿主细胞的转导限制在受控的体外环境中, 缓解了人们对遗传毒性事件的担忧。自由载体从来没有系统地引入到宿主时, 这种方法进行, 限制暴露于肝细胞, 将通过自体移植通过门静脉重新引入。
本报告介绍了用于分离肝细胞的手术和体外程序的方法, 用于体内基因治疗和随后的自体移植 12治疗 ht-1 猪8。整个过程包括: 1) 部分肝切除术, 作为肝细胞的来源和生长刺激宿主的肝脏, 2) 肝细胞从切除的肝脏, 然后进行体外基因校正, 最后 3) 重新引入修正肝细胞回到宿主。所述方法适用于所有具有一定修饰的大型动物模型, 但只有缺乏 fah 的猪13将具有修正肝细胞的选择性环境的优势。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC)</td>
			<td style="width:139px;">Yecuris</td>
			<td style="width:127px;">20-0027</td>
			<td style="width:109px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B12STS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B5SHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 60</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA60AMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 45</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA45AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 30</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>SIG30AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo catch bag</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>173050G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0 PDS</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z340H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J459H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J426H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dermabond</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Sterile Dressing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Williams&#8217;-E Powder&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ME16060P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8875-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1679-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA (g/L)</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>45172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(N-A-C, g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2 2H2O (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D (mg/mL)</td>
			<td>Crescent Chemical</td>
			<td>17456.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexamethasone</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>NDC6337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine

基因治疗是治疗肝脏代谢许多先天错误的理想选择。在体内, 慢病毒载体已成功地用于治疗人类的许多造血疾病, 因为它们的使用提供了稳定的转基因表达, 因为载体能够融入宿主基因组。该方法表明肝细胞体外基因治疗在 i 型遗传性酪氨酸血症大型动物模型中的应用。这个过程包括 1) 从自体供体受者动物中分离原代肝细胞, 2) 通过肝细胞转导和慢病毒载体进行体内基因传递, 以及 3) 通过门静脉移植矫正肝细胞静脉注射。该方法的成功通常取决于有效和无菌地去除肝切除术, 仔细处理切除标本的存活肝细胞足以重新移植, 分离细胞的高百分比转导,无菌外科手术贯穿始终, 以防止感染。在这些步骤中的任何一个步骤的技术故障都将导致用于自体移植或捐献者受者动物感染的活转染肝细胞的低产量。为这种方法选择的人类1型遗传性酪氨酸血症 (ht-1) 的猪模型是唯一适合这种方法, 因为即使是一小部分矫正细胞的植入将导致肝脏的再繁殖与健康的细胞基于强大的相对于本土病肝细胞的选择性优势。虽然这种生长选择并不适用于所有适应症, 但这种方法是扩展到其他适应症的基础, 并允许操纵这种环境, 以解决肝脏内外的其他疾病, 同时控制接触病毒载体和机会的非目标毒性和致瘤性。

肝脏切除和自体移植在图 1中得到了示意图的表达。在5头接受肝切除术的有代表性的猪中, 大多数猪的产量为 gt;1 x10 9个肝细胞, 其生存能力约为 80% (表 2), 为包括基因在内的任何类型的理想操作提供了大量的细胞治疗。随后培养5头猪的未移植部分准备好的肝细胞表现出良好的生存能力和粘附力, 典型的肝细胞形态在转导和初始电?...

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Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

本方案旨在描述猪肝细胞分离和体外基因传递, 通过自体细胞移植治疗代谢疾病模型。虽然这种特殊的模式具有独特的优势, 有利于成功的治疗, 但应用是解决其他疾病和适应症的相关基础。

猪自体移植肝细胞外细胞外细胞基因治疗

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

前体内基因治疗和自体细胞移植治疗肝脏的出生代谢错误是治疗这些疾病的重要替代方案。并且允许我们不仅治疗这些疾病，但找出必要的生物量，以便能够达到治疗效果。这种方法还避免了免疫抑制的严重后果和其他后果与不同类型的治疗。在当前情况下，我们使用这种方法治疗遗传性酪氨酸血症类型1。然而，这个想法是，这将是一个平台方法，治疗许多不同的肝脏疾病，以最小的改变。能够可视化这种技术很重要，因为在可视化灌注效率方面存在一些变化，而灌注对于获得可行的肝细胞移植至关重要。罗伯特·凯撒和约瑟夫·利勒加德的外科手术。杜泽吉，布鲁斯·阿米奥特进行细胞隔离。UAU细胞纯化和细胞的外体转导是由凯特琳·范利思完成的。动物和 OR 的准备是由卡里艾伦和劳里希林完成的。要执行初始港口站点入口，请对一头麻醉、长达三个月的大型白色农场猪的脑毛病进行开放的哈森技术。将12毫米小车引入腹腔，腹腔可见。当小车就位时，通过进入口的5毫米30度范围，用二氧化碳进入腹部，使15毫米汞。在腹腔镜相机的直接可视化下，在肝脏的左边叶上放置2个5毫米的端口，进行三角测量。将拉波器放在一个新的端口中。在分离中叶和左横向的左叶主要裂缝点识别肝脏的左向段。并使用手术订书机固定血管结构和肝静脉沿这个裂缝。使用连续发射和 60、45 或 30 毫米长的血管载荷，通过此裂缝进行转行。切除完成后，评估残肝，以确保足够的血液，并使用内窥镜抓握器和内窥镜组织检索袋来检索肝脏部分。现在，卸下端口，对中线筋膜使用中断尺寸零缝合线。深皮层的运行 2-0 缝合线。和运行4-0缝合下切层，关闭12毫米端口切口在三个层。然后用2-0缝合线将五毫米端口合在一层。并在切口上放置无菌敷料。对于肝细胞分离，首先连接一个近体泵组，以提供分散溶液，保持在43摄氏度的水浴，导管放置在肝脏部分的大，暴露的血管。用灌注两个溶液对泵和管进行注水，最多一个停止旋塞位置，在灌注一和灌注两个溶液之间切换至组织。将止回旋塞切换到灌注一个位置。然后对管组的其余部分进行准备。完全填充内联气泡陷阱，以防止将气泡引入组织。接下来，做一个干净的横向切口，垂直于肝循环，以显示入口静脉分支的横截面和肝静脉的导管。并使用舒适的导管导管导管导管可用的暴露静脉。当导管就位时，以每分钟 100 毫米的流速用热灌注一个溶液对被切除的肝脏组织进行灌注。每 30 到 60 秒将出口管从静脉移动到静脉。并使用疏散管从组织托盘中取出多余的缓冲液。循环通过所有可用静脉 15 至 20 分钟后，在相同条件下切换到灌注两个溶液。使用回油泵将灌注两个溶液回收回储液罐，流速较慢，重新管理到组织中。每五分钟检查一次气泡陷阱的表面温度，或检查肝脏，以确认肝细胞没有变冷。当肝脏在灌注约30分钟后发白时，将组织转移到无菌容器中，用无菌的dap包裹，将容器放入细胞培养罩中，以保持肝细胞处理期间的不育性。肝细胞和细胞分离的胶原酶分离需要完全完成，这样您就不要得到细胞的块状，这降低了细胞的生存能力和转导频率。用肝细胞洗涤介质将肝脏淹没，并拖动剪刀穿过组织顶部，以破坏肝脏胶囊。戴上无菌手套，轻轻按摩肝脏，将肝细胞释放到介质中。并通过无菌纱布将组织上清液过滤成200毫升离心瓶。通过离心收集过滤的肝细胞。将细胞集中到150毫升新鲜肝细胞洗涤介质中，放入一个200毫升的瓶子中，进行2次额外的洗涤。并在第三次离心后计算细胞。然后，将细胞稀释至每毫升盐水浓度的1倍10至第九个肝细胞。对于分离的肝细胞的自动移植，使用2-5兆赫传感器通过超声波识别入口静脉，并引导一根5英寸，18规格的针头向主入口静脉，大约到其分叉。将细胞装入60毫升注射器，根据细胞总体积，将注射器附到针头上，注意不要冒泡。接下来，用输液导管缓慢按下注射器柱塞，通过输液导管手动注入多达1倍至第九肝细胞，以监测移植期间的毛孔压力。当所有细胞都已交付后，取出导管并监测入口静脉是否存在血栓事件和超声波前流。在经过肝切除术的五头猪中，大多数的肝细胞产量超过10至第九个肝细胞，其生存能力约为80%。为任何类型的所需操作（包括基因治疗）提供足够数量的细胞。这些准备的肝细胞的非移植部分的后续培养，在转导和初始电镀46小时后，表现出良好的生存能力和粘附性与典型的肝细胞形态。初始移植将因移植期间重新引入的细胞数量而异。这些具有代表性的活检显示了基因校正细胞扩张的时间表。独特的疾病，如遗传性酪氨酸血症1型，享受积极选择压力的健康细胞。这种扩展通常在移植后12个月完成。一旦移植的富马里亚切乙酸水解酶除壳动物在肝脏内纠正的肝细胞中实现了约20%的再种群，酪氨酸水平将与野生类动物相比正常化。与野生类动物相比，未经纠正的动物在碱性磷酸酶和阿斯巴酸转亚酶方面均表现出显著升高，但活体基因治疗使这些血清酶水平恢复正常。此外，一般肝脏代谢健康在未经治疗的淘汰猪中被破坏，如循环氨中的高程所示，这些高程在与经过治疗的肝细胞重新种群后得到纠正。重要的是要记住，使用这种技术，以处理和操作组织仔细和尽可能少。增加组织处理或操作，导致细胞活力降低，产量降低。这种方法也适用于有兴趣研究弓分布和图形低效标记技术的人，使用病毒转导协议以外的其他技术。不要忘记，使用病毒载体可能是危险的，因此在使用这些技术时，必须遵循适当的生物安全程序，以及佩戴个人防护设备。

Research

JoVE Journal

Medicine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

患者组织及基因传递考试前的体外培养

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

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