Name: lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine
Uploaded: 2018-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine at JoVE.com

Forfatterne takke Duane Meixner for ekspertise i udfører portåren injektion, Steve Krage, Joanne Pederson og Lori Hillin for støtte under de kirurgiske procedurer. Dette arbejde blev støttet af children's Hospital of Minnesota Foundation og regenerativ medicin Minnesota. R.D.H. var finansieret gennem en NIH K01 DK106056 award og en Mayo Clinic Center for regenerativ medicin karriere udvikling Award.

Alle dyr procedurer blev blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer og gennemgået og godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) før undersøgelse adfærd. Procedurer, der beskrives her blev udført på mandlige og kvindelige stor hvid gård svin (50% Landrace/50% store hvide genetiske baggrund) op til 3 måneder, der anses for sunde og egnet til kirurgi.  Dyr er socialt opstaldet medmindre uforenelig af institutionelle veterinærbehandlinger personale.  Dyrene fodres passen...

<ol>
	<li>Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+metabolism+and+expanded+newborn+screening:+review+and+update.">Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).</li><li>Hansen, K., Horslen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+liver+disease+in+children.">Metabolic liver disease in children.</a> Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).</li><li>Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+for+inborn+errors+of+metabolism:+advancing+towards+the+clinic.">Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic.</a> BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).</li><li>Brunetti-Pierri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+inborn+errors+of+liver+metabolism:+progress+towards+clinical+applications.">Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications.</a> Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).</li><li>Carlson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+TALEN-mediated+gene+knockout+in+livestock.">Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).</li><li>Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+enzymic+defects+in+hereditary+tyrosinemia.">On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+3-dimensional+imaging+of+liver+regeneration+in+a+mouse+model+of+hereditary+tyrosinemia+type+1+using+the+sodium+iodide+symporter+gene.">Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene.</a> Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curative+ex+vivo+liver-directed+gene+therapy+in+a+pig+model+of+hereditary+tyrosinemia+type+1.">Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1.</a> Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).</li><li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272 (5259), 263-267 (1996).</li><li>Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors:+from+virology+to+transgene+expression.">Viral vectors: from virology to transgene expression.</a> British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).</li><li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+basic+to+translational.">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li><li>Chowdhury, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+improvement+of+hypercholesterolemia+after+ex+vivo+gene+therapy+in+LDLR-deficient+rabbits.">Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits.</a> Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).</li><li>Elgilani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Phenotype+Characterization+of+a+Large-Animal+Model+of+Hereditary+Tyrosinemia+Type+1.">Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1.</a> The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).</li><li>Patyshakuliyeva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+utilization+and+metabolism+is+highly+differentiated+in+Agaricus+bisporus.">Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus.</a> BMC Genomics. 14, 663 (2013).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumarylacetoacetate+hydrolase+deficient+pigs+are+a+novel+large+animal+model+of+metabolic+liver+disease.">Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease.</a> Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).</li></ol>

Denne rapport beskriver en ex vivo autolog gen terapi tilgang for at helbrede en svin model af HT-1. Det indebærer en delvis hepatectomy, efterfulgt af ex vivo hepatocyt isolation og transduktion af isolerede hepatocytter med lenti virus regnskabsmæssige korrigerende transgenet. Korrigeret autolog hepatocytter er derefter transplanteres tilbage til FAH mangelfuld dyr gennem Vena8. Selv om metoden er gældende for alle store dyremodeller med nogle ændringer, har FAH-mangelfuld ...

Medfødt fejl i metabolisme i leveren er en familie af genetiske sygdomme, der tilsammen påvirker så mange som 1 i 800 levendefødte1. Mange af disse sygdomme er enkelt gen defekter2 og funktionelt kan helbredes ved at indføre en enkelt korrigeret kopi af de berørte gen i et tilstrækkeligt antal hepatocytter3. Den faktiske procentdel af hepatocytter, der rettes varierer afhængigt af sygdom4 og er i høj grad afhængig af arten af det protein det koder, for eksempel, udskilte proteiner versus cytoplasmatisk. I de fleste tilfælde, er effekten af en behandling for metabolisk sygdom let analyseres gennem tilstedeværelsen af biomarkører ofte tilgængelige i omløb.
HT-1 er en medfødt fejl i metabolisme i leveren, der skyldes en defekt i fumarylacetoacetate hydrolase (FAH)5, den sidste enzymatisk trin i tyrosin stofskifte6. FAH mangel fører til at bygge af toksiske metabolitter i leveren, der kan forårsage akut leversvigt og død eller i den kroniske form af sygdommen kan forårsage skrumpelever og hepatocellulært carcinom. Sygdommen ledes klinisk af administration af 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), et lille molekyle hæmmer af et enzym opstrøms af FAH i tyrosin stofskifte. Sygdommen giver et ideelt miljø til at teste gen terapi metoder, som vellykket korrektion af selv en lille antal hepatocytter vil i sidste ende resultere i genindsættelse af hele leveren med korrigerede celler i både små og store dyremodeller 7 , 8. dette sker fordi korrigeret celler har en dyb overlevelsesfordel over ukorrigeret celler på grund af ophobning af giftige metabolitter i sidstnævnte. Tabet af ukorrigeret hepatocytter giver mulighed for selektiv udvidelse af korrigeret hepatocytter konsekvent med den regenerative kapacitet af leveren. Behandling kan let følges ved at måle fald i cirkulerende tyrosin og succinylacetone niveauer efter transplantation.
For at retfærdiggøre den invasive art af den procedure, der omfatter en delvis hepatectomy, skal målet med denne fremgangsmåde være en varig helbredelse. Replikering inkompetente lentiviral vektorer bruges derfor, fordi de bliver stabilt integrere i hepatocyt genom9. at sikre levering af de korrigerede gen til alle datterceller som leveren vokser og udvides for at erstatte den hurtige tab af ukorrigeret celler. Dette er en fordel over adeno forbundet viral (AAV) vektorer, der primært findes som episomes, der kan kun overføres til en enkelt celle, datter under mitosen10 derved miste nogen effekt af behandling i løbet af få uger.
Selv om en voksende mængde af litteratur støtter sikkerheden for lentivirus11, bekymringer er genotoksiske begivenheder dæmpet ved at begrænse transduktion af værtsceller til en kontrolleret in vitro- miljø. Gratis vector er aldrig systemisk introduceret til værten, når denne metode udføres, begrænse de hepatocytter, der vil blive genindsat med autolog transplantation via portalen vene.
Denne rapport beskriver den metode i den kirurgiske og ex vivo procedurer bruges til at isolere hepatocytter for gen terapi ex vivo og efterfølgende autolog transplantation12 til behandling af HT-1 gris8. Den fulde proces omfatter 1) en delvis hepatectomy, der fungerer som en kilde til hepatocytter og en vækst stimulus for værtens leveren, 2) isolering af hepatocytter fra skåret leveren efterfulgt af ex vivo gen korrektion, og endelig 3) genindførelse af den korrigeret hepatocytter tilbage til værten. Den beskrevne metode er gældende for alle store dyremodeller med nogle ændringer, men kun FAH-mangelfuld gris13 vil have fordel af den selektive miljø for korrigeret hepatocytter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC)</td>
			<td style="width:139px;">Yecuris</td>
			<td style="width:127px;">20-0027</td>
			<td style="width:109px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B12STS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B5SHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 60</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA60AMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 45</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA45AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 30</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>SIG30AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo catch bag</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>173050G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0 PDS</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z340H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J459H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J426H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dermabond</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Sterile Dressing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Williams&#8217;-E Powder&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ME16060P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8875-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1679-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA (g/L)</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>45172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(N-A-C, g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2 2H2O (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D (mg/mL)</td>
			<td>Crescent Chemical</td>
			<td>17456.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexamethasone</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>NDC6337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine

Genterapi er et ideelt valg til at helbrede mange medfødt fejl i metabolisme i leveren. Ex-vivo, lentiviral vektorer har været anvendt med succes til behandling af mange hæmatopoietisk sygdomme hos mennesker, som deres brug tilbyder stabil transgen udtryk på grund af den vektor evne til at integrere i vært genom. Denne metode viser anvendelsen af ex vivo genterapi af hepatocytter til en stor dyremodel af arvelige tyrosinemia type jeg. Denne proces består af 1) isolering af primære hepatocytter fra autolog giver/modtager dyr, 2) ex vivo gen levering via hepatocyt transduktion med lentiviral vektor og 3) autolog transplantation af korrigeret hepatocytter via portalen vene injektion. Succes af metoden generelt er afhængig af effektiv og sterile fjernelse af den lever resektion, omhyggelig håndtering af skåret modellen til isolation af levedygtige hepatocytter tilstrækkeligt til re engrafting, high-procentdel transduktion af isolerede celler, og aseptisk kirurgiske procedurer i hele til at forhindre infektion. Tekniske fejl i nogen af disse trin vil resultere i lavt udbytte af levedygtige transduced hepatocytter til autolog transplantation eller infektion af donor/recipient dyret. Gris model af menneskelige type 1 arvelige tyrosinemia (HT-1) valgt for denne tilgang er entydigt imødekommenhed over for sådan en metode, som selv en lille procentdel af engraftment korrigeret celler vil føre til genindsættelse af leveren med raske celler baseret på en kraftfuld selektiv fordel over oprindelige-syge hepatocytter. Selv om denne vækst udvalg ikke vil være sandt for alle indikationer, denne fremgangsmåde er et fundament for udvidelse til andre indikationer og giver mulighed for manipulation af dette miljø til at løse flere sygdomme, både inden for leveren og ud, mens kontrollere for eksponering for viral vektor og mulighed for off-target toksicitet og tumorigenisitetsforsøg.

Leveren resektion og autolog transplantation er repræsenteret skematisk i figur 1. I en repræsentativ kohorte af 5 svin, der undergik hepatisk resektion, de fleste havde udbytte af > 1 x 109 hepatocytter med cirka 80% levedygtighed (tabel 2), giver masser af celler for enhver type af ønskede manipulationer, herunder gen terapi. Efterfølgende kultur af den ikke-transplanteret del af rede hepatocytter fra hver af de 5 svin viste ...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine at JoVE.com

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Denne protokol er beregnet til at beskrive svin hepatocyt isolation og ex vivo gen levering for at helbrede modeller af metaboliske sygdomme via autologe celler transplantation. Selv om netop denne model har unikke fordele, der favoriserer succesfulde terapi, er ansøgningen en relevant foundation til at løse flere sygdomme og indikationer.

Lentiviral vektor-medieret genterapi af hepatocytter Ex Vivo til autolog Transplantation hos svin

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

Ex vivo genterapi og autolog celletransplantation til behandling af medfødte stofskiftefejl i leveren er et vigtigt alternativ til behandlingen for disse lidelser. Og giver os mulighed for ikke kun at behandle disse lidelser, men finde ud af den biomasse, der er nødvendig for at kunne opnå et terapeutisk resultat. Denne tilgang undgår også de betydelige konsekvenser af immunsuppression og andre konsekvenser med forskellige typer af behandlinger.I den nuværende sammenhæng bruger vi denne tilgang til behandling af arvelig tyrosinæmi type 1. Men ideen er, at dette vil være en platform tilgang til behandling af en lang række forskellige leversygdomme med minimal ændring. Det er vigtigt at være i stand til at visualisere denne teknik, fordi der er nogle variation, når det kommer til at visualisere effektiviteten af perfusion, som er afgørende for at få levedygtige hepatocytter til transplantation.Kirurgisk indgreb udført af Robert Kaiser og Joseph Lillegard. Celleisolering udført af Zeji Du, Bruce Amiot. UAU cellerensning og ex vivo transduktion af cellerne blev udført af Caitlin VanLith.Forberedelse af dyrene og OR prep blev udført af Kari Allen og Laurie Hillin. For at udføre den oprindelige havnested indrejse, udføre en åben Hasson teknik cephalad til umbilicus af en bedøvet, op til tre måneder gamle, store, hvide gård gris. Indførelse af en 12 millimeter trokar i bughulen, hvor bughinden er synlig.Når trokaren er på plads, passere en 5 millimeter 30 graders rækkevidde gennem indgangsporten og insufflate maven med kuldioxid til 15 millimeter kviksølv. Under direkte visualisering med det laparoskopiske kamera skal du placere yderligere 2 5 millimeter porte, triangulere på leverens venstre sidelap. Og placer laparoscope i en af de nye havne.Identificer den venstre laterale segment af leveren på det punkt af de store revne i venstre lap, der adskiller den mediale og venstre laterale segmenter. Og bruge en kirurgisk hæftemaskine til at sikre de vaskulære strukturer og den hepatiske vene langs denne revne. Transect parenkym gennem denne revne ved hjælp af sekventielle fyringer og 60, 45 eller 30 millimeter lange vaskulære belastninger.Når resektionen er færdig, skal du vurdere restlevernen for at sikre en passende hæmostase og bruge endoskopiske gribere og en endoskopisk vævshentningspose for at hente leversektionen. Fjern nu portene, og brug en afbrudt størrelse nulsutur til midterlinjen fascia. En kørende 2-0 sutur til det dybe dermale lag.Og en kørende 4-0 sutur for det subkutære lag, for at lukke 12 millimeter port snit i de tre lag. Luk derefter de fem millimeter porte i et lag med 2-0 suturer. Og læg en steril dressing på snittene.For hepatocyte isolation, først forbinde en peristaltisk pumpe indstillet til at levere dispersion løsninger, opretholdes i en 43 grader Celsius vandbad, til katetre, der skal placeres i de store, udsatte fartøjer i leveren sektion. Prime pumpen og slanger med perfusion to opløsning, op til et stop cock position til at skifte mellem perfusion en og perfusion to opløsning levering til vævet. Og skifte stop hanen til perfusion en position.Derefter prime resten af slangen sæt. Helt fylde en inline boble fælde for at forhindre indførelse af luftbobler i vævet. Dernæst lave en ren tværgående snit, vinkelret på den hepatiske cirkulation til at afsløre tværsnit af portalen vene grene og hepatiske vener til kateterisation.Og brug et tætsiddende kateter til at kateterisere de tilgængelige, udsatte vener. Når katetrene er på plads, gennemgå den resected levervæv med varm perfusion en opløsning på en 100 millimeter per minut strømningshastighed. Flytning af udløbsrøret fra vene til vene hver 30 til 60 sekunder.Og ved hjælp af en evakuering rør til at fjerne overskydende buffer fra vævsbakken. Efter cykling gennem alle de tilgængelige vener i 15 til 20 minutter, skifte til perfusion to opløsning under de samme betingelser. Ved hjælp af en returpumpe til at genbruge perfusion to opløsning tilbage til reservoiret, ved en langsommere strømningshastighed, for re-administration i vævet.Kontroller overfladetemperaturen af boblen fælde og, eller leveren omkring hvert femte minut for at bekræfte, at hepatocytter ikke bliver koldt. Når leveren blancherer efter ca 30 minutters perfusion, overføre vævet til en steril beholder, pakket med en steril drapering, og placere beholderen i en celle kultur hætte til at opretholde sterilitet under hepatocyte behandling. Den kollagenase isolering af hepatocytter og celle frakobling skal gøres helt, så du ikke får sammenklumpning af cellerne, som nedsætter levedygtigheden af cellerne og transduktion frekvens.Nedsænk leveren med hepatocyt vask medium og træk saks over toppen af vævet til at forstyrre leveren kapsel. Iført sterile handsker, forsigtigt massere leveren til at frigive hepatocytes i mediet. Og filtrer væv supernatant, gennem sterile gaze, i 200 milliliter centrifuge flasker.De filtrerede hepatocytter indsamles ved centrifugering. Samling af cellerne i 150 milliliter frisk hepatocyt vask medium i en enkelt 200 milliliter flaske til 2 ekstra vasker. Og tælle cellerne efter den tredje centrifugering.Derefter fortyndes cellerne til 1 gange 10 til den niende hepatocytter pr. milliliter saltvandskoncentration. For autotransplantation af de isolerede hepatocytter, bruge en to-fem megahertz transducer til at identificere portalen vene via ultralyd og direkte en fem-tommer, 18-gauge nål mod de vigtigste portal vene, tilnærmelsesvis til det bifurcation. Læg cellerne i en 60 milliliter sprøjte, i henhold til det samlede cellevolumen og fastgør sprøjten til nålen, idet pas på ikke at indføre bobler.Dernæst langsomt trykke sprøjten stemplet til manuelt at indgyde op til 1 gange 10 til niende hepatocytter gennem portalen vene ved hjælp af en infusion kateter til at overvåge poraltrykket under transplantationen. Når alle cellerne er leveret, skal du fjerne kateteret og overvåge portalvenen for tilstedeværelsen af trombotiske hændelser og fremstrømning ved ultralyd. I en repræsentativ kohorte af fem svin, der gennemgik leverresektion, havde de fleste udbytter på over 10 til niende hepatocytter med ca. 80 % levedygtighed.Giver et tilstrækkeligt antal celler til enhver form for ønsket manipulation, herunder genterapi. Efterfølgende kultur af den ikke-transplanterede del af disse forberedte hepatocytter, viste en god levedygtighed og vedhæftning med en typisk hepatocyt morfologi 46 timer efter deres transduktion og indledende plating. En indledende engraftment vil variere afhængigt af antallet af celler, der genindføres under transplantationen.Disse repræsentative biopsier demonstrerer en tidslinje over genkorrigeret celleudvidelse. Unik for sygdomme, såsom arvelig tyrosinæmi type 1, der nyder et positivt udvalgt tryk for raske celler. Denne udvidelse er typisk komplet 12 måneder efter transplantation.Når en transplanteret fumarylacetoacetate hydrolase knockout dyr har opnået omkring 20% re-population af de korrigerede hepatocytter i leveren, vil tyrosin niveauer normalisere i forhold til vilde-type dyr. Mens ukorrigerede dyr udviser en signifikant stigning i både alkalisk fosfatase og aspartattransaminase sammenlignet med vilde dyr, returnerer ex vivo-genterapi disse serumenzymer til normal. Endvidere forstyrres den generelle metaboliske leversundhed hos ubehandlede knockout-svin, som det fremgår af stigninger i den cirkulerende ammoniak, der korrigeres efter re-population med de behandlede hepatocytter.Det er vigtigt at huske med at bruge denne teknik til at håndtere og manipulere vævet omhyggeligt og så lidt som muligt. Øget håndtering eller manipulation af vævet, fører til at mindske cellernes levedygtighed og mindske udbyttet. Denne fremgangsmåde kan også anvendes for personer, der er interesseret i at studere buefordeling og grafineffektivitet i mærkningsteknikker, ved hjælp af andre teknikker uden for virale transduktionsprotokoller.Glem ikke, at arbejde med virale vektorer kan være farligt, så efter korrekt bio sikkerhedsprocedurer, samt iført personlige værnemidler er nødvendig, når du bruger disse teknikker.

Research

JoVE Journal

Medicine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Produktion og Påvisning af Reactive Oxygen Species (ROS) i kræft

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Neo-Islet formationen i leveren af ​​diabetiske mus med Hjælper-afhængig adenovirusvektor-medieret genoverførsel

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Matrix-assisted Autologous Chondrocyte Transplantation for Remodeling and Repair of Chondral Defects in a Rabbit Model

Matrix-assisteret Autolog Chondrocyt transplantation for Remodeling og reparation af chondral Mangler i en kanin model

Articular cartilage defects are considered a major health problem because articular cartilage has a limited capacity for self-regeneration 1. Untreated ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normotermisk<em&gt; Ex vivo</em&gt; Nyre Perfusion for Bevarelse af Nyre grafts før Transplantation

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...