Name: lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine
Uploaded: 2018-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine at JoVE.com

De auteurs bedanken Duane Meixner voor expertise in het uitvoeren van de portal-veneuze injectie, Steve Krage Joanne Pederson en Lori Hillin voor ondersteuning tijdens de chirurgische procedures. Dit werk werd gesteund door het Children's Hospital of Minnesota Foundation en regeneratieve geneeskunde Minnesota. R.D.H. werd gefinancierd door middel van een NIH K01 DK106056 award en een Mayo kliniek centrum voor regeneratieve geneeskunde Career Development Award.

Alle dierlijke procedures werden werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van de institutionele en herzien en goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) voorafgaand aan de studie gedrag. Hier beschreven procedures werden uitgevoerd op mannelijke en vrouwelijke grote witte boerderij varkens (50% Landrace/50% Large Wit genetische achtergrond) omhoog, tot 3 maanden oud die gezond en geschikt voor chirurgie worden geacht.  Dieren zijn sociaal gehuisvest tenzij beschouwd als onverenigba...

<ol>
	<li>Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+metabolism+and+expanded+newborn+screening:+review+and+update.">Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).</li><li>Hansen, K., Horslen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+liver+disease+in+children.">Metabolic liver disease in children.</a> Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).</li><li>Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+for+inborn+errors+of+metabolism:+advancing+towards+the+clinic.">Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic.</a> BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).</li><li>Brunetti-Pierri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+inborn+errors+of+liver+metabolism:+progress+towards+clinical+applications.">Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications.</a> Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).</li><li>Carlson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+TALEN-mediated+gene+knockout+in+livestock.">Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).</li><li>Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+enzymic+defects+in+hereditary+tyrosinemia.">On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+3-dimensional+imaging+of+liver+regeneration+in+a+mouse+model+of+hereditary+tyrosinemia+type+1+using+the+sodium+iodide+symporter+gene.">Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene.</a> Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curative+ex+vivo+liver-directed+gene+therapy+in+a+pig+model+of+hereditary+tyrosinemia+type+1.">Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1.</a> Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).</li><li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272 (5259), 263-267 (1996).</li><li>Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors:+from+virology+to+transgene+expression.">Viral vectors: from virology to transgene expression.</a> British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).</li><li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+basic+to+translational.">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li><li>Chowdhury, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+improvement+of+hypercholesterolemia+after+ex+vivo+gene+therapy+in+LDLR-deficient+rabbits.">Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits.</a> Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).</li><li>Elgilani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Phenotype+Characterization+of+a+Large-Animal+Model+of+Hereditary+Tyrosinemia+Type+1.">Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1.</a> The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).</li><li>Patyshakuliyeva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+utilization+and+metabolism+is+highly+differentiated+in+Agaricus+bisporus.">Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus.</a> BMC Genomics. 14, 663 (2013).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumarylacetoacetate+hydrolase+deficient+pigs+are+a+novel+large+animal+model+of+metabolic+liver+disease.">Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease.</a> Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).</li></ol>

Dit verslag beschrijft een ex vivo autologe gene therapie aanpak om te genezen van een varkens model voor HT-1. Het gaat om een gedeeltelijke hepatectomy, gevolgd door ex vivo hepatocyte isolatie en transductie van geïsoleerde hepatocyten met lenti virus uitvoering van de corrigerende transgenic. Gecorrigeerde autologe hepatocyten worden vervolgens terug naar het dier FAH tekort via de portal vein8getransplanteerd. Hoewel de beschreven methode is van toepassing op alle grote die...

Aangeboren fouten van de stofwisseling van de lever is een familie van genetische ziekten die collectief maar liefst 1 in 800 levendgeborenen1 beïnvloeden. Veel van deze ziekten zijn enkel gen gebreken2 en functioneel kunnen worden genezen door de invoering van een enkele gecorrigeerde kopie van het betrokken gen in een voldoende aantal hepatocyten3. Het werkelijke percentage van hepatocyten die moeten worden gecorrigeerd door de ziekte4 varieert en is grotendeels afhankelijk van de aard van het eiwit het codeert, bijvoorbeeld, uitgescheiden eiwitten versus cytoplasmatische. In de meeste gevallen is de werkzaamheid van een behandeling van metabole ziekte gemakkelijk vehiculumcontrolegroep door de aanwezigheid van biomarkers vaak beschikbaar in de omloop.
HT-1 is een aangeboren afwijking van de stofwisseling van de lever die uit een defect in fumarylacetoacetate hydrolase (FAH)5, de laatste enzymatische stap in tyrosine metabolisme6 voortvloeit. FAH-deficiëntie leidt tot de ophoping van giftige metabolieten in de lever die kan leiden tot acute insufficiëntie van de lever en dood of in de chronische vorm van de ziekte kan leiden tot levercirrose en hepatocellulaire carcinoom. De ziekte is klinisch beheerd door toediening van 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), een klein molecuul remmers van het enzym stroomopwaarts van FAH in het metabolisme van tyrosine. De ziekte biedt een ideale omgeving waarin aan gene therapie testmethoden, zoals succesvolle correctie van zelfs een klein aantal hepatocyten uiteindelijk in de herbevolking van de gehele lever met gecorrigeerde cellen in zowel de grote als de kleine dierlijke modellen resulteren zal 7 , 8. Dit komt doordat gecorrigeerd cellen hebben een diepe overleven voordeel ten opzichte van niet-gecorrigeerde cellen als gevolg van de accumulatie van toxische metabolieten in de laatste. Het verlies van niet-gecorrigeerde hepatocyten zorgt voor selectieve uitbreiding van gecorrigeerde hepatocyten consistent met het regeneratief vermogen van de lever. Behandeling kan gemakkelijk worden gevolgd door het meten van de afname van de circulerende tyrosine en succinylacetone niveaus na transplantatie.
Ter rechtvaardiging van het invasieve karakter van de procedure, waaronder een gedeeltelijke hepatectomy, moet het doel van deze aanpak een duurzaam genezen. Daarom, replicatie incompetente lentivirale vectoren worden gebruikt omdat zij stabiel in de hepatocyte genoom9zal integreren. waarborgen van de levering van de gecorrigeerde gen aan alle dochtercellen als de lever groeit en breidt ter vervanging van het snelle verlies van niet-gecorrigeerde cellen. Dit is gunstig over adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren, die voornamelijk bestaan als episomes die alleen kunnen worden doorgegeven aan een eencellige dochter tijdens de mitose10 waarbij u verliest geen effect van de therapie in een kwestie van weken.
Hoewel een groeiend lichaam van literatuur ondersteunt de veiligheidvan lentivirus11, zorgen zijn genotoxisch gebeurtenissen verzacht door de signaaltransductie van cellen van de gastheer voor een gecontroleerde in vitro milieu te beperken. Gratis vector wordt nooit systemisch geïntroduceerd op de host wanneer deze methode wordt uitgevoerd, beperking van de blootstelling aan de hepatocyten die weer opgenomen met autologe transplantatie via de portal ader worden zal.
Dit verslag beschrijft de methode van de chirurgische en ex vivo procedures gebruikt om hepatocyten voor gene therapie ex vivo en latere autologe transplantatie12 voor de behandeling van de HT-1 varken8te isoleren. Het volledige proces omvat 1) een gedeeltelijke hepatectomy dat als een bron van hepatocyten en een stimulans van de groei voor de host de lever, 2) isolatie van hepatocyten uit de verwijderde lever gevolgd door ex vivo gene correctie, en tenslotte 3) herinvoering van fungeert de gecorrigeerde hepatocyten terug naar de host. De beschreven methode is van toepassing op alle grote dierlijke modellen met enige aanpassing, maar alleen de FAH-deficiënte varken13 zal hebben het voordeel van de selectieve omgeving voor gecorrigeerde hepatocyten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC)</td>
			<td style="width:139px;">Yecuris</td>
			<td style="width:127px;">20-0027</td>
			<td style="width:109px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B12STS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B5SHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 60</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA60AMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 45</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA45AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 30</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>SIG30AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo catch bag</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>173050G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0 PDS</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z340H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J459H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J426H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dermabond</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Sterile Dressing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Williams&#8217;-E Powder&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ME16060P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8875-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1679-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA (g/L)</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>45172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(N-A-C, g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2 2H2O (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D (mg/mL)</td>
			<td>Crescent Chemical</td>
			<td>17456.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexamethasone</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>NDC6337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine

Gentherapie is een ideale keuze om te genezen van vele aangeboren fouten van de stofwisseling van de lever. Ex-vivo, lentivirale vectoren hebben met succes gebruikt in de behandeling van vele hematopoietische ziekten bij de mens, als hun gebruik biedt stabiele transgenic expressie als gevolg van de vector vermogen om te integreren in het genoom van de gastheer. Deze methode blijkt de toepassing van ex vivo gentherapie van hepatocyten op een grote diermodel van erfelijke tyrosinemia type ik. Dit proces bestaat uit 1) isolatie van primaire hepatocyten van het autologe donor/ontvanger dier, 2) ex vivo gene levering via hepatocyte transductie met een lentivirale vector, en 3) autologe transplantatie van gecorrigeerde hepatocyten via portaal veneuze injectie. Succes van de methode is in het algemeen afhankelijk van efficiënte en steriele verwijdering van de lever resectie, zorgvuldige behandeling van het verwijderde exemplaar voor isolatie van levensvatbare hepatocyten voldoende voor opnieuw enten, hoge-percentage transductie van de geïsoleerde cellen, en aseptische chirurgische procedures hele om infectie te voorkomen. Technische storing op elk van deze stappen resulteert in lage rendement van levensvatbare getransduceerde hepatocyten voor autologe transplantatie of infectie van het dier donor/ontvanger. Het varken model van menselijke type 1 erfelijke tyrosinemia (HT-1) gekozen voor deze aanpak is uniek vatbaar voor dergelijke methode, aangezien zelfs een klein percentage van de engraftment van de gecorrigeerde cellen tot herbevolking van de lever met gezonde cellen op basis van een krachtige leiden zullen selectief voordeel ten opzichte van native-zieke hepatocyten. Hoewel de selectie van deze groei niet voor alle indicaties gelden zal, deze benadering is een Stichting voor uitbreiding naar andere indicaties en zorgt voor manipulatie van deze omgeving te pakken van bijkomende ziekten, zowel binnen de lever en daarbuiten, terwijl controle voor blootstelling aan virale vector en de mogelijkheid voor off-target toxiciteit en tumorigeniciteit.

De lever resectie en autologe transplantatie worden schematisch weergegeven in Figuur 1. In een representatieve cohort van 5 varkens die hepatische resectie onderging, had de meeste opbrengsten van > 1 x 109 hepatocyten met ongeveer 80% levensvatbaarheid (tabel 2), bieden tal van cellen voor elk type gewenst manipulaties, met inbegrip van gene therapie. Latere cultuur van het niet-getransplanteerde gedeelte van bereid hepatocyten u...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine at JoVE.com

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Dit protocol is bedoeld voor het beschrijven van varkens hepatocyte isolatie en ex vivo gene levering om te genezen van modellen van metabole ziekten via cel autologe transplantatie. Hoewel dit model geniet van unieke voordelen die succesvolle therapie gunst, is de toepassing een relevante Stichting bijkomende ziekten en aanduidingen aan te pakken.

Lentivirale Vector-gemedieerde gentherapie van hepatocyten Ex Vivo voor autologe transplantatie in varkens

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

Ex vivo gentherapie en autologe celtransplantatie voor de behandeling van aangeboren stofwisselingsfouten in de lever is een belangrijk alternatief voor de therapie voor deze aandoeningen. En stelt ons in staat om niet alleen deze aandoeningen te behandelen, maar de biomassa te berekenen die nodig is om een therapeutisch resultaat te bereiken. Deze aanpak vermijdt ook de significante gevolgen van immunosuppressie en andere gevolgen met verschillende soorten therapieën.In de huidige context gebruiken we deze benadering om erfelijke tyrosinemie type 1 te behandelen. Echter, het idee is dat dit een platform aanpak voor de behandeling van een veelheid van verschillende leverziekten met minimale verandering. Het is belangrijk om deze techniek te kunnen visualiseren, omdat er enige variabiliteit is als het gaat om het visualiseren van de efficiëntie van de perfusie, wat essentieel is om levensvatbare hepatocyten te krijgen voor de transplantatie.Chirurgische ingreep uitgevoerd door Robert Kaiser en Joseph Lillegard. Celisolatie uitgevoerd door Zeji Du, Bruce Amiot. UAU celzuivering en ex vivo transductie van de cellen werd gedaan door Caitlin VanLith.De voorbereiding van de dieren en de OK prep werd gedaan door Kari Allen en Laurie Hillin. Om de eerste havensite-ingang uit te voeren, voert u een open Hasson-techniek uit naar de umbilicus van een verdoofd, tot drie maanden oud, groot, wit boerderijvarken. Introductie van een 12 millimeter trocar in de buikholte, waar het buikvlies zichtbaar is.Wanneer de trocar op zijn plaats is, passeer een 5 millimeter 30 graden bereik door de toegangspoort en insufflaat de buik met kooldioxide tot 15 millimeter kwik. Plaats onder directe visualisatie met de laparoscopische camera 2 extra 5 millimeter poorten, triangulating op de linker zijkwab van de lever. En plaats de laparoscoop in een van de nieuwe poorten.Identificeer het linker zijwaartse segment van de lever op het punt van de grote spleet van de linkerkwab die de mediale en linkse laterale segmenten scheidt. En gebruik een chirurgische nietmachine om de vasculaire structuren en de leverader langs deze spleet te beveiligen. Transect de parenchyma door deze spleet met behulp van sequentiële vuren en 60, 45, of 30 millimeter lange vasculaire ladingen.Wanneer de resectie is voltooid, beoordeel de restlever om een adequate hemostase te garanderen en gebruik endoscopische grijpers en een endoscopische zak voor het ophalen van weefsel om de leversectie op te halen. Nu, verwijder de poorten en gebruik een onderbroken grootte nul hechting voor de midline fascia. Een lopende 2-0 hechting voor de diepe huidlaag.En een lopende 4-0 hechting voor de subcuticulaire laag, om de 12 millimeter poort incisie in de drie lagen te sluiten. Sluit vervolgens de vijf millimeter poorten in één laag met 2-0 hechtingen. En plaats een steriele dressing op de incisies.Voor hepatocyte isolatie, sluit eerst een peristaltische pomp ingesteld om de dispersie oplossingen, onderhouden in een 43 graden Celsius waterbad, te leveren aan de katheters worden geplaatst in de grote, blootgestelde vaten van de lever sectie. Prime de pomp en slang met de perfusie twee oplossing, tot een stop haan positie om te schakelen tussen de perfusie een en perfusie twee oplossing levering aan het weefsel. En schakel de stophaan naar de perfusie een positie.Dan prime de rest van de slang set. Het volledig vullen van een inline bubble trap om te voorkomen dat de invoering van luchtbellen in het weefsel. Maak vervolgens een schone dwarse incisie, loodrecht op de levercirculatie om dwarsdoorsnedes van de poortadertakken en de leveraderen voor katheterisatie te onthullen.En gebruik een nauwsluitende katheter om de beschikbare, blootgestelde aderen te katheteriseren. Wanneer de katheters op hun plaats zijn, doorsnijd het resected leverweefsel met warme perfusie een oplossing op een 100 millimeter per minuut stroomsnelheid. Het verplaatsen van de uitlaatbuis van ader naar ader om de 30 tot 60 seconden.En met behulp van een evacuatie buis om overtollige buffer te verwijderen uit het weefsel lade. Nadat u gedurende 15 tot 20 minuten door alle beschikbare aderen hebt gefietst, schakelt u onder dezelfde omstandigheden over op perfusie twee oplossing. Met behulp van een retourpomp om de perfusie twee oplossing terug te recyclen naar het reservoir, met een tragere stroomsnelheid, voor re-toediening in het weefsel.Controleer de oppervlaktetemperatuur van de bellenval en, of de lever ongeveer om de vijf minuten om te bevestigen dat de hepatocyten niet koud worden. Wanneer de lever blancheert na ongeveer 30 minuten perfusie, breng het weefsel naar een steriele container, verpakt met een steriele drap, en plaats de container in een cel cultuur kap om steriliteit te behouden tijdens de hepatocyte verwerking. De collagenase isolatie van de hepatocyten en celdisassociatie moet volledig worden gedaan, zodat je niet klonteren van de cellen die de levensvatbaarheid van de cellen en de transductiefrequentie vermindert.Dompel de lever onder met hepatocyte wasmedium en sleep een schaar over de bovenkant van het weefsel om de levercapsule te verstoren. Het dragen van steriele handschoenen, zachtjes masseren de lever om de hepatocyten vrij te geven in het medium. En filter het weefsel supernatant, door steriel gaas, in 200 milliliter centrifuge flessen.Verzamel de gefilterde hepatocyten door centrifugatie. Het bundelen van de cellen in 150 milliliter verse hepatocyte wasmiddel in een enkele 200 milliliter fles voor 2 extra wasbeurten. En het tellen van de cellen na de derde centrifugatie.Verdun vervolgens de cellen tot 1 keer 10 tot de negende hepatocyten per milliliter zoutconcentratie. Voor autotransplantatie van de geïsoleerde hepatocyten, gebruik maken van een twee-vijf megahertz transducer om het portaal ader te identificeren via echografie en direct een vijf-inch, 18-gauge naald in de richting van de belangrijkste poortader, ongeveer van het bifurcatie. Laad de cellen in een spuit van 60 milliliter, volgens het totale celvolume en bevestig de spuit aan de naald, waarbij u ervoor zorgt dat er geen bellen worden geïntroduceerd.Druk vervolgens langzaam de spuitzuiger in om tot 1 keer 10 tot 10 tot de negende hepatocyten door de poortader te brengen met behulp van een infuuskatheter om de porale druk tijdens de transplantatie te controleren. Wanneer alle cellen zijn geleverd, verwijder de katheter en controleer de poortader op de aanwezigheid van trombotische gebeurtenissen en vooruit stroom door echografie. In een representatief cohort van vijf varkens, dat hepatische resectie onderging, hadden de meesten opbrengsten van meer dan 10 tot de negende hepatocyten met ongeveer 80%-levensvatbaarheid.Het verstrekken van een voldoende aantal cellen voor elk type van gewenste manipulatie, met inbegrip van gentherapie. De verdere cultuur van het niet-getransplanteerde gedeelte van deze voorbereide hepatocyten, toonde een goede levensvatbaarheid en adhesie met een typische hepatocyte morfologie 46 uren na hun transductie en aanvankelijke beplating aan. Een eerste engraftment zal variëren door het aantal cellen dat opnieuw werd geïntroduceerd tijdens de transplantatie.Deze representatieve biopten tonen een tijdlijn van gengecorrigeerde celexpansie. Uniek voor ziekten, zoals erfelijke tyrosinemie type 1, die genieten van een positieve geselecteerde druk voor gezonde cellen. Deze uitbreiding is meestal voltooid 12 maanden na transplantatie.Zodra een getransplanteerd fumarylacetoacetate hydrolase knock-out dier heeft bereikt ongeveer 20% re-populatie van de gecorrigeerde hepatocyten in de lever, de tyrosine niveaus zal normaliseren in vergelijking met wilde dieren. Terwijl ongecorrigeerde dieren een aanzienlijke verhoging vertonen in zowel alkalisch fosfatase als aspartaattransaminase in vergelijking met wilde dieren, brengt ex vivo gentherapie deze serumenzymen weer normaal. Verder wordt de algemene lever metabolische gezondheid verstoord bij onbehandelde knock-outvarkens, zoals aangegeven door verhogingen in de circulerende ammoniak die worden gecorrigeerd na re-populatie met de behandelde hepatocyten.Het is belangrijk om te onthouden met het gebruik van deze techniek om het weefsel zorgvuldig en zo weinig mogelijk te manipuleren. Verhoogde behandeling of manipulatie van het weefsel, leidt tot een afname van de levensvatbaarheid van de cellen en daling van de opbrengst. Deze aanpak kan ook van toepassing zijn op mensen die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van boogdistributie en grafiekinefficiënties in etiketteringstechnieken, waarbij andere technieken worden gebruikt buiten virale transductieprotocollen.Vergeet niet dat het werken met virale vectoren gevaarlijk kan zijn, dus na de juiste bio veiligheid procedures, evenals het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen is noodzakelijk bij het gebruik van deze technieken.

Research

JoVE Journal

Medicine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Cultuur van de patiënt Tissue &amp; Onderzoek van Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In vivo Canine spierfunctie Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Oprichting en Voortplanting van Human Retinoblastoom Tumoren in het immuunsysteem van deficiënte muizen

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Productie en detectie van reactive oxygen species (ROS) in kanker

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

A Novel chirurgische benadering voor intratracheale toediening van bioactieve stoffen in een Foetale Muis Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Neo-Islet Vorming in de lever van muizen met diabetes door Helper-afhankelijke adenovirale vector-gemedieerde genoverdracht

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Matrix-assisted Autologous Chondrocyte Transplantation for Remodeling and Repair of Chondral Defects in a Rabbit Model

Matrix-bijgestaan ​​autologe chondrocyten transplantatie voor Renovatie en de reparatie van chondrale Gebreken in een konijn model

Articular cartilage defects are considered a major health problem because articular cartilage has a limited capacity for self-regeneration 1. Untreated ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normotherme<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Nier Perfusie voor het Behoud van de Nier transplantaten voorafgaand aan de transplantatie

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...