Name: lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine
Uploaded: 2018-11-04T13:00:00
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Les auteurs remercient Duane Meixner pour expertise dans l’exécution de l’injection de la veine porte, Steve Krage, Joanne Pederson et Lori Hillin soutien pendant les interventions chirurgicales. Ce travail a été soutenu par la Fondation de l’hôpital du Minnesota et la médecine régénérative Minnesota enfants. R.D.H. a été financé par un prix de NIH K01 DK106056 et un centre de clinique de Mayo pour la médecine régénérative Career Development Award.

Toutes les procédures d’animaux ont été effectuées conformément aux lignes directrices et ont été revus et approuvés par le Comité de l’emploi (IACUC) et d’institutionnels animalier avant étude conduite. Procédures décrites ici ont été réalisées sur des porcs mâles et femelles grande ferme blanche (bagage génétique de Piéride du chou Landrace/50% 50 %) vers le haut à 3 mois d’âge qui sont réputées être sain et adapté à la chirurgie.  Animaux est logés socialement moins considérés co...

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	<li>Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+metabolism+and+expanded+newborn+screening:+review+and+update.">Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).</li><li>Hansen, K., Horslen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+liver+disease+in+children.">Metabolic liver disease in children.</a> Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).</li><li>Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumarylacetoacetate+hydrolase+deficient+pigs+are+a+novel+large+animal+model+of+metabolic+liver+disease.">Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease.</a> Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).</li></ol>

Le présent rapport décrit une approche ex vivo gène autologue thérapie pour guérir un modèle porcin de HT-1. Il s’agit d’une hépatectomie partielle, suivie par ex vivo d’isolement de l’hépatocyte et transduction d’hépatocytes isolés avec lenti virus transportant le transgène correctif. Corrigée des hépatocytes autologues sont alors transplantés vers l’animal déficient FAH par l’intermédiaire de la veine porte8. Bien que la méthode décrite est appli...

Erreurs innées du métabolisme du foie sont une famille de maladies génétiques affectant collectivement autant que 1 dans 800 naissances vivantes1. Nombre de ces maladies sont monogéniques défauts2 et peuvent être fonctionnellement guéries en introduisant une seule copie corrigée du gène affecté dans un nombre suffisant d’hépatocytes3. Le pourcentage réel d’hépatocytes qui doit être corrigée varie selon la maladie4 et est largement tributaire de la nature de la protéine qu'il encode, par exemple, les protéines sécrétoires versus cytoplasmique. Dans la plupart des cas, l’efficacité d’un traitement pour une maladie métabolique est facilement dosée par la présence de biomarqueurs souvent disponibles dans la circulation.
HT-1 est une erreur innée du métabolisme du foie qui résulte d’un défaut de fumarylacetoacetate hydrolase (FAH)5, la dernière étape enzymatique dans le métabolisme de la tyrosine6. Carence en FAH mène à l’accumulation de métabolites toxiques dans le foie qui peut causer la mort et insuffisance hépatique aiguë ou dans la forme chronique de la maladie peut provoquer une cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Cliniquement, la maladie est gérée par l’administration de 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), un inhibiteur d’une enzyme en amont de FAH dans le métabolisme de la tyrosine de petite molécule. La maladie fournit un environnement idéal permettant de tester les méthodes de thérapie génétique, comme correction réussie de même un petit nombre des hépatocytes entraînera finalement le repeuplement du foie entier avec cellules corrigées dans des modèles animaux petits et grands 7 , 8. cela se produit car le corrigé, les cellules ont un avantage de survie profond sur des cellules non corrigés en raison de l’accumulation de métabolites toxiques dans ce dernier. La perte des hépatocytes non corrigés permet une expansion sélective des hépatocytes corrigées compatible avec la capacité de régénération du foie. Traitement peut être facilement suivie en mesurant la diminution des taux de tyrosine et succinylacetone TRANSPLATATION circulants.
Afin de justifier le caractère invasif de la procédure, qui comprend une hépatectomie partielle, l’objectif de cette approche doit être un remède durable. Vecteurs LENTIVIRAUX incompétent de réplication ne sont donc utilisés parce qu’ils intégreront stablement dans l’hépatocyte génome9. assurer la prestation du gène a été corrigé à toutes les cellules de fille comme le foie se développe et s’agrandit pour remplacer la perte rapide de cellules non corrigés. C’est avantageux sur les vecteurs viraux adéno associé (AAV), qui existe principalement extrachromosomale ne pouvant être transmises à une seule cellule fille au cours de la mitose10 , perdant ainsi tout effet de la thérapie en quelques semaines.
Bien qu’un nombre croissant de publications prend en charge la sécurité des lentivirus11, préoccupations sur événements génotoxiques sont atténués en limitant la transduction des cellules de l’hôte dans un environnement contrôlé en vitro . Vecteur libre n’est jamais systémique introduit à l’hôte lorsque cette méthode est exécutée, limiter l’exposition aux hépatocytes qui sera réintroduit avec greffe autologue via la veine porte.
Ce rapport décrit la méthode de l’intervention chirurgicale et ex vivo les procédures utilisées pour isoler les hépatocytes pour la thérapie génique ex vivo et transplantation autologue ultérieure de12 pour le traitement de la HT-1 cochon8. Le processus complet comprend 1) une hépatectomie partielle qui sert de source d’hépatocytes et une stimulation de la croissance pour du foie de l’hôte, 2) isolation des hépatocytes du foie excisés suivie ex vivo correction de gène et enfin 3) la réintroduction de la hépatocytes corrigés de nouveau dans l’hôte. La méthode décrite est applicable à tous les grands modèles animaux avec quelques modifications, mais seulement la FAH-deficient cochon13 aura l’avantage du milieu sélectif pour les hépatocytes corrigées.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC)</td>
			<td style="width:139px;">Yecuris</td>
			<td style="width:127px;">20-0027</td>
			<td style="width:109px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B12STS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B5SHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 60</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA60AMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 45</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA45AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 30</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>SIG30AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo catch bag</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>173050G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0 PDS</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z340H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J459H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J426H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dermabond</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Sterile Dressing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Williams&#8217;-E Powder&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ME16060P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8875-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1679-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA (g/L)</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>45172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(N-A-C, g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2 2H2O (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D (mg/mL)</td>
			<td>Crescent Chemical</td>
			<td>17456.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexamethasone</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>NDC6337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine

La thérapie génique est un choix idéal pour soigner les nombreuses erreurs innées du métabolisme du foie. Ex vivo, vecteurs LENTIVIRAUX ont été utilisées avec succès dans le traitement de nombreuses maladies hématopoïétiques chez l’être humain, car leur utilisation offre l’expression TRANSGENIQUE stable en raison de la capacité du vecteur d’intégrer dans le génome hôte. Cette méthode illustre l’application de la thérapie génique ex vivo des hépatocytes à un grand modèle animal de la tyrosinémie héréditaire de type I. Ce processus se compose de 1) isolation des hépatocytes primaires de l’animal donneur/receveur autologue, 2) ex vivo la livraison de gène par l’intermédiaire de transduction d’hépatocytes avec un vecteur lentiviral et greffe 3) autologue des hépatocytes corrigés via portail injection de la veine. Succès de la méthode s’appuie généralement sur une suppression efficace et stérile de la résection hépatique, prudente, manipulation de l’échantillon excisé, isolation des hépatocytes viables permettant de re-après, le pourcentage élevé de transduction des cellules isolées, et procédures chirurgicales aseptiques partout pour prévenir l’infection. Une défaillance technique à n’importe lequel de ces étapes se traduira par le faible rendement des hépatocytes de transduite viables pour greffe autologue ou infection de l’animal donneur/receveur. Le modèle de cochon de tyrosinémie héréditaire de type humain 1 (HT-1) choisi pour cette approche est particulièrement favorable à une telle méthode, car même un faible pourcentage de prise de greffe de cellules corrigées conduira au repeuplement du foie avec des cellules saines, basés sur un puissant avantage sélectif sur les hépatocytes natif-malades. Bien que cette sélection de croissance ne sera pas vraie pour toutes les indications, cette approche est une Fondation pour l’expansion dans d’autres indications et permet pour la manipulation de cet environnement pour traiter des maladies supplémentaires, tant à l’intérieur du foie et au-delà, tout en contrôle d’exposition aux vecteurs viraux et possibilité de toxicité hors cible et de la tumorigénicité.

La résection du foie et transplantation autologue sont représentés schématiquement à la Figure 1. Dans une cohorte représentative de 5 porcs qui a subi une résection hépatique, la plupart avaient des rendements de > 1 x 109 hépatocytes avec environ 80 % de viabilité (tableau 2), offrant beaucoup de cellules de n’importe quel type de désiré des manipulations, y compris le gène thérapie. Culture subséquente de la por...

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Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Ce protocole vise à décrire l’isolement et ex vivo livraison de gène porcin hépatocytes pour guérir des modèles de maladies métaboliques par autogreffe de cellules. Bien que ce modèle particulier bénéficie d’avantages uniques qui favorisent une thérapie réussie, l’application est une base pertinente pour traiter les indications et autres maladies.

Des gènes induite par le vecteur de la thérapie génique des hépatocytes Ex Vivo pour Transplantation autologue chez le porc

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

La thérapie génique ex vivo et la transplantation cellulaire autologue pour le traitement des erreurs innées du métabolisme dans le foie est une alternative importante à la thérapie pour ces troubles. Et nous permet non seulement de traiter ces troubles, mais de déterminer la biomasse nécessaire pour être en mesure d’atteindre un résultat thérapeutique. Cette approche évite également les conséquences significatives de l’immunosuppression et d’autres conséquences avec différents types de thérapies.Dans le contexte actuel, nous utilisons cette approche pour traiter la tyrosinémie héréditaire de type 1. Cependant, l’idée est que ce sera une approche plate-forme pour traiter une multitude de maladies hépatiques différentes avec une altération minimale. Il est important d’être en mesure de visualiser cette technique parce qu’il ya une certaine variabilité quand il s’agit de visualiser l’efficacité de la perfusion, ce qui est essentiel pour obtenir des hépatocytes viables pour la transplantation.Intervention chirurgicale effectuée par Robert Kaiser et Joseph Lillegard. Isolement cellulaire interprété par Zeji Du, Bruce Amiot. La purification cellulaire uau et la transduction ex vivo des cellules ont été faites par Caitlin VanLith.La préparation des animaux et de la préparation de la SE a été effectuée par Kari Allen et Laurie Hillin. Pour effectuer l’entrée initiale du site portuaire, effectuez une technique hasson ouverte cephalad à l’ombibilicus d’un porc de ferme anesthésié, jusqu’à trois mois, grand, blanc. Introduction d’un trocar de 12 millimètres dans la cavité abdominale, où le péritoine est visible.Lorsque le trocar est en place, passer une portée de 5 millimètres de 30 degrés à travers le port d’entrée et insuffler l’abdomen avec du dioxyde de carbone à 15 millimètres de mercure. Sous visualisation directe avec la caméra laparoscopique, placez 2 ports supplémentaires de 5 millimètres, triangulant sur le lobe latéral gauche du foie. Et placez le laparoscope dans l’un des nouveaux ports.Identifier le segment latéral gauche du foie au point de la fissure majeure du lobe gauche qui sépare les segments latéraux médiaux et gauches. Et utilisez une agrafeuse chirurgicale pour fixer les structures vasculaires et la veine hépatique le long de cette fissure. Transectez le parenchyme par cette fissure à l’aide de tirs séquentiels et de charges vasculaires de 60, 45 ou 30 millimètres de long.Lorsque la résection est terminée, évaluer le foie reste pour assurer une hémostase adéquate et utiliser des saisisseurs endoscopiques et un sac de récupération des tissus endoscopiques pour récupérer la section hépatique. Maintenant, retirez les ports et utilisez une suture de taille zéro interrompue pour le fascia midline. Une suture 2-0 en cours d’exécution pour la couche cutanée profonde.Et une suture 4-0 pour la couche sous-cuticulaire, pour fermer l’incision bâbord de 12 millimètres dans les trois couches. Ensuite, fermez les ports de cinq millimètres en une seule couche avec des sutures de 2-0. Et placez un pansement stérile sur les incisions.Pour l’isolement des hépatocytes, connectez d’abord une pompe périssaliste réglée pour fournir les solutions de dispersion, maintenues dans un bain d’eau de 43 degrés Celsius, aux cathéters à placer dans les grands vaisseaux exposés de la section hépatique. Prime la pompe et le tube avec la perfusion deux solution, jusqu’à une position de coq d’arrêt pour passer entre la perfusion un et la perfusion deux livraison de solution au tissu. Et passer la bite d’arrêt à la perfusion une position.Puis amorce le reste de l’ensemble de tubes. Remplir complètement un piège à bulles en ligne pour empêcher l’introduction de bulles d’air dans le tissu. Ensuite, faire une incision transversale propre, perpendiculaire à la circulation hépatique pour révéler les sections transversales des branches de veine portail et les veines hépatiques pour le cathétérisme.Et utilisez un cathéter ajusté pour cathétériser les veines exposées disponibles. Lorsque les cathéters sont en place, perfuser le tissu hépatique réséqué avec perfusion chaude une solution à un débit de 100 millimètres par minute. Déplacement du tube de sortie de veine en veine toutes les 30 à 60 secondes.Et en utilisant un tube d’évacuation pour enlever l’excès de tampon du plateau de tissu. Après avoir traversé toutes les veines disponibles pendant 15 à 20 minutes, passez à la perfusion deux solutions dans les mêmes conditions. Utilisation d’une pompe de retour pour recycler la perfusion deux solutions vers le réservoir, à un débit plus lent, pour la ré-administration dans le tissu.Vérifiez la température de surface du piège à bulles et, ou le foie environ toutes les cinq minutes pour confirmer que les hépatocytes ne refroidit pas. Lorsque le foie blanchit après environ 30 minutes de perfusion, transférer le tissu dans un récipient stérile, enveloppé avec un drap stérile, et placer le récipient dans un capot de culture cellulaire pour maintenir la stérilité pendant le traitement des hépatocytes. L’isolement collagène des hépatocytes et la dissociation cellulaire doit être fait complètement afin que vous n’obtint pas l’agglutination des cellules qui diminue la viabilité des cellules et la fréquence de transduction.Submergez le foie avec le milieu de lavage d’hépatocyte et faites glisser des ciseaux sur le dessus du tissu pour perturber la capsule hépatique. Portant des gants stériles, masser doucement le foie pour libérer les hépatocytes dans le milieu. Et filtrer le tissu supernatant, à travers la gaze stérile, en bouteilles de centrifugeuse de 200 millilitres.Recueillir les hépatocytes filtrés par centrifugation. Mise en commun des cellules en 150 millilitres de milieu de lavage d’hépatocyte frais en une seule bouteille de 200 millilitres pour 2 lavages supplémentaires. Et compter les cellules après la troisième centrifugation.Ensuite, diluer les cellules à 1 fois 10 à la neuvième concentration d’hépatocytes par millilitre salin. Pour l’autotransplantation des hépatocytes isolés, utilisez un transducteur de deux-cinq mégahertz pour identifier la veine du portail par ultrasons et diriger une aiguille de cinq pouces et de calibre 18 vers la veine principale du portail, env. Chargez les cellules dans une seringue de 60 millilitres, selon le volume total de la cellule et fixez la seringue à l’aiguille, en prenant soin de ne pas introduire de bulles.Ensuite, déprimez lentement le piston de seringue pour infuser manuellement jusqu’à 1 fois 10 aux neuvièmes hépatocytes à travers la veine portail à l’aide d’un cathéter d’infusion pour surveiller la pression porale pendant la transplantation. Lorsque toutes les cellules ont été livrées, retirez le cathéter et surveillez la veine portail pour la présence d’événements thrombotiques et le flux vers l’avant par ultrasons. Dans une cohorte représentative de cinq porcs, qui ont subi la résection hépatique, la plupart ont eu des rendements de plus de 10 aux neuvièmes hépatocytes avec approximativement 80% viabilité.Fournir un nombre suffisant de cellules pour tout type de manipulation désirée, y compris la thérapie génique. La culture suivante de la partie non transplantée de ces hépatocytes préparés, a démontré une bonne viabilité et adhérence avec une morphologie typique d’hépatocyte 46 heures après leur transduction et placage initial. Un engraftment initial variera selon le nombre de cellules réintroduites pendant la transplantation.Ces biopsies représentatives démontrent une chronologie de l’expansion cellulaire gène-corrigée. Unique aux maladies, telles que la tyrosinémie héréditaire de type 1, qui bénéficient d’une pression positive sélectionnée pour les cellules saines. Cette expansion est généralement terminée 12 mois après la transplantation.Une fois qu’un animal transplanté d’hydrolase d’hydrolase de fumarylace a réalisé environ 20% de re-population des hépatocytes corrigés dans le foie, les niveaux de tyrosine normaliseront comparés aux animaux sauvages-type. Tandis que les animaux non corrigés montrent une élévation significative dans le phosphatase alcalin et la transaminase d’aspartate comparées aux animaux sauvages-type, la thérapie génique ex vivo retourne ces niveaux d’enzymes de sérum à la normale. En outre, la santé métabolique générale du foie est perturbée chez les porcs knock-out non traités, comme indiqué par les élévations dans l’ammoniac circulant qui sont corrigées après la re-population avec les hépatocytes traités.Il est important de se rappeler avec l’utilisation de cette technique pour manipuler et manipuler le tissu avec soin et aussi peu que possible. Une manipulation ou une manipulation accrue des tissus, conduit à diminuer la viabilité des cellules et diminuer le rendement. Cette approche peut également s’appliquer aux personnes intéressées à étudier la distribution des arcs et les inefficacités graphiques dans les techniques d’étiquetage, en utilisant d’autres techniques en dehors des protocoles de transduction virale.N’oubliez pas que le travail avec des vecteurs viraux peut être dangereux, donc suivre les procédures de biosécurité appropriées, ainsi que le port d’équipement de protection individuelle est nécessaire lors de l’utilisation de ces techniques.

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