Name: lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine
Uploaded: 2018-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine at JoVE.com

Die Autoren danken Duane Meixner für Kompetenz bei der Durchführung der Pfortader Einspritzung, Steve Krage, Joanne Pederson und Lori Hillin für Unterstützung bei chirurgischen Eingriffen. Diese Arbeit wurde durch die Kinder Krankenhaus von Minnesota-Stiftung und Regenerationsmedizin Minnesota unterstützt. R.D.H. wurde durch eine NIH K01 DK106056 Award und eine Mayo-Klinik-Zentrum für Regenerative Medizin Career Development Award finanziert.

Alle tierische Verfahren wurden wurden nach institutionellen Richtlinien durchgeführt und überprüft und genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) vor der Durchführung der Studie. Hier beschriebene Verfahren wurden auf männlichen und weiblichen großen weißen Bauernhof Schweine (50 % Landrace/50% Large White genetischen Hintergrund) bis zu 3 Monate alt durchgeführt, die gesund und für Chirurgie geeignet erachtet werden.  Die Tiere sind sozial untergebracht, es sei denn, durch i...

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	<li>Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+metabolism+and+expanded+newborn+screening:+review+and+update.">Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).</li><li>Hansen, K., Horslen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+liver+disease+in+children.">Metabolic liver disease in children.</a> Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).</li><li>Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. 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Dieser Bericht beschreibt eine ex Vivo autologe gen Therapieansatz um ein porcinen Modell HT-1 zu heilen. Es geht um eine partielle Hepatektomie, gefolgt von ex-Vivo Hepatozyten Isolation und Transduktion von isolierten Hepatozyten mit Lenti Virus tragen das korrigierende Transgen. Korrigierte autologe Hepatozyten sind dann zurück zum FAH mangelhaft Tier durch die Pfortader8transplantiert. Obwohl die beschriebenen Verfahren auf alle großen Tiermodellen mit einigen Änderungen a...

Angeborene Fehler der Stoffwechsel der Leber sind eine Familie von Erbkrankheiten, die gemeinsam so viele wie 1 in 800 Lebendgeburten1betreffen. Viele dieser Krankheiten sind einzelne gen Mängel2 und funktional durch die Einführung einer einzigen korrigierten Kopie des betroffenen Gens in einer ausreichenden Anzahl von Hepatozyten3geheilt werden können. Der tatsächliche Prozentsatz der Hepatozyten, die korrigiert werden muss hängt von der Krankheit4 und ist weitgehend abhängig von der Art des Proteins, die es kodiert, zum Beispiel ausgeschiedenen Proteine gegen cytoplasmatische. In den meisten Fällen ist Wirksamkeit einer Behandlung für metabolische Krankheit leicht durch das Vorhandensein von Biomarkern, die oftmals auch in der Zirkulation untersucht.
HT-1 ist eine angeborene Fehler der Stoffwechsel der Leber, die durch einen Defekt im Fumarylacetoacetate Hydrolase (FAH)5, der letzte enzymatische Schritt in Tyrosin Stoffwechsel6entsteht. FAH-Mangel führt zum Build von toxischen Metaboliten in der Leber, die akutes Leberversagen und Tod verursachen können oder bei der chronischen Form der Erkrankung kann dazu führen, dass Zirrhose und hepatozellulären Karzinom. Die Krankheit wird klinisch durch Gabe von 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), ein niedermolekularer Inhibitor eines Enzyms stromaufwärts der FAH in Tyrosin-Stoffwechsel verwaltet. Die Krankheit bietet ein ideales Umfeld, um Gen-Therapie-Methoden zu testen, wie erfolgreiche Korrektur der auch eine kleine Anzahl von Hepatozyten schließlich die Wiederbevölkerung der gesamten Leber mit korrigierten Zellen in kleinen und großen Tiermodellen führt 7 , 8. Dies geschieht, weil korrigiert Zellen haben einen tiefgreifenden Überlebensvorteil gegenüber unkorrigierte Zellen durch die Anhäufung von toxischen Metaboliten in der letzteren. Der Verlust der unkorrigierte Hepatozyten ermöglicht eine selektive Erweiterung korrigierte Hepatozyten entsprechen die Regenerationsfähigkeit der Leber. Behandlung kann leicht verfolgt werden, durch die Messung des Rückgangs der zirkulierenden Tyrosin und Urinspiegel Ebenen nach Transplantation.
Um die invasive Art des Verfahrens, zu rechtfertigen, die eine partielle Hepatektomie enthält, muss das Ziel dieses Ansatzes eine dauerhafte Heilung. Daher werden Replikation inkompetenten Lentivirale Vektoren verwendet, da sie stabil in den Hepatozyten Genom9zu integrieren. Bereitstellung des korrigierten Gens an alle Tochterzellen als die Leber wächst und erweitert um den schnellen Verlust der unkorrigierte Zellen zu ersetzen. Dies ist vorteilhaft über Adeno-verbundene Viren (AAV) Vektoren, bestehen in erster Linie als Episomes, die nur auf eine einzelne Zelle Tochter während der Mitose10 dadurch verlieren jede Wirkung der Therapie in einer Angelegenheit von Wochen übergeben werden können.
Obwohl eine wachsende Zahl von Literatur über die Sicherheit von Lentivirus11, Anliegen unterstützt genotoxische Veranstaltungen gemildert durch die Begrenzung der Transduktion von Wirtszellen zu einer kontrollierten in-vitro- Umgebung. Kostenlose Vektor wird nie systemisch an den Host eingeführt, wenn diese Methode durchgeführt wird, Begrenzung der Exposition gegenüber der Hepatozyten, die mit autologen Transplantation über die Pfortader wieder eingeführt werden.
Dieser Bericht beschreibt die Methode der chirurgischen und ex Vivo Verfahren zum Isolieren von Hepatozyten für Gen-Therapie ex Vivo und anschließende autologe Transplantation12 für die Behandlung des HT-1 Schwein8. Der vollständige Prozess umfasst (1) eine partielle Hepatektomie, das als eine Quelle von Hepatozyten und ein Wachstumsimpulse für die Host Leber, 2) Isolierung der Hepatozyten aus der ausgeschnittenen Leber, gefolgt von ex-Vivo gen Korrektur, und schließlich (3) die Wiedereinführung der dient der korrigierte Hepatozyten zurück in den Host. Das beschriebene Verfahren gilt für alle großen Tiermodellen mit einigen Änderungen, sondern nur die FAH-defizienten Schwein13 haben den Vorteil der selektiven Umweltgutachten korrigierte Hepatozyten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC)</td>
			<td style="width:139px;">Yecuris</td>
			<td style="width:127px;">20-0027</td>
			<td style="width:109px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B12STS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B5SHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 60</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA60AMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 45</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA45AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 30</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>SIG30AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo catch bag</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>173050G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0 PDS</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z340H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J459H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J426H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dermabond</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Sterile Dressing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Williams&#8217;-E Powder&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ME16060P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8875-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1679-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA (g/L)</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>45172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(N-A-C, g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2 2H2O (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D (mg/mL)</td>
			<td>Crescent Chemical</td>
			<td>17456.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexamethasone</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>NDC6337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine

Gentherapie ist eine ideale Wahl um viele angeborene Fehler des Stoffwechsels der Leber zu heilen. Ex-Vivo, Lentivirale Vektoren haben erfolgreich eingesetzt bei der Behandlung vieler hämatopoetischer Erkrankungen beim Menschen, da ihre Verwendung bietet stabile Transgene Ausdruck durch den Vektor Fähigkeit in das Wirtsgenom integrieren. Diese Methode demonstriert die Anwendung der ex Vivo Gentherapie von Hepatozyten, ein großes Tier Modell des erblichen Tyrosinemia Typ ich. Dieser Prozess besteht aus 1) Isolierung der primäre Hepatozyten von autologen Empfängerin/Tier, 2) ex Vivo gen Lieferung per Hepatozyten Transduktion Lentivirale Vektor mit 3) autologe Transplantation von korrigierten Hepatozyten-Portal Vene Injektion. Erfolg der Methode im allgemeinen stützt sich auf effiziente und sterile Entfernung der Leber Resektion, sorgfältiger Umgang mit der ausgeschnittenen Probe zur Isolierung von lebensfähigen Hepatozyten für wieder anwachsen, hochprozentigen Transduktion der isolierten Zellen ausreichend und aseptische Eingriffe durchweg um Infektionen zu vermeiden. Technisches Versagen bei jedem dieser Schritte führt zu niedrigen Ertrag von lebensfähigen ausgestrahlt Hepatozyten für autologe Transplantation oder Infektion des Tieres Spender/Empfänger. Das Schwein-Modell des menschlichen Typ 1 erbliche Tyrosinemia (HT-1) für diese Vorgehensweise gewählt ist eindeutig eine solche Methode, zugänglicher, wie auch ein kleiner Prozentsatz der Engraftment korrigierten Zellen zur Wiederbesiedlung der Leber mit gesunden Zellen basierend auf einem leistungsstarken führt selektiven Vorteil gegenüber Native-Kranke Hepatozyten. Obwohl dieses Wachstum-Auswahl nicht wahr für alle Indikationen werden, dieser Ansatz ist eine Grundlage für die Expansion in andere Indikationen und ermöglicht die Manipulation dieser Umgebung zu Adresse zusätzliche Krankheiten, sowohl in der Leber und darüber hinaus, während Steuerung für die Exposition gegenüber viralen Vektoren und Gelegenheit für Ziel-Toxizität und Tumorigenität.

Die Leber Resektion und autologe Transplantation sind schematisch in Abbildung 1dargestellt. In einer repräsentativen Gruppe von 5 Schweine, die hepatischen Resektion unterzogen, hatten die meisten Erträge von > 1 x 109 Hepatozyten mit ca. 80 % Lebensfähigkeit (Tabelle 2), bietet viele Zellen für jede Art von gewünschten Manipulationen, einschließlich gen Therapie. Nachfolgende Kultur nicht transplantiert Teil der vorbereitet...

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Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Dieses Protokoll soll porcinen Hepatozyten Isolierung und ex-Vivo gen Lieferung um Modelle der metabolischen Krankheiten durch autologe Stammzelltransplantation heilen zu beschreiben. Obwohl dieses Modell einzigartige Vorteile, die erfolgreichen Therapie bevorzugen genießt, ist die Anwendung eine relevante Grundlage um weitere Krankheiten und Indikationen.

Lentivirale Vektor-vermittelte Gentherapie von Hepatozyten Ex Vivo für autologe Transplantation bei Schweinen

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

Die Ex-vivo-Gentherapie und autologe Zelltransplantation zur Behandlung von angeborenen Stoffwechselfehlern in der Leber ist eine wichtige Alternative zur Therapie für diese Erkrankungen. Und ermöglicht es uns, diese Störungen nicht nur zu behandeln, sondern auch die Biomasse zu finden, die notwendig ist, um ein therapeutisches Ergebnis zu erzielen. Dieser Ansatz vermeidet auch die signifikanten Folgen der Immunsuppression und andere Folgen bei verschiedenen Arten von Therapien.Im aktuellen Kontext verwenden wir diesen Ansatz, um erbliche Tyrosinämie Typ 1 zu behandeln. Die Idee ist jedoch, dass dies ein Plattformansatz sein wird, um eine Vielzahl von verschiedenen Lebererkrankungen mit minimaler Veränderung zu behandeln. Es ist wichtig, diese Technik visualisieren zu können, da es eine gewisse Variabilität gibt, wenn es darum geht, die Effizienz der Perfusion zu visualisieren, die wichtig ist, um lebensfähige Hepatozyten für die Transplantation zu erhalten.Chirurgische Eingriffe von Robert Kaiser und Joseph Lillegard. Zellisolierung durchgeführt von Zeji Du, Bruce Amiot. Die UAU-Zellreinigung und Ex-vivo-Transduktion der Zellen erfolgte durch Caitlin VanLith.Die Vorbereitung der Tiere und die OR-Vorbereitung wurden von Kari Allen und Laurie Hillin durchgeführt. Um den ersten Port-Site-Eingang durchzuführen, führen Sie eine offene Hasson-Technik cephalad auf den Nabel eines anästhesisierten, bis zu drei Monate alten, großen, weißen Farmschwein. Einführung eines 12-Millimeter-Trokars in die Bauchhöhle, wo das Peritoneum sichtbar ist.Wenn der Trokar an Ort und Stelle ist, passieren Sie einen 5-Millimeter-30-Grad-Bereich durch den Eingangshafen und insuffieren Sie den Bauch mit Kohlendioxid auf 15 Millimeter Quecksilber. Unter direkter Visualisierung mit der laparoskopischen Kamera, platzieren Sie 2 zusätzliche 5-Millimeter-Anschlüsse, triangulieren deiner linken Seitenlappen der Leber. Und legen Sie das Laparoskop in einem der neuen Häfen.Identifizieren Sie das linke seitliche Segment der Leber an der Stelle der hauptspalterung des linken Lappens, der die medialen und linken Seitensegmente trennt. Und verwenden Sie einen chirurgischen Hefter, um die Gefäßstrukturen und die Lebervene entlang dieser Spalte zu sichern. Transect das Parenchym durch diese Spalte mit sequentiellen Feuern und 60, 45 oder 30 Millimeter langen Gefäßlasten.Wenn die Resektion abgeschlossen ist, bewerten Sie die Restleber, um eine ausreichende Hämostase zu gewährleisten und verwenden Sie endoskopische Greifer und einen endoskopischen Geweberückziehsack, um den Leberabschnitt abzurufen. Entfernen Sie nun die Ports, und verwenden Sie eine unterbrochene Naht der Größe Null für die Mittellinienfaszie. Eine laufende 2-0-Naht für die tiefe Dermalschicht.Und eine laufende 4-0 Naht für die subgeschnittene Schicht, um den 12-Millimeter-Portschnitt in den drei Schichten zu schließen. Schließen Sie dann die Fünf-Millimeter-Ports in einer Schicht mit 2-0 Nähten. Und legen Sie ein steriles Dressing auf die Schnitte.Für die Hepatozytenisolierung, verbinden Sie zuerst eine peristaltische Pumpe, um die Dispersionslösungen zu liefern, die in einem 43 Grad Celsius Wasserbad gehalten werden, an die Katheter, die in die großen, exponierten Gefäße des Leberabschnitts gelegt werden sollen. Prime die Pumpe und Schläuche mit der Perfusion zwei Lösung, bis zu einem Stop-Hahn Position zwischen der Perfusion eine und Perfusion zwei Lösung Lieferung an das Gewebe zu wechseln. Und schalten Sie den Stop-Hahn auf die Perfusion eine Position.Dann den Rest des Schlauchsets grundieren. Vollständige Füllung einer Inline-Blasenfalle, um das Einbringen von Luftblasen in das Gewebe zu verhindern. Als nächstes machen Sie einen sauberen Querschnitt, senkrecht zur Leberzirkulation, um Querschnitte der Portalvenenzweige und der Lebervenen für die Katheterisierung zu offenbaren.Und verwenden Sie einen eng anliegenden Katheter, um die verfügbaren, exponierten Venen zu katheterisieren. Wenn die Katheter an Ort und Stelle sind, durchdringen Sie das resezierte Lebergewebe mit warmer Perfusion eine Lösung mit einer Durchflussrate von 100 Millimetern pro Minute. Das Auslaufrohr alle 30 bis 60 Sekunden von Vene zu Vene bewegen.Und mit einem Evakuierungsrohr, um überschüssigen Puffer aus dem Gewebetablett zu entfernen. Nach dem Radfahren durch alle verfügbaren Venen für 15 bis 20 Minuten, wechseln Sie zu Perfusion zwei Lösung unter den gleichen Bedingungen. Mit einer Rücklaufpumpe, um die Perfusion zwei Lösung zurück in das Reservoir zu recyceln, mit einer langsameren Durchflussrate, für die Wiederverabreichung in das Gewebe.Überprüfen Sie die Oberflächentemperatur der Blasenfalle und, oder die Leber etwa alle fünf Minuten, um zu bestätigen, dass die Hepatozyten nicht kalt werden. Wenn die Leber nach etwa 30 Minuten Perfusion blanchiert, das Gewebe in einen sterilen Behälter geben, mit einem sterilen Drap umwickelt, und legen Sie den Behälter in eine Zellkulturhaube, um die Sterilität während der Hepatozytenverarbeitung aufrechtzuerhalten. Die Kollagenase-Isolation der Hepatozyten und zelllösende Assoziation muss vollständig durchgeführt werden, damit Sie keine Verklumpung der Zellen erhalten, was die Lebensfähigkeit der Zellen und die Transduktionsfrequenz verringert.Untertauchen Sie die Leber mit Hepatozyten Waschmedium und ziehen Sie Schere über die Oberseite des Gewebes, um die Leberkapsel zu stören. Mit sterilen Handschuhen, sanft massieren Sie die Leber, um die Hepatozyten in das Medium freizugeben. Und filtern Sie den Gewebeüberstand durch sterile Gaze in 200 Milliliter Zentrifugenflaschen.Sammeln Sie die gefilterten Hepatozyten durch Zentrifugation. Bündelung der Zellen in 150 Milliliter frischem Hepatozyten-Waschmedium in einer einzigen 200-Milliliter-Flasche für 2 zusätzliche Waschungen. Und zählen die Zellen nach der dritten Zentrifugation.Verdünnen Sie dann die Zellen auf 1 mal 10 bis zu den neunten Hepatozyten pro Milliliter-Saline-Konzentration. Für die Autotransplantation der isolierten Hepatozyten verwenden Sie einen Zwei-Fünf-Megahertz-Wandler, um die Portalvene per Ultraschall zu identifizieren und eine Fünf-Zoll-Nadel mit 18-Spur in Richtung der Hauptportalvene zu lenken, die ungefähr ihrer Bifurkation entspricht. Laden Sie die Zellen in eine 60-Milliliter-Spritze, je nach dem gesamten Zellvolumen und befestigen Sie die Spritze an der Nadel, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasen eingeführt werden.Als nächstes drücken Sie den Spritzenkolben langsam, um manuell bis zu 1 mal 10 bis zu den neunten Hepatozyten durch die Portalvene zu gießen, indem Sie einen Infusionskatheter verwenden, um den Poraldruck während der Transplantation zu überwachen. Wenn alle Zellen geliefert wurden, entfernen Sie den Katheter und überwachen Sie die Portalvene auf das Vorhandensein von thrombotischen Ereignissen und den Vorwärtsfluss durch Ultraschall. In einer repräsentativen Kohorte von fünf Schweinen, die einer Leberresektion unterzogen wurden, hatten die meisten Erträge von mehr als 10 bis zu den neunten Hepatozyten mit einer Lebensfähigkeit von etwa 80 %.Bereitstellung einer ausreichenden Anzahl von Zellen für jede Art von gewünschter Manipulation, einschließlich Der Gentherapie. Die nachfolgende Kultur des nicht transplantierten Teils dieser präparierten Hepatozyten zeigte 46 Stunden nach ihrer Transduktion und Erstbeschichtung eine gute Lebensfähigkeit und Haftung mit einer typischen Hepatozytenmorphologie. Eine anfängliche Transplantation variiert je nach Anzahl der Zellen, die während der Transplantation wieder eingeführt werden.Diese repräsentativen Biopsien zeigen eine Zeitleiste der genkorrigierten Zellexpansion. Einzigartig bei Krankheiten, wie erbliche Tyrosinämie Typ 1, die einen positiven gewählten Druck für gesunde Zellen genießen. Diese Erweiterung ist in der Regel 12 Monate nach der Transplantation abgeschlossen.Sobald ein transplantiertes Fumarylacetoacetat-Hydrolase-Knockout-Tier etwa 20% der korrigierten Hepatozyten in der Leber erreicht hat, normalisieren sich die Tyrosinspiegel im Vergleich zu Wildtieren. Während unkorrigierte Tiere sowohl bei alkalischer Phosphatase als auch bei Aspartattransaminase im Vergleich zu Wildtieren eine signifikante Erhöhung aufweisen, kehrt die Ex-vivo-Gentherapie diese Serumenzyme wieder auf normal. Darüber hinaus wird die allgemeine metabolische Gesundheit der Leber bei unbehandelten Knockout-Schweinen gestört, wie durch Erhöhungen im zirkulierenden Ammoniak angezeigt wird, die nach der Wiederbesiedlung mit den behandelten Hepatozyten korrigiert werden.Es ist wichtig, sich mit dieser Technik daran zu erinnern, das Gewebe sorgfältig und so wenig wie möglich zu handhaben und zu manipulieren. Erhöhte Handhabung oder Manipulation des Gewebes, führt zu einer Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen und Abnahme der Ausbeute. Dieser Ansatz kann auch für Personen gelten, die daran interessiert sind, die Bogenverteilung und Graphenineffizienzen in Etikettierungstechniken zu untersuchen, und andere Techniken außerhalb der viralen Transduktionsprotokolle verwenden.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit viralen Vektoren gefährlich sein kann, so dass die Einhaltung der richtigen Bio-Sicherheitsverfahren, sowie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung ist notwendig, wenn Sie diese Techniken verwenden.

Research

JoVE Journal

Medicine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

Ex vivo-Kultur der Patient Tissue &amp; Prüfung von Gentransfer

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Forschung

Medizin

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
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Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Aufbau und Verbreitung der Menschenrechte Retinoblastoma Tumore in immundefizienten Mäuse

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Produktion und Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

A Novel Surgical Ansatz intratracheale Verabreichung von Wirkstoffen in einem Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Neo-Islet Formation in Leber der diabetischen Mäuse von Helper-abhängigen Adenovirus-Vektor-vermittelten Gentransfer

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Matrix-assisted Autologous Chondrocyte Transplantation for Remodeling and Repair of Chondral Defects in a Rabbit Model

Matrix-assistierte autologe Chondrozyten-Transplantation für Umbau und Reparatur von Knorpeldefekten in einem Kaninchen-Modell

Articular cartilage defects are considered a major health problem because articular cartilage has a limited capacity for self-regeneration 1. Untreated ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Ex-situ-normothermen Maschine Perfusion von Spenderlebern

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermen<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kidney Perfusion für die Erhaltung der Nierentransplantate vor der Transplantation

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...