Name: lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine
Uploaded: 2018-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine at JoVE.com

המחברים מודים דוויין Meixner על מומחיות בביצוע את הזרקת וריד שער הכבד, סטיב Krage, ג'ואן פדרסון, לורי Hillin לתמיכה במהלך הניתוחים. עבודה זו נתמכה על ידי בית החולים של מינסוטה קרן של הילדים רפואה רגנרטיבית מינסוטה. R.D.H. מומן באמצעות פרס NIH K01 DK106056, מרכז מרפאת מאיו פרס פיתוח הקריירה רפואה רגנרטיבית.

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם המוסדיים הנחיות, ולא היו שנסקרו, אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) לפני לימוד התנהגות. בהליכים המתוארים כאן בוצעו על זכר ונקבה החווה לבן גדול חזירים (50% לבן גדול Landrace/50% הרקע הגנטי) למעלה 3 חודשים של גיל זה נחשבים בריא ומתאים לניתוח.  ?...

<ol>
	<li>Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+metabolism+and+expanded+newborn+screening:+review+and+update.">Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).</li><li>Hansen, K., Horslen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+liver+disease+in+children.">Metabolic liver disease in children.</a> Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).</li><li>Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+for+inborn+errors+of+metabolism:+advancing+towards+the+clinic.">Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic.</a> BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).</li><li>Brunetti-Pierri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+inborn+errors+of+liver+metabolism:+progress+towards+clinical+applications.">Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications.</a> Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).</li><li>Carlson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+TALEN-mediated+gene+knockout+in+livestock.">Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).</li><li>Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+enzymic+defects+in+hereditary+tyrosinemia.">On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+3-dimensional+imaging+of+liver+regeneration+in+a+mouse+model+of+hereditary+tyrosinemia+type+1+using+the+sodium+iodide+symporter+gene.">Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene.</a> Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curative+ex+vivo+liver-directed+gene+therapy+in+a+pig+model+of+hereditary+tyrosinemia+type+1.">Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1.</a> Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).</li><li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272 (5259), 263-267 (1996).</li><li>Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors:+from+virology+to+transgene+expression.">Viral vectors: from virology to transgene expression.</a> British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).</li><li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+basic+to+translational.">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li><li>Chowdhury, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+improvement+of+hypercholesterolemia+after+ex+vivo+gene+therapy+in+LDLR-deficient+rabbits.">Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits.</a> Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).</li><li>Elgilani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Phenotype+Characterization+of+a+Large-Animal+Model+of+Hereditary+Tyrosinemia+Type+1.">Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1.</a> The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).</li><li>Patyshakuliyeva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+utilization+and+metabolism+is+highly+differentiated+in+Agaricus+bisporus.">Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus.</a> BMC Genomics. 14, 663 (2013).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumarylacetoacetate+hydrolase+deficient+pigs+are+a+novel+large+animal+model+of+metabolic+liver+disease.">Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease.</a> Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).</li></ol>

הדו ח מתאר שמחוץ ג'ין עצמיים טיפול בגישה לרפא מודל חזירי של HT-1. זה כרוך hepatectomy חלקית, ואחריו שמחוץ hepatocyte בידוד, התמרה חושית של hepatocytes מבודד עם וירוס lenti נושאת את transgene מתקנת. המתוקן hepatocytes עצמיים מושתלים ואז לחזור החיה לקוי FAH דרך וריד שער8. השיטה המתוארת אמנם החלים על כל ה...

שגיאות מולדות של חילוף החומרים של הכבד הם משפחה של מחלות גנטיות המשפיעות באופן קולקטיבי רבים כמו לידות חי 1 ב 8001. רבים של מחלות אלו יכולים להירפא באופן פונקציונלי על ידי החדרת המתוקן עותק יחיד של הגן המושפעת לתוך מספר מספיק של hepatocytes3הינם פגמים גנטית יחיד2 . אחוז hepatocytes זה דורש תיקון בפועל משתנה לפי המחלה4 והיא תלויה במידה רבה על האופי של החלבון שזה מקודד, לדוגמה, חלבונים הנמצאות מופרש לעומת cytoplasmic. ברוב המקרים, היעילות של כל טיפול למחלה מטבולית לבדיקה בקלות באמצעות הנוכחות של סמנים לעיתים קרובות זמינים במחזור.
HT-1 הוא שגיאה מולדת של חילוף החומרים של הכבד, תוצאה של פגם fumarylacetoacetate ההידרולז (FAH)5, השלב האחרון אנזימטי של טירוזין חילוף החומרים6. FAH לקוי מוביל לבנות של מטבוליטים רעילים בכבד יכול לגרום אי ספיקת כבד חריפה ומוות או בצורה כרונית של המחלה יכולה לגרום שחמת של hepatocellular קרצינומה. המחלה קלינית מנוהלת על ידי הממשל של 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), מעכב מולקולה קטנה של אנזים במעלה הזרם של FAH בחילוף החומרים טירוזין. המחלה מספק סביבה אידיאלית בו לבדוק שיטות טיפול גנטי, כמו תיקון מוצלח של אפילו מספר קטן של hepatocytes יביא בסופו של דבר איכלוס של הכבד כולו עם תאים המתוקן במודלים של בעלי חיים קטנים וגדולים 7 , 8. מצב זה מתרחש מאחר לתקן תאים יש יתרון הישרדות עמוקה על תאים שלא תוקנו בשל הצטברות מטבוליטים רעילים בחודש האחרון. אובדן hepatocytes שלא תוקנו מאפשר הרחבת סלקטיבי hepatocytes המתוקן בקנה אחד עם יכולת ההתחדשות של הכבד. הטיפול ניתן בעקבות בקלות על ידי מדידת הירידה במחזור טירוזין ורמות succinylacetone בעקבות השתלת.
כדי להצדיק את העיקרון החודרני של ההליך, הכוללת של hepatectomy חלקית, המטרה של גישה זו להיות תרופה עמיד. לכן, משמשים וקטורים lentiviral חסרי יכולת השכפול כי הם ישתלבו stably לתוך הגנום hepatocyte9. להבטיח משלוח של הגן המתוקן על כל התאים הבת כמו הכבד גדל ומרחיב כדי להחליף את אובדן מהיר של תאים שלא תוקנו. זה יתרון על וקטורים (AAV) ויראלי adeno הקשורים, אשר קיימים בעיקר episomes כי רק ניתן להעביר לתא הבת יחיד במהלך מיטוזה10 ובכך מאבד כל השפעה של הטיפול תוך מספר שבועות.
אף גוף גדל והולך של ספרות תומך הבטיחות של lentivirus11, חששות מעל genotoxic אירועים הם חמאני להגביל את התמרה חושית של המארח לתאים סביבה מבוקרת במבחנה . וקטור בחינם הוא הציג לעולם מערכתית למחשב המארח, כאשר מבוצע בשיטה זו, הגבלת החשיפה hepatocytes זה יהיה יוצג מחדש עם השתלת עצמיים דרך וריד שער הכבד.
הדו ח מתאר את שיטת הניתוח ואת שמחוץ הליכים המשמשים כדי לבודד hepatocytes עבור ג'ין טיפול ex-vivo ו עוקבות עצמיים השתלת12 לטיפול של חזיר HT-18. התהליך המלא כולל 1) hepatectomy חלקית, המשמשת מקור hepatocytes ו גירוי לצמיחה עבור הכבד של המחשב המארח, 2) בידוד של hepatocytes מהכבד נכרת ואחריו שמחוץ ג'ין תיקון, ולבסוף 3) בעלי חיים לטבע של hepatocytes המתוקן בחזרה לתוך המחשב המארח. השיטה המתוארת החלים על כל הדגמים בעלי חיים גדולים עם כמה שינויים, אבל היתרון של הסביבה סלקטיבית עבור hepatocytes המתוקן יהיה רק FAH לקויה חזיר13 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC)</td>
			<td style="width:139px;">Yecuris</td>
			<td style="width:127px;">20-0027</td>
			<td style="width:109px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B12STS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B5SHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 60</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA60AMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 45</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA45AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 30</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>SIG30AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo catch bag</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>173050G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0 PDS</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z340H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J459H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J426H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dermabond</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Sterile Dressing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Williams&#8217;-E Powder&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ME16060P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8875-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1679-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA (g/L)</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>45172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(N-A-C, g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2 2H2O (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D (mg/mL)</td>
			<td>Crescent Chemical</td>
			<td>17456.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexamethasone</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>NDC6337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine

ריפוי גנטי הוא הבחירה האידיאלית כדי לרפא הרבה שגיאות מולדות של חילוף החומרים של הכבד. לשעבר-vivo, וקטורים lentiviral השתמשו בהצלחה בטיפול של מחלות רבות hematopoietic בבני אדם, כמו השימוש שלהם מציע ביטוי transgene יציבה בשל היכולת של וקטור לשלב לתוך הגנום המארח. שיטה זו ממחישה את היישום של ex-vivo טיפול גנטי של hepatocytes למודל בעלי חיים גדולים מסוג tyrosinemia תורשתי אני. תהליך זה מורכב 1) בידוד של ראשי hepatocytes מן החיה תורם עצמיים/נמען, 2) ex-vivo המסירה הגן באמצעות התמרה חושית hepatocyte עם וקטור lentiviral, 3) עצמיים השתלת hepatocytes המתוקן באמצעות הפורטל הווריד הזרקה. ההצלחה של השיטה מתבססת בדרך כלל הסרת יעיל וסטרילי ההסרה בכבד, זהיר של הדגימה נכרת עבור בידוד של קיימא hepatocytes מספיק עבור התמרה חושית מחדש engrafting, אחוז גבוהה של תאים מבודדים, ו אספטי ניתוחים בכל כדי למנוע זיהום. תקלה טכנית באחד השלבים הבאים יביא תשואה נמוכה של קיימא transduced hepatocytes להשתלה עצמיים או זיהום של החיה תורם/נמען. הדגם חזיר של האדם סוג 1 תורשתי tyrosinemia (HT-1) עבור גישה זו היא נוטה באופן ייחודי, השיטה כפי אפילו אחוז קטן של engraftment של תאים המתוקן יוביל איכלוס של הכבד עם תאים בריאים המבוססת על רב עוצמה יתרון סלקטיבי hepatocytes מקורי-חולה. למרות בחירה צמיחה זו לא יהיה נכון לגבי כל הסימנים, גישה זו היא קרן להרחבת לתוך אינדיקציות אחרות, מאפשרת תמרון של סביבה זו כדי לטפל במחלות נוספות, שניהם בתוך הכבד, ומעבר, בעוד שליטה חשיפה וקטור ויראלי והזדמנות רעילות את המטרה, tumorigenicity.

כריתה כבד והשתלות עצמיים מיוצגים סכמטי באיור1. במדגם מייצג של חזירים 5 שעברו כריתה הכבד, רובם היו תשואות של > עונה 1 פרק 109 hepatocytes כ 80% פנוי (טבלה 2), מספק אפשרויות רבות של תאים עבור כל סוג של הצורך מניפולציות, כולל גנים טיפול. תרבות עוקבות של מושת?...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine at JoVE.com

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

פרוטוקול זה נועד לתאר hepatocyte חזירי בידוד ו- ex-vivo המסירה הגן כדי לרפא את הדגמים של מחלות מטבוליות באמצעות השתלת תאים עצמיים. אף על פי המודל הזה נהנה יתרונות ייחודיים לטובת טיפול מוצלח, היישום הוא בסיס רלוונטי להתייחס אינדיקציות ומחלות נוספות.

Lentiviral בתיווך וקטור ריפוי גנטי של Hepatocytes לשעבר Vivo עבור השתלת עצמיים של החזירים

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

ריפוי גנטי אקס ויוו והשתלת תאים אוטולוגיים לטיפול בשגיאות מולדות של חילוף החומרים בכבד היא חלופה חשובה לטיפול בהפרעות אלה. ומאפשר לנו לא רק לטפל בהפרעות אלה, אבל להבין את הביומסה הדרושה כדי להיות מסוגל להשיג תוצאה טיפולית. גישה זו גם מונעת את ההשלכות המשמעותיות של דיכוי המערכת החיסון והשלכות אחרות עם סוגים שונים של טיפולים.בהקשר הנוכחי, אנו משתמשים בגישה זו לטיפול טירוסינמיה תורשתית מסוג 1. עם זאת, הרעיון הוא כי זו תהיה גישה פלטפורמה לטיפול שפע של מחלות כבד שונות עם שינוי מינימלי. חשוב להיות מסוגל לדמיין טכניקה זו כי יש כמה שונות כשמדובר לדמיין את היעילות של חיסון, אשר חיוני כדי לקבל hepatocytes קיימא להשתלה.הליך כירורגי שבוצע על ידי רוברט קייזר וג'וזף לילגרד. בידוד תאים בביצוע זג'י דו, ברוס אמיוט. טיהור תא UAU ו ex vivo transduction של התאים נעשה על ידי קייטלין VanLith.הכנת בעלי החיים והכנת OR נעשתה על ידי קארי אלן ולורי הילין. כדי לבצע את הכניסה הראשונית לאתר הנמל, בצעו צפלאד טכניקת חסון פתוחה לטבילה של חזיר חווה הרדמה, בן עד שלושה חודשים, גדול ולבן. היכרות עם 12 מילימטר trocar לתוך חלל הבטן, שבו peritoneum גלוי.כאשר trocar הוא במקום, לעבור 5 מילימטר 30 מעלות היקף דרך יציאת הכניסה ולנפח את הבטן עם פחמן דו חמצני ל 15 מילימטרים של כספית. תחת הדמיה ישירה עם המצלמה לפרוסקופית, מקום 2 יציאות נוספות 5 מילימטר, טריאנגולציה על האונה השמאלית של הכבד. ולמקום את לפרוסקופ באחד הנמלים החדשים.זהה את החלק הרוחבי השמאלי של הכבד בנקודה של סדק מרכזי של האונה השמאלית המפרידה בין הקטעים המדיאליים והשמאליים. ולהשתמש שדכן כירורגי כדי לאבטח את מבני כלי הדם ואת וריד הדם לאורך סדק זה. חוצים את הפרנצ'ימה דרך הסקור הזה באמצעות ירי רציף ועומסי כלי דם באורך 60, 45 או 30 מילימטר.כאשר החלקה הושלמה, להעריך את הכבד קרן כדי להבטיח כבד נאותה ולהשתמש תופס אנדוסקופי שקית אחזור רקמה אנדוסקופית כדי לאחזר את החלק הכבד. עכשיו, להסיר את היציאות ולהשתמש תפר בגודל אפס בגודל מופרע עבור fascia קו האמצע. תפר ריצה 2-0 לשכבה העורית העמוקה.ותפר פועל 4-0 לשכבה התת עורית, כדי לסגור את חתך היציאה 12 מילימטר בשלוש השכבות. לאחר מכן סגור את חמש היציאות מילימטר בשכבה אחת עם 2-0 תפרים. ושים רוטב סטרילי על החתכים.לבידוד hepatocyte, ראשית לחבר משאבה פריסטואלית להגדיר כדי לספק את פתרונות הפיזור, מתוחזק באמבט מים 43 מעלות צלזיוס, לקטטרים להיות ממוקם בכלי הגדול, חשוף של החלק הכבד. ראש המשאבה צינורות עם פתרון תדלוק 2, עד עמדת תקע כדי לעבור בין תדלוק אחד חינם שתי פתרון משלוח לרקמה. ולהחליף את התרנגוק לעצור לתחנה אחת תחליף.ואז ראש שאר סט צינורות. ממלא לחלוטין מלכודת בועה מוטבעת כדי למנוע החדרת בועות אוויר לתוך הרקמה. לאחר מכן, לעשות חתך רוחבי נקי, בניצב למחזור הדם כדי לחשוף חתכים של ענפי וריד הפורטל ואת ורידים בהיפול לצנתור.ולהשתמש קטטר הולם נוח כדי לצנתר את הזמינות, ורידים חשופים. כאשר הקטטרים נמצאים במקום, לבלבל את רקמת הכבד המפוצלת עם תוספת חמה פתרון אחד בקצב זרימה של 100 מילימטר לדקה. מעבירים את צינור השקע מוריד לווריד כל 30 עד 60 שניות.ושימוש בצינור פינוי כדי להסיר חיץ עודף ממגש הרקמות. לאחר רכיבה על אופניים דרך כל ורידים זמינים במשך 15 עד 20 דקות, לעבור תסות תרכובת שתיים באותם תנאים. שימוש במשאבת החזרה כדי למחזר את הפתרון תדלוק שני בחזרה למאגר, בקצב זרימה איטי יותר, עבור ניהול מחדש לתוך הרקמה.בדוק את טמפרטורת פני השטח של מלכודת הבועה, או הכבד על כל חמש דקות כדי לאשר כי hepatocytes לא מתקררים. כאשר הכבד blanches לאחר כ 30 דקות של חיסון, להעביר את הרקמה למיכל סטרילי, עטוף וילון סטרילי, ולה מניחים את המיכל לתוך מכסה המנוע של תרבות התא כדי לשמור על סטריליות במהלך עיבוד hepatocyte. בידוד הקולגנס של hepatocytes ו ניתוק התא צריך להיעשות לחלוטין, כך שאתה לא מקבל גושים של התאים אשר מקטין את הכדאיות של התאים ואת תדירות ההעתקה.להטביע את הכבד עם hepatocyte לשטוף בינוני ולגרור מספריים על פני החלק העליון של הרקמה כדי לשבש את קפסולת הכבד. לובש כפפות סטריליות, בעדינות לעסות את הכבד כדי לשחרר את hepatocytes לתוך המדיום. ולסנן את הרקמה על-טבעית, דרך גזה סטרילית, לתוך בקבוקי צנטריפוגה של 200 מיליליטר.לאסוף את hepatocytes מסונן על ידי צנטריפוגה. בריכת התאים ב 150 מיליליטר של hepatocyte טרי לשטוף בינוני לתוך בקבוק יחיד 200 מיליליטר עבור 2 שטיפות נוספות. וספירת התאים לאחר הצנטריפוגה השלישית.לאחר מכן, לדלל את התאים ל 1 פעמים 10 כדי hepatocytes התשיעי לכל ריכוז מלוחים מיליליטר. עבור autotransplantation של hepatocytes מבודד, להשתמש במתמר 2-5 מגה הרץ כדי לזהות את וריד הפורטל באמצעות אולטרסאונד ולכוון מחט חמישה אינץ ', 18-מד לכיוון הוורידי הפורטל הראשי, בקירוב זה bifurcation. לטעון את התאים לתוך מזרק 60 מיליליטר, על פי נפח התא הכולל לצרף את המזרק למחט, דואג לא להציג בועות.לאחר מכן, לאט לדכא את הבוכנה מזרק להחדיר באופן ידני עד 1 10 כדי hepatocytes התשיעי דרך וריד הפורטל באמצעות קטטר עירוי כדי לפקח על הלחץ הנקבובי במהלך ההשתלה. כאשר כל התאים נמסרו, להסיר את קטטר ולפקח על וריד הפורטל לנוכחות של אירועים תרומבוטיים וזרימה קדימה על ידי אולטרסאונד. בקבוצה מייצגת של חמישה חזירים, שעברו כריתה בהיפוק, לרובם היו תשואות של יותר מ-10 עד ההפטוציטים התשיעיים עם כ-80% כדאיות.מתן מספר מספיק של תאים עבור כל סוג של מניפולציה רצויה, כולל ריפוי גנטי. התרבות שלאחר מכן של החלק הלא מושתל של hepatocytes מוכן אלה, הפגין כדאיות טובה הידבקות עם מורפולוגיה hepatocyte טיפוסי 46 שעות לאחר ההעתקה שלהם ציפוי ראשוני. חריטה ראשונית תשתנה בהתאם למספר התאים שהוצתו מחדש במהלך ההשתלה.ביופסיות מייצגות אלה מדגימות ציר זמן של הרחבת תאים מתוקנים בגנים. ייחודי למחלות, כגון טירוסינמיה תורשתית מסוג 1, שנהנות מלחץ נבחר חיובי לתאים בריאים. הרחבה זו הושלמה בדרך כלל 12 חודשים לאחר ההשתלה.לאחר חיית נוקאאוט fumarylacetoacetate מושתלת השיגה כ -20% אוכלוסייה מחדש של hepatocytes מתוקן בתוך הכבד, רמות טירוסין יהיה לנרמל בהשוואה לבעלי חיים מסוג בר. בעוד שבעלי חיים לא מגובים מפגינים עלייה משמעותית הן בפוספטאז אלקליין והן בטרנסאמינאז אספרטט בהשוואה לבעלי חיים מסוג בר, ריפוי גנטי אקס ויוו מחזיר את רמות אנזימי הסרום האלה לנורמליות. יתר על כן, בריאות חילוף החומרים הכללית בכבד משובשת חזירי נוקאאוט מטופלים, כפי שצוין על ידי הגבהים באמוניה במחזור כי הם תוקנו לאחר אוכלוסייה מחדש עם hepatocytes מטופלים.חשוב לזכור עם שימוש בטכניקה זו כדי לטפל ולתפעל את הרקמה בזהירות ומעט ככל האפשר. טיפול מוגבר או מניפולציה של הרקמה, מוביל להקטין את הכדאיות של התאים ולהקטין את התשואה. גישה זו יכולה להיות ישימה גם עבור אנשים המעוניינים ללמוד הפצת קשת וחוסר יעילות בגרף בטכניקות תיוג, באמצעות טכניקות אחרות מחוץ לפרוטוקולי ההשתנה הנגיפיים.אל תשכח כי עבודה עם וקטורים ויראליים יכול להיות מסוכן, ולכן בעקבות נהלי בטיחות ביו נאותים, כמו גם ללבוש ציוד מגן אישי יש צורך בעת שימוש בטכניקות אלה.

Research

JoVE Journal

Medicine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

אקס תרבות Vivo של רקמות החולה &amp; בחינת משלוח ג&#39;ין

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In vivo Assay שרירים כלב פונקציה

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

הקמה התפשטות של גידולים רטינובלסטומה האדם עכברים החיסון לקויה

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

הפקה וזיהוי של מינים חמצן תגובתי (ROS) סרטן

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

גישה ניתוחית חדשנית למנהל Intratracheal של סוכני יו במודל של עכברים עוברי

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

כינון ניאו איילט בכבד של עכברים סוכרתיים על ידי העברת גני Helper תלוי adenoviral וקטור בתיווך

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Matrix-assisted Autologous Chondrocyte Transplantation for Remodeling and Repair of Chondral Defects in a Rabbit Model

השתלת chondrocyte אוטולוגיים מטריקס בסיוע לשיפוץ ותיקון פגמי Chondral בדגם ארנב

Articular cartilage defects are considered a major health problem because articular cartilage has a limited capacity for self-regeneration 1. Untreated ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

צעדים לעצמיים ב<em&gt; Ex vivo</emניסוי כבד וכליה&gt; perfused בשר חזירים

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

באתרו לשעבר Normothermic מכונת זלוף של כבדים תורמים

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; זלוף כליות לשימור הכליה שתלים לפני השתלה

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...