Name: lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine
Uploaded: 2018-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine at JoVE.com

लेखक Duane Meixner पोर्टल नस इंजेक्शन, स्टीव Krage, Joanne पेडरसन, और लोरी Hillin शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के दौरान समर्थन के लिए प्रदर्शन में विशेषज्ञता के लिए धंयवाद । यह काम मिनेसोटा फाउंडेशन और regenerative चिकित्सा मिनेसोटा के बच्चों के अस्पताल द्वारा समर्थित किया गया । R.D.H. एक NIH K01 DK106056 पुरस्कार के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था और एक मेयो क्लिनिक अपक्षयी दवा कैरियर विकास पुरस्कार के लिए केंद्र ।

सभी पशु प्रक्रियाओं संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अध्ययन करने से पहले की समीक्षा की और अनुमोदित किया गया आचरण । प्रक्रियाओं यहा?...

<ol>
	<li>Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+metabolism+and+expanded+newborn+screening:+review+and+update.">Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).</li><li>Hansen, K., Horslen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+liver+disease+in+children.">Metabolic liver disease in children.</a> Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).</li><li>Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+improvement+of+hypercholesterolemia+after+ex+vivo+gene+therapy+in+LDLR-deficient+rabbits.">Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits.</a> Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).</li><li>Elgilani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Phenotype+Characterization+of+a+Large-Animal+Model+of+Hereditary+Tyrosinemia+Type+1.">Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1.</a> The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).</li><li>Patyshakuliyeva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+utilization+and+metabolism+is+highly+differentiated+in+Agaricus+bisporus.">Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus.</a> BMC Genomics. 14, 663 (2013).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumarylacetoacetate+hydrolase+deficient+pigs+are+a+novel+large+animal+model+of+metabolic+liver+disease.">Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease.</a> Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).</li></ol>

इस रिपोर्ट में एचटी-1 के एक सुअर का मॉडल का इलाज करने के लिए एक पूर्व vivo ऑटोलॉगस जीन थेरेपी के दृष्टिकोण का वर्णन है । यह एक आंशिक hepatectomy शामिल है, पूर्व vivo hepatocyte अलगाव और लेंती वायरस सुधारात्मक transgene ले जा?...

जिगर के चयापचय की जन्मजात त्रुटियां आनुवंशिक रोगों के एक परिवार है कि सामूहिक रूप से प्रभावित के रूप में कई के रूप में 1 में ८०० जीवित जंमों1। इन रोगों के कई एकल जीन दोष2 और कार्यात्मक हेपैटोसाइट्स3की एक पर्याप्त संख्या में प्रभावित जीन की एक भी सही प्रतिलिपि शुरू करने से ठीक हो सकता है । हेपैटोसाइट्स को सही करने की जरूरत है कि वास्तविक प्रतिशत रोग4 से भिन्न होता है और काफी हद तक यह encodes प्रोटीन की प्रकृति पर निर्भर है, उदाहरण के लिए, cytoplasmic बनाम प्रोटीन उत्सर्जित. ज्यादातर मामलों में, चयापचय रोग के लिए किसी भी उपचार की प्रभावकारिता आसानी से रक्त परिसंचरण में अक्सर उपलब्ध की उपस्थिति के माध्यम से परख की जाती है ।
एचटी-1 fumarylacetoacetate hydrolase (फह)5, tyrosine चयापचय6में पिछले एंजाइमी कदम में एक दोष से परिणाम है कि जिगर के चयापचय का एक अजन्मा त्रुटि है । फह कमी जिगर में विषाक्त चयापचयों के निर्माण की ओर जाता है कि तीव्र जिगर की विफलता और मौत या रोग के जीर्ण रूप में पैदा कर सकता है सिरोसिस और hepatocellular कार्सिनोमा पैदा कर सकता है । रोग चिकित्सकीय 2 के प्रशासन द्वारा प्रबंधित किया जाता है-(2-नाइट्रो-4-trifluoromethylbenzoyl)-1, 3-cyclohexanedione (NTBC), tyrosine चयापचय में फह के एक एंजाइम नदी के ऊपर एक छोटे से अणु अवरोधक । रोग एक आदर्श वातावरण में जो जीन चिकित्सा विधियों का परीक्षण करने के लिए, हेपैटोसाइट्स की भी एक छोटी संख्या के सफल सुधार के रूप में अंततः दोनों छोटे और बड़े पशु मॉडल में सही कोशिकाओं के साथ पूरे जिगर की जनसंख्या में परिणाम होगा प्रदान करता है 7 , 8. यह तब होता है क्योंकि सही कोशिकाओं के बाद में विषाक्त चयापचयों के संचय के कारण सुधारित कोशिकाओं पर एक गहरा अस्तित्व का लाभ है । सुधारित हेपैटोसाइट्स की हानि जिगर की अपक्षयी क्षमता के अनुरूप सही हेपैटोसाइट्स के चयनात्मक विस्तार के लिए अनुमति देता है । उपचार आसानी से परिसंचारी tyrosine और succinylacetone स्तर के बाद प्रत्यारोपण में कमी को मापने के द्वारा पीछा किया जा सकता है ।
आदेश में प्रक्रिया है, जो एक आंशिक hepatectomy शामिल की इनवेसिव प्रकृति का औचित्य साबित करने के लिए, इस दृष्टिकोण का लक्ष्य एक टिकाऊ इलाज होना चाहिए । इसलिए, प्रतिकृति अक्षम lentiviral वैक्टर उपयोग किया जाता है क्योंकि वे छुरा hepatocyte जीनोम9में एकीकृत करेंगे । सभी बेटी कोशिकाओं को सही जीन के वितरण सुनिश्चित करने के रूप में जिगर बढ़ता है और सुधार कोशिकाओं के तेजी से नुकसान की जगह फैलता है । इस adeno जुड़े वायरल (AAV) वैक्टर, जो मुख्य रूप से episomes है कि केवल10 बँटवारा के दौरान एक ही बेटी सेल को पारित कर सकते है जिससे सप्ताह के एक मामले में चिकित्सा के किसी भी प्रभाव के रूप में मौजूद है पर लाभप्रद है ।
हालांकि साहित्य की बढ़ती शरीर11lentivirus की सुरक्षा का समर्थन करता है, genotoxic घटनाओं पर चिंताओं को एक नियंत्रित इन विट्रो वातावरण में मेजबान कोशिकाओं के transduction सीमित द्वारा कम कर रहे हैं । मुक्त वेक्टर कभी नहीं प्रणालीबद्ध मेजबान के लिए शुरू की है जब इस विधि का प्रदर्शन किया है, हेपैटोसाइट्स है कि फिर से किया जाएगा के लिए जोखिम सीमित पोर्टल नस के माध्यम से ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण के साथ शुरू की ।
इस रिपोर्ट में शल्य चिकित्सा और पूर्व vivo के लिए जीन थेरेपी के लिए हेपैटोसाइट्स अलग करने के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं की विधि का वर्णन है vivo और बाद में एचटी-1 सुअर8के उपचार के लिए ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण12 . पूर्ण प्रक्रिया शामिल है 1) एक आंशिक hepatectomy कि हेपैटोसाइट्स के एक स्रोत के रूप में कार्य करता है और मेजबान के जिगर के लिए एक वृद्धि उत्तेजना, 2) उत्पादेड जिगर से पूर्व vivo जीन सुधार के बाद से हेपैटोसाइट्स के अलगाव, और अंत में 3) के पुनर्परिचय वापस मेजबान में हेपैटोसाइट्स सही । वर्णित विधि कुछ संशोधन के साथ सभी बड़े पशु मॉडलों के लिए लागू है, लेकिन केवल फह की कमी सुअर13 सही हेपैटोसाइट्स के लिए चयनात्मक वातावरण का लाभ होगा ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC)</td>
			<td style="width:139px;">Yecuris</td>
			<td style="width:127px;">20-0027</td>
			<td style="width:109px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B12STS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B5SHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 60</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA60AMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 45</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA45AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 30</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>SIG30AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo catch bag</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>173050G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0 PDS</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z340H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J459H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J426H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dermabond</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Sterile Dressing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Williams&#8217;-E Powder&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ME16060P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8875-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1679-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA (g/L)</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>45172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(N-A-C, g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2 2H2O (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D (mg/mL)</td>
			<td>Crescent Chemical</td>
			<td>17456.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexamethasone</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>NDC6337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine

जीन थेरेपी जिगर के चयापचय के कई अजन्मा त्रुटियों का इलाज करने के लिए एक आदर्श विकल्प है । पूर्व vivo, lentiviral वैक्टर सफलतापूर्वक मानव में कई टेम रोगों के उपचार में इस्तेमाल किया गया है, के रूप में उनके उपयोग स्थिर transgene है वेक्टर को मेजबान जीनोम में एकीकृत करने की क्षमता के कारण अभिव्यक्ति प्रदान करता है । इस विधि हेपैटोसाइट्स के पूर्व vivo जीन थेरेपी के आवेदन वंशानुगत tyrosinemia प्रकार I के एक बड़े पशु मॉडल को दर्शाता है । इस प्रक्रिया के होते है 1) ऑटोलॉगस दाता से प्राथमिक हेपैटोसाइट्स के अलगाव/प्राप्तकर्ता पशु, 2) एक lentiviral वेक्टर के साथ hepatocyte transduction के माध्यम से पूर्व vivo जीन डिलिवरी, और 3) पोर्टल के माध्यम से सही ऑटोलॉगस के हेपैटोसाइट्स प्रत्यारोपण नस इंजेक्शन । विधि की सफलता आम तौर पर जिगर लकीर के कुशल और बाँझ हटाने पर निर्भर करता है, व्यवहार्य हेपैटोसाइट्स के अलगाव के लिए पर्याप्त engrafting, अलग कोशिकाओं के उच्च प्रतिशत transduction के लिए अपर्याप्त के लिए उत्पाद का नमूना हैंडलिंग, और अपूतित संक्रमण को रोकने के लिए भर में शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं । इन कदमों में से किसी पर तकनीकी विफलता ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण या दाता के संक्रमण के लिए व्यवहार्य transduced हेपैटोसाइट्स की कम उपज में परिणाम होगा/ मानव प्रकार के सुअर मॉडल 1 वंशानुगत tyrosinemia (एचटी-1) इस दृष्टिकोण के लिए चुना विशिष्ट इस तरह के एक विधि के लिए उत्तरदाई है, के रूप में भी सही कोशिकाओं के engraftment का एक छोटा सा प्रतिशत स्वस्थ एक शक्तिशाली के आधार पर कोशिकाओं के साथ जिगर की जनसंख्या को बढ़ावा मिलेगा देशी-रोगग्रस्त हेपैटोसाइट्स पर चुनिंदा लाभ. हालांकि यह वृद्धि चयन सभी संकेतों के लिए सही नहीं होगा, यह दृष्टिकोण अंय संकेतों में विस्तार के लिए एक नींव है और इस पर्यावरण के हेरफेर के लिए अनुमति देता है के लिए अतिरिक्त रोगों का पता, दोनों जिगर के भीतर और परे, जबकि बंद लक्ष्य विषाक्तता और tumorigenicity के लिए वायरल वेक्टर और अवसर के लिए जोखिम के लिए नियंत्रित.

जिगर लकीर और ऑटोलॉगस ट्रांसप्लांटेशन योजनाबद्ध रूप से 1 चित्रामें प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । 5 सूअरों कि यकृत लकीर से गुजरा के एक प्रतिनिधि के पलटन में, सबसे अधिक की पैदावार थी > 1 x 1...

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Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

इस प्रोटोकॉल को ऑटोलॉगस कोशिका प्रत्यारोपण के माध्यम से चयापचय रोगों के मॉडल का इलाज करने के लिए सुअर का hepatocyte अलगाव और पूर्व vivo जीन डिलीवरी का वर्णन करने के लिए करना है । हालांकि इस विशेष मॉडल है कि सफल चिकित्सा एहसान अद्वितीय लाभ प्राप्त है, आवेदन एक प्रासंगिक करने के लिए अतिरिक्त बीमारियों और संकेत पता नींव है ।

Lentiviral वेक्टर-हेपैटोसाइट्स पूर्व Vivo की मध्यस्थता जीन थेरेपी सूअर में ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण के लिए

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

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