Name: lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine
Uploaded: 2018-11-04T13:00:00
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Gli autori ringraziano Duane Meixner per competenza nell'eseguire l'iniezione della vena portale, Steve Krage, Joanne Pederson e Lori Hillin per assistenza durante le procedure chirurgiche. Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione dell'ospedale del Minnesota Minnesota di medicina rigenerativa e dei bambini. R.D.H. è stato finanziato attraverso un premio NIH K01 DK106056 e un Mayo Clinic Center per medicina rigenerativa Career Development Award.

Animale tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali ed erano esaminate e approvate dal istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) prima di studio condotta. Le procedure descritte qui sono state effettuate su maschio e femmina grande bianco allevamento di maiali (background genetico di 50% Landrace/50% Large White) fino a 3 mesi di età che sono ritenuti sani e adatti per la chirurgia.  Gli animali sono alloggiati socialmente se non considerato incompatibile dal personal...

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	<li>Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+metabolism+and+expanded+newborn+screening:+review+and+update.">Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).</li><li>Hansen, K., Horslen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+liver+disease+in+children.">Metabolic liver disease in children.</a> Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).</li><li>Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumarylacetoacetate+hydrolase+deficient+pigs+are+a+novel+large+animal+model+of+metabolic+liver+disease.">Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease.</a> Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).</li></ol>

Questo rapporto descrive un ex vivo autologo approccio di terapia genica per curare un modello porcino di HT-1. Si tratta di un'epatectomia parziale, seguita da ex vivo dell'epatocita isolamento e trasduzione di epatociti isolati con lenti virus che trasportano il transgene correttivo. Corretti gli epatociti autologhi sono poi trapiantati torna all'animale carente di FAH attraverso la vena porta8. Anche se il metodo descritto è applicabile a tutti i grandi modelli animali con al...

Errori congeniti del metabolismo del fegato sono una famiglia di malattie genetiche che colpiscono collettivamente altretanto come 1 in 800 nati vivi1. Molte di queste malattie sono singolo gene difetti2 e può essere curate in modo funzionale con l'introduzione di una singola copia corretta del gene interessato in un numero sufficiente di epatociti3. La percentuale effettiva di epatociti che deve essere corretto varia a seconda della malattia4 e dipende in larga misura la natura della proteina che codifica, ad esempio, viene escreta proteine contro citoplasmico. Nella maggior parte dei casi, l'efficacia di qualsiasi trattamento per la malattia metabolica è facilmente analizzato attraverso la presenza di biomarcatori spesso disponibile nella circolazione.
HT-1 è un errore innato del metabolismo del fegato che deriva da un difetto in fumarylacetoacetate idrolasi (FAH)5, l'ultimo passaggio enzimatico in tirosina metabolismo6. Deficit di FAH conduce alla generazione di metaboliti tossici nel fegato che può causare morte e insufficienza epatica acuta o in forma cronica della malattia possono causare cirrosi e carcinoma epatocellulare. La malattia è clinicamente gestita dall'amministrazione di 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), un inibitore di piccola molecola di un enzima a Monte di FAH nel metabolismo della tirosina. La malattia fornisce un ambiente ideale in cui sperimentare tecniche di terapia genica, come riuscita correzione di anche un piccolo numero di epatociti alla fine si tradurrà nel ripopolamento del fegato intero con cellule corrette nei modelli animali piccoli e grandi 7 , 8. ciò si verifica perché rettificato le cellule hanno un vantaggio di sopravvivenza profonda sopra cellule non corrette a causa dell'accumulo di metaboliti tossici in quest'ultimo. La perdita degli epatociti non corretti consente l'espansione selettiva degli epatociti corretti coerenza con la capacità rigenerativa del fegato. Il trattamento può essere seguito facilmente misurando la diminuzione nei livelli di tirosina ed eritrocitaria dopo trapianto di circolazione.
Al fine di giustificare la natura invasiva della procedura, che comprende un'epatectomia parziale, l'obiettivo di questo approccio deve essere una cura durevole. Pertanto, vettori lentivirali incompetente replica vengono utilizzati perché saranno integrati stabilmente nel genoma dell'epatocita9. garantire la consegna del gene corretto per tutte le cellule della figlia come il fegato cresce e si espande per sostituire la perdita rapida di cellule non rivedute. Questo è vantaggioso su vettori virali adeno associato (AAV), che esiste principalmente come episomi che possono essere passati solo a una singola cella della figlia durante la mitosi10 perdendo così qualsiasi effetto della terapia in poche settimane.
Anche se un corpo crescente di letteratura supporta la sicurezza di lentivirus11, preoccupazioni su eventi genotossici sono mitigati limitando la trasduzione di cellule dell'ospite in un ambiente controllato in vitro . Vettore libero mai sistemica è introdotto all'host quando questo metodo viene eseguito, limitando l'esposizione agli epatociti che sarà reintrodotto con trapianto autologo tramite la vena portale.
Questo rapporto descrive il metodo di chirurgica ed ex vivo le procedure utilizzate per isolare gli epatociti per terapia genica ex vivo e il conseguente trapianto autologo12 per il trattamento del maiale HT-18. Il processo completo include 1) un'epatectomia parziale che serve come fonte di epatociti e un stimolo di crescita per fegato dell'host, 2) isolamento degli epatociti dal fegato asportato seguita da ex vivo correzione genica e infine 3) reintroduzione della epatociti corretti nuovamente dentro l'host. Il metodo descritto è applicabile a tutti i grandi modelli animali con alcune modifiche, ma solo il maiale di FAH-carenti13 avrà il vantaggio dell'ambiente selettivo per gli epatociti corretti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC)</td>
			<td style="width:139px;">Yecuris</td>
			<td style="width:127px;">20-0027</td>
			<td style="width:109px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B12STS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B5SHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 60</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA60AMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 45</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA45AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 30</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>SIG30AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo catch bag</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>173050G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0 PDS</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z340H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J459H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J426H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dermabond</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Sterile Dressing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Williams&#8217;-E Powder&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ME16060P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8875-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1679-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA (g/L)</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>45172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(N-A-C, g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2 2H2O (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D (mg/mL)</td>
			<td>Crescent Chemical</td>
			<td>17456.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexamethasone</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>NDC6337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine

La terapia genica è una scelta ideale per curare molti errori congeniti del metabolismo del fegato. Ex-vivo, vettori lentivirali sono stati utilizzati con successo nel trattamento di molte malattie ematopoietiche in esseri umani, come il loro utilizzo offre l'espressione del transgene stabile grazie alla capacità del vettore di integrare nel genoma ospite. Questo metodo viene illustrata l'applicazione di ex vivo terapia genica degli epatociti a un grande modello animale della tirosinemia ereditaria di tipo I. Questo processo è costituito da 1) isolamento di epatociti primari dall'animale autologo donatore/ricevente, 2) ex vivo consegna del gene tramite trasduzione degli epatociti con un vettore lentivirale e 3) autologo trapianto di epatociti corretti tramite portale della vena di iniezione. Successo del metodo si basa generalmente su rimozione efficiente e sterile della resezione epatica, un'attenta gestione dell'esemplare asportato per l'isolamento degli epatociti vitali sufficienti per trasduzione del ri-innesto, ad alta percentuale di cellule isolate, e procedure chirurgiche asettiche in tutto per prevenire l'infezione. Guasto tecnico presso uno di questi passaggi si tradurrà in basso rendimento degli epatociti trasdotte praticabili per trapianto autologo o infezione dell'animale donatore/ricevente. Il modello di maiale di tirosinemia ereditaria di tipo 1 umano (HT-1) scelto per questo approccio è unicamente suscettibile di tale metodo, come anche una piccola percentuale di attecchimento di cellule corrette porterà alla ripopolazione del fegato con le cellule sane, basate su un potente vantaggio selettivo negli epatociti nativo-malato. Anche se questa selezione di crescita non sarà vera per tutte le indicazioni, questo approccio è una Fondazione per l'espansione in altre indicazioni e permette per la manipolazione di questo ambiente di affrontare ulteriori malattie, sia all'interno del fegato e oltre, controllo per l'esposizione al vettore virale e opportunità per fuori bersaglio tossicità e carcinogenicità.

La resezione epatica e trapianto autologo sono rappresentati schematicamente in Figura 1. In un gruppo rappresentativo di 5 maiali che hanno subito la resezione epatica, la maggior parte avevano rendimenti di > 1 x 109 epatociti con circa 80% di vitalità (tabella 2), fornendo un sacco di cellule per qualsiasi tipo di desiderato manipolazioni, tra cui gene terapia. Successiva cultura della parte non sottoposti a trapianto di epatoc...

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Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Questo protocollo è destinato per descrivere la consegna di porcino dell'epatocita isolamento ed ex vivo del gene per curare modelli di malattie metaboliche tramite trapianto autologous della cellula. Anche se questo particolare modello gode di vantaggi unici che favoriscono la riuscita terapia, l'applicazione è una Fondazione pertinente all'indirizzo di indicazioni e altre malattie.

Lentivirali terapia genica mediata da vettore di epatociti Ex Vivo per trapianto autologo nei suini

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

La terapia genica ex vivo e il trapianto di cellule autologhe per il trattamento degli errori inborni del metabolismo nel fegato è un'importante alternativa alla terapia per questi disturbi. E ci permette non solo di trattare questi disturbi, ma anche di capire la biomassa necessaria per poter ottenere un risultato terapeutico. Questo approccio evita anche le significative conseguenze dell'immunosoppressione e altre conseguenze con diversi tipi di terapie.Nel contesto attuale, stiamo usando questo approccio per trattare la tirosinemia ereditaria di tipo 1. Tuttavia, l'idea è che questo sarà un approccio piattaforma per trattare una moltitudine di diverse malattie del fegato con alterazione minima. È importante essere in grado di visualizzare questa tecnica perché c'è una certa variabilità quando si tratta di visualizzare l'efficienza della perfusione, che è essenziale per ottenere epatociti vitali per il trapianto.Procedura chirurgica eseguita da Robert Kaiser e Joseph Lillegard. Isolamento cellulare eseguito da Zeji Du, Bruce Amiot. La purificazione cellulare UAU e la trasduzione ex vivo delle cellule sono state fatte da Caitlin VanLith.La preparazione degli animali e la preparazione or è stata fatta da Kari Allen e Laurie Hillin. Per eseguire l'ingresso iniziale del sito portuale, eseguire una tecnica Hasson aperta cephalad all'ombelico di un maiale da fattoria bianco anestetizzato, fino a tre mesi, grande. Introduzione di un trocar di 12 millimetri nella cavità addominale, dove è visibile il peritoneo.Quando il trocar è in posizione, passare un mirino di 5 millimetri e 30 gradi attraverso la porta di ingresso e insufflate l'addome con anidride carbonica a 15 millimetri di mercurio. Sotto visualizzazione diretta con la fotocamera laparoscopica, posizionare 2 porte aggiuntive da 5 millimetri, triangolando sul lobo laterale sinistro del fegato. E posizionare il laparoscopio in una delle nuove porte.Identificare il segmento laterale sinistro del fegato nel punto della fessura maggiore del lobo sinistro che separa i segmenti mediali e laterale sinistro. E usa una cucitrice chirurgica per fissare le strutture vascolari e la vena epatica lungo questa fessura. Trasmetti il parenchima attraverso questa fessura usando cotere sequenziali e carichi vascolari lunghi 60, 45 o 30 millimetri.Al termine della resezione, valutare il fegato residuo per garantire un'emostasi adeguata e utilizzare afferratori endoscopici e un sacchetto di recupero del tessuto endoscopico per recuperare la sezione epatica. Ora, rimuovere le porte e utilizzare una sutura zero di dimensione interrotta per la fascia della linea mediana. Una sutura 2-0 in esecuzione per lo strato dermico profondo.E una sutura 4-0 in esecuzione per lo strato sottocuticolare, per chiudere l'incisione della porta di 12 millimetri nei tre strati. Quindi chiudere le porte di cinque millimetri in uno strato con 2-0 suture. E mettere una medicazione sterile sulle incisioni.Per l'isolamento degli epatociti, collegare prima una pompa peristaltica impostata per fornire le soluzioni di dispersione, mantenute in un bagno d'acqua di 43 gradi Celsius, ai cateteri da posizionare nei grandi vasi esposti della sezione epatica. Innescare la pompa e i tubi con la perfusione due soluzioni, fino a una posizione di arresto del cazzo per passare tra la perfusione uno e la perfusione due forniture di soluzione al tessuto. E passare il cazzo di arresto alla perfusione in una posizione.Quindi innescare il resto del set di tubi. Riempire completamente una trappola a bolle in linea per evitare l'introduzione di bolle d'aria nel tessuto. Successivamente, fare un'incisione trasversale pulita, perpendicolare alla circolazione epatica per rivelare sezioni trasversali dei rami delle vene portale e delle vene epatiche per la cateterizzazione.E utilizzare un catetere aderente per cateterizzare le vene disponibili e esposte. Quando i cateteri sono in posizione, perfondere il tessuto epatico reinsediato con perfusione calda una soluzione a una portata di 100 millimetri al minuto. Spostare il tubo di uscita dalla vena alla vena ogni 30-60 secondi.E usando un tubo di evacuazione per rimuovere il tampone in eccesso dal vassoio del tessuto. Dopo aver pedalando attraverso tutte le vene disponibili per 15-20 minuti, passare alla perfusione due soluzioni nelle stesse condizioni. Utilizzando una pompa di ritorno per riciclare la perfusione due soluzioni al serbatoio, a una portata più lenta, per la re-somministrazione nel tessuto.Controllare la temperatura superficiale della trappola a bolle e, o il fegato circa ogni cinque minuti per confermare che gli epatociti non si raffreddore. Quando il fegato brilla dopo circa 30 minuti di perfusione, trasferire il tessuto in un contenitore sterile, avvolto con un drap sterile, e posizionare il contenitore in una cappa di coltura cellulare per mantenere la sterilità durante la lavorazione degli epatociti. L'isolamento della collagenasi degli epatociti e la dissociazione cellulare devono essere fatti completamente in modo da non avere un raggruppamento delle cellule che diminuisce la vitalità delle cellule e la frequenza di trasduzione.Immergere il fegato con mezzo di lavaggio epatocita e trascinare le forbici sulla parte superiore del tessuto per interrompere la capsula del fegato. Indossando guanti sterili, massaggiare delicatamente il fegato per rilasciare gli epatociti nel mezzo. E filtrare il supernatante tissutale, attraverso una garza sterile, in bottiglie di centrifuga da 200 millilitri.Raccogliere gli epatociti filtrati per centrifugazione. Mettere in comune le cellule in 150 millilitri di mezzo di lavaggio epatocita fresco in un'unica bottiglia da 200 millilitri per 2 lavaggi aggiuntivi. E contando le cellule dopo la terza centrifugazione.Quindi, diluire le cellule a 1 per 10 al nono epatociti per concentrazione salina millilitro. Per l'autotrapianto degli epatociti isolati, utilizzare un trasduttore da due-cinque megahertz per identificare la vena del portale tramite ultrasuoni e dirigere un ago da cinque pollici e 18 gauge verso la vena del portale principale, approssimativamente alla sua biforcazione. Caricare le cellule in una siringa da 60 millilitri, in base al volume totale della cella e attaccare la siringa all'ago, facendo attenzione a non introdurre bolle.Successivamente, deprimere lentamente lo stantuffo della siringa per infondere manualmente fino a 1 per 10 al nono epatociti attraverso la vena portale utilizzando un catetere per infusione per monitorare la pressione porale durante il trapianto. Una volta consegnate tutte le cellule, rimuovere il catetere e monitorare la vena porta per la presenza di eventi trombotici e il flusso in avanti tramite ultrasuoni. In una coorte rappresentativa di cinque suini, che è stata sottoposta a resezione epatica, la maggior parte aveva rese superiori al 10 al nono epatociti con circa l'80% di vitalità.Fornire un numero sufficiente di cellule per qualsiasi tipo di manipolazione desiderata, compresa la terapia genica. La successiva coltura della porzione non trapiantata di questi epatociti preparati, ha dimostrato una buona vitalità e adesione con una tipica morfologia epatocitaria 46 ore dopo la loro trasduzione e placcatura iniziale. Un innesto iniziale varia in base al numero di cellule reintrodotta durante il trapianto.Queste biopsie rappresentative dimostrano una linea temporale di espansione cellulare corretta dal gene. Unico per malattie, come la tirosinemia ereditaria di tipo 1, che godono di una pressione selezionata positiva per le cellule sane. Questa espansione è in genere completa 12 mesi dopo il trapianto.Una volta che un animale knockout idrolasi fumarilacetato trapiantato ha raggiunto circa il 20% di re-popolazione degli epatociti corretti all'interno del fegato, i livelli di tirosina si normalizzeranno rispetto agli animali di tipo selvatico. Mentre gli animali non corretti mostrano un'elevazione significativa sia nella fosfatasi alcalina che nella transaminasi aspartata rispetto agli animali di tipo selvatico, la terapia genica ex vivo riporta questi livelli di enzimi sieri alla normalità. Inoltre, la salute metabolica generale del fegato viene interrotta nei suini knockout non trattati, come indicato dalle elevazioni nell'ammoniaca circolante che vengono corrette dopo la ripopolamento con gli epatociti trattati.È importante ricordare con l'uso di questa tecnica per gestire e manipolare il tessuto con attenzione e il meno possibile. Una maggiore manipolazione o manipolazione del tessuto, porta a ridurre la vitalità delle cellule e diminuire la resa. Questo approccio può essere applicabile anche alle persone interessate a studiare la distribuzione dell'arco e le inefficienze dei grafici nelle tecniche di etichettatura, utilizzando altre tecniche al di fuori dei protocolli di trasduzione virale.Non dimenticare che lavorare con vettori virali può essere pericoloso, quindi seguire procedure di biosicurezza adeguate, oltre a indossare dispositivi di protezione individuale è necessario quando si utilizzano queste tecniche.

Research

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