Name: lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine
Uploaded: 2018-11-04T13:00:00
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著者はデュアン Meixner の門脈内注入、スティーブ Krage、ジョアン Pederson ロリ Hillin サポート、手術中に行う専門知識をありがちましょう。この作品は、子供の病院のミネソタ州財団と再生医療のミネソタによって支えられました。R.D.H. は、NIH K01 DK106056 賞とメイヨー クリニック センターを通じて再生医学のキャリア開発賞に資金を供給されました。

動物のすべてのプロシージャは、見直しされ、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって試験を実施する前に承認制度のガイドラインに従って行われました。ここで説明する手順を健康と手術に不向きと判断される年齢の 3ヶ月男性と女性の大きな白い農場の豚 (50 %landrace/50% 大きな白い遺伝的背景) を施行しました。 動物は、獣医の介護施設スタッフが互換性のない見なされない限り社?...

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	<li>Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+metabolism+and+expanded+newborn+screening:+review+and+update.">Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).</li><li>Hansen, K., Horslen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+liver+disease+in+children.">Metabolic liver disease in children.</a> Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).</li><li>Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. 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このレポートでは、HT 1 の豚のモデルを治す自己遺伝子ex vivo療法アプローチについて説明します。部分肝切除、肝細胞分離前のヴィヴォと分離肝細胞の情報伝達に続いて是正遺伝子を運ぶ遺伝子導入ウイルスが含まれます。修正自己肝細胞は門脈8を介して FAH 欠乏動物に戻って、移植されます。説明する方法はいくつかの変更とすべての大動物モデルに適用で?...

先天性肝臓の代謝は、総称してできるだけ多くの 1 の 800 出生1に影響を与える遺伝病の家族です。これらの疾患の多くは単一遺伝子の欠陥は2であり、機能的肝3の十分な数に影響を受けた遺伝子の単一の修正されたコピーを導入することによって治すことができます。修正が必要な肝細胞の実際の割合病気4によって異なりますが、たとえば、排泄蛋白質細胞質対それをエンコードし、タンパク質の性質に大きく依存します。ほとんどの場合、代謝性疾患の任意の治療の有効性はしばしば循環で利用可能なバイオ マーカーの存在によって簡単に試金します。
HT 1 は先天性欠陥 4-フマリルアセト酢酸加水分解酵素 (ファー)5、チロシン代謝6の最後の酵素ステップからの結果肝臓の代謝異常です。FAH の欠乏は、急性肝不全と死を引き起こすことができるまたは病気の慢性の形態が原因で肝硬変や肝細胞癌肝毒性代謝産物のビルドに します。病気は、2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) をもたらすチロシン代謝の FAH の上流酵素の小分子阻害薬の投与により臨床的に管理されます。病気は、肝細胞の数が少ないもの成功補正で結局起因する肝臓全体の再作成両方の小規模および大規模な動物モデルに修正された細胞の遺伝子治療法をテストする理想的な環境7,8します。 これは、修正細胞後者で裸眼の細胞毒性代謝産物の蓄積のために深遠な生存の利点があります。肝臓の再生能力と一貫性のある修正された肝細胞の選択的な拡大のため裸眼肝細胞の損失ができます。治療は、移植チロシンと succinylacetone のレベルを循環の減少を測定することによって簡単に続くことが。
部分肝切除を含むプロシージャの侵襲を正当化するためにこのアプローチの目的は、耐久性のある治療法をする必要があります。したがって、レプリケーション無能なレンチウイルスベクターは、安定して肝細胞ゲノム9に統合されるために使用されます。肝臓としての娘のすべてのセルに修正された遺伝子の配信を確保する成長し、裸眼の細胞の急速な損失を置き換えるに拡大します。これは有糸分裂10週間の問題で治療の効果を失うことの間に 1 つの娘細胞にのみ渡されるエピソームとして主に存在している関連付けられているアデノ ウイルス (AAV) ベクターで有利であります。
文献の成長するボディにレンチ ウイルス11懸念の安全性をサポートしていますが、遺伝毒性イベントが制御体外環境に宿主細胞の情報伝達を制限することによって軽減されます。このメソッドを実行すると、門脈内自家移植と再導入される肝細胞への暴露を制限するとき、無料ベクトルがホストに導入決して全身。
このレポートでは、手術の方法と分離肝細胞遺伝子療法前のヴィヴォと後続の自家移植12 HT 1 豚8の治療のために使用される前のヴィヴォプロシージャについて説明します。完全なプロセスには 1) 肝細胞と肝臓のホストの成長刺激の源、2) 遺伝子補正前のヴィヴォ、最終的に 3) の再導入に続いて摘出した肝臓から肝細胞の分離として機能する部分切除が含まれています、修正された肝細胞は、ホストにバックアップします。説明する方法をいくつか修正して、すべての大型動物モデルに適用されますが、FAH 欠損豚13だけは修正された肝細胞の選択的な環境の利点があります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC)</td>
			<td style="width:139px;">Yecuris</td>
			<td style="width:127px;">20-0027</td>
			<td style="width:109px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B12STS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B5SHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 60</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA60AMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 45</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA45AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 30</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>SIG30AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo catch bag</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>173050G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0 PDS</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z340H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J459H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J426H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dermabond</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Sterile Dressing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Williams&#8217;-E Powder&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ME16060P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8875-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1679-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA (g/L)</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>45172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(N-A-C, g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2 2H2O (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D (mg/mL)</td>
			<td>Crescent Chemical</td>
			<td>17456.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexamethasone</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>NDC6337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine

遺伝子治療は、多くの先天性肝臓の代謝異常を治療するに最適です。Ex vivo、として彼らの使用を提供する安定した遺伝子発現の宿主ゲノムに統合する能力をベクトルのために、ヒトでは、多くの造血器疾患の治療にレンチウイルスベクターを正常に使用されています。このメソッドは、肝細胞の遺伝子治療前のヴィヴォの遺伝性の tyrosinemia タイプの大型動物モデルへの応用を示します私。このプロセスは、1) 自家ドナー/受信者動物、2 から初代肝細胞の分離) レンチウイルスベクター、ポータル経由で修正された肝細胞の 3) 自家移植と肝細胞伝達を介して遺伝子配達前のヴィヴォ静脈注射。メソッドの成功は、一般的に肝切除術、単離細胞の再接が、高割合の伝達のための十分な実行可能な肝細胞の分離切除標本の取り扱い注意の効率的かつ滅菌除去に依存していて、感染を防ぐために全体の無菌手術。これらの手順のいずれかで技術的な障害は、自家移植のため導入された肝細胞実行可能な低収量やドナー/受信者動物の感染症になります。強力なに基づいて健康な細胞と小さな修正された細胞の生着率も肝臓の再作成につながるとヒト 1 型遺伝性 tyrosinemia (HT 1) このアプローチのために選択の豚モデルが一意にそのような方法に従うネイティブ病気肝細胞の選択的優位は。この成長の選択は、すべての兆候には当てはまらないだろう、このアプローチに他の適応症の拡大のための基盤は、肝臓内の両方その他の疾病に対処し、ながら、この環境の操作は、ウイルスのベクトルと的外れの毒性と腫瘍のための機会への暴露を制御します。

肝切除と移植は図 1で図式で表されます。肝切除を施行した 5 豚の代表的なコホート研究において、ほとんどの利回りがあった > 1 × 109肝細胞生存率約 80% (表 2) の任意のタイプの細胞の多くを提供する必要な操作、遺伝子を含む療法。それらの 5 を示した豚良い生存率および典型的な肝細胞の形態伝達と初期めっき (<strong cla...

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Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

このプロトコルは、自家細胞移植を介して代謝性疾患モデルを治すため豚肝細胞分離とex vivo遺伝子デリバリーを記述したものです。この特定のモデルは、成功した療法を支持するユニークな利点を楽しんでいます、アプリケーションはその他の病気と徴候に対処する関連する財団。

豚に自家移植用肝細胞Ex Vivoのレンチ ウイルス媒介性遺伝子治療

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

肝臓における代謝の生まれ変わりエラーの治療のためのEx vivo遺伝子治療および自己細胞移植は、これらの障害に対する治療に代わる重要な代替手段である。そして、これらの疾患を治療するだけでなく、治療結果を達成するために必要なバイオマスを把握することができます。このアプローチはまた、免疫抑制の重大な結果および異なるタイプの治療法による他の結果を回避する。現在の文脈では、遺伝性チロシン血症タイプ1を治療するためにこのアプローチを使用しています。しかし、これは最小限の変化で多数の異なる肝疾患を治療するためのプラットフォームアプローチになるという考え方です。移植のために実行可能な肝細胞を得るために不可欠な灌流の効率を視覚化することになると、この技術を視覚化できることが重要です。ロバート・カイザーとジョセフ・リレガードによって行われた外科的処置。ゼジ・デュ、ブルース・アミオットによって行われた細胞分離。UAU細胞の精製および細胞のex生体導入はケイトリン・ヴァンリスによって行った。動物とOR準備の準備は、カリ・アレンとローリー・ヒリンによって行われました。最初のポートサイトエントリを実行するには、麻酔の臍にオープンハッソンテクニックセファラッドを実行します, 最大 3 ヶ月, 大きな, 白い農場の豚.腹膜が見える腹腔に12ミリメートルのトロカールを導入する。トロカールが設置されたら、入り口口を通って5ミリメートル30度の範囲を通過し、水銀の15ミリメートルに二酸化炭素で腹部を窒息させます。腹腔鏡カメラで直接可視化下に、肝臓の左側面葉に三角測量を行い、さらに5ミリメートルのポートを2つ配置します。そして、1つの新しいポートに腹腔鏡を置きます。内側と左横のセグメントを分離する左葉の主要な裂け目の点で肝臓の左横セグメントを識別します。そして、この裂け目に沿って血管構造と肝静脈を確保するために外科用ホッチキスを使用してください。順次焼成と60、45、または30ミリメートルの長い血管負荷を使用して、この裂け目を通してパレンチマをトランセクトします。切除が完了したら、残った肝臓を評価して十分な止止まりを確認し、内視鏡的な把握器と内視鏡組織検索バッグを使用して肝臓セクションを取り出します。次に、ポートを取り外し、正中筋膜に割り込まれたサイズのゼロ縫合線を使用します。深い真皮層のランニング2-0縫合線。そして、閉下層に対する4〜0の縫合糸を、3層で12ミリメートルのポート切開を閉じる。次に、2~0縫合を使用して、1つの層の5ミリメートルポートを閉じます。そして、切開部に無菌ドレッシングを置きます。肝細胞の単離のために、まず、43°Cの水浴中に維持された分散液を送達するために設定された蠕動ポンプを、肝臓セクションの大きな露出した血管に置くカテーテルに接続する。ポンプとチューブを2つの溶液を灌流して、組織への灌流1と灌流2溶液の間で切り替える停止コック位置までをプライムする。そして、停止コックを灌流1位に切り替えます。その後、チューブセットの残りの部分をプライムします。組織に気泡を導入するのを防ぐために、インラインバブルトラップを完全に充填します。次に、平素の静脈枝の断面とカテーテル用の肝静脈を明らかにするために、肝循環に垂直なきれいな横切開を行います。そして、利用可能な、露出した静脈をカテーテル化するためにぴったりしたフィッティングカテーテルを使用してください。カテーテルが設置されたら、分毎に100ミリメートルの流量で1溶液を温かく灌流して、切除された肝臓組織を浸透させる。30~60秒ごとに出口管を静脈から静脈に移動する。そして、避難管を使用して、組織トレイから余分なバッファを取り除く。15〜20分間、利用可能な静脈のすべてをサイクリングした後、同じ条件下で2つの溶液を灌流に切り替えます。戻りポンプを使用して、2つの溶液をリザーバに戻してリサイクルし、より遅い流量で、組織への再投与を行う。気泡トラップの表面温度を確認し、肝臓を約5分ごとに確認して、肝細胞が寒くなっていないかどうかを確認します。約30分間の灌流の後に肝臓がブランチしたら、組織を滅菌容器に移し、滅菌ドレープで包み、肝細胞処理中に無菌性を維持するために容器を細胞培養フードに入れる。肝細胞のコラゲナーゼ分離と細胞の解離は、細胞の生存率と伝達頻度を低下させる細胞の束を得ないように完全に行う必要があります。肝臓を肝細胞洗浄媒体で水没させ、組織の上部にハサミをドラッグして肝臓カプセルを破壊する。無菌手袋を着用し、肝臓を穏やかにマッサージして肝臓細胞を培地に放出する。そして、滅菌ガーゼを介して、200ミリリットル遠心分離機ボトルに組織上清をフィルタリングします。遠心分離により濾過した肝細胞を収集します。新鮮な肝細胞洗浄媒体の150ミリリットルで細胞を2回の追加洗浄のための単一の200ミリリットルのボトルにプールします。そして、第3遠心分離後の細胞を数える。次いで、ミリリットル塩水濃度あたり9番目の肝細胞に10倍に細胞を希釈する。孤立した肝細胞の自己移植のために、超音波を介して門脈を識別し、5インチ、18ゲージの針を主な門脈に向けて、分岐に近似するために2-5メガヘルツトランスデューサーを使用する。細胞の総容積に応じて細胞を60ミリリットルのシリンジにロードし、注射器を針に取り付け、泡を導入しないように注意する。次に、注射器プランジャーをゆっくりと押し込み、移植中に注入カテーテルを使用してポータル静脈を介して9番目の肝細胞まで10倍まで手動で注入し、移植中に口腔圧をモニタリングする。すべての細胞が送達されたら、カテーテルを取り外し、超音波による血栓性イベントおよび前方流れの存在について門脈を監視する。肝切除を受けた5匹の豚の代表的なコホートでは、ほとんどが約80%の生存率を有する9番目の肝細胞に10以上の収率を有していた。遺伝子治療を含む、任意のタイプの所望の操作に十分な数の細胞を提供する。これらの調製された肝細胞の非移植部分のその後の培養は、その導入および初期めっきの46時間後に典型的な肝細胞形態を有する良好な生存率および接着性を示した。最初の生着は、移植中に再導入された細胞の数によって異なります。これらの代表的な生検は、遺伝子補正細胞拡張のタイムラインを示す。健康な細胞に対して正の選択された圧力を楽しむ遺伝性チロシン血症1型などの疾患に特有の疾患。この拡張は、通常、移植後12ヶ月で完了する。移植されたフマリア酢酸ヒドロラーゼノックアウト動物が肝臓内で補正された肝細胞の約20%の再集団を達成すると、チロシンレベルは野生型動物と比較して正常化する。未補正動物は、野生型動物と比較してアルカリホスファターゼおよびアスパラギン酸トランスアミン酵素の両方に有意な上昇を示すが、ex vivo遺伝子療法はこれらの血清酵素レベルを正常に戻す。さらに、一般的な肝臓代謝の健康は、未処理の肝細胞で再集団化した後に修正される循環アンモニアの上昇によって示されるように、未処理のノックアウトブタで破壊される。この技術を使用して、組織を慎重かつ可能な限り少なく処理し、操作することを覚えておくことが重要です。組織の取り扱いまたは操作の増加は、細胞の生存率を低下させ、収率を低下させる。このアプローチは、ウイルス導入プロトコル以外の他の技術を使用して、ラベル技術における弓分布とグラフの非効率性を研究することに興味がある人にも適用できます。ウイルスベクターを使用することは危険であり、適切なバイオ安全手順に従うだけでなく、これらの技術を使用する際には個人的な保護具を着用することが必要であることを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Medicine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

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Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Matrix-assisted Autologous Chondrocyte Transplantation for Remodeling and Repair of Chondral Defects in a Rabbit Model

ウサギモデルにおける軟骨欠陥の改造と修理のためのマトリックス支援自家軟骨細胞移植

Articular cartilage defects are considered a major health problem because articular cartilage has a limited capacity for self-regeneration 1. Untreated ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

正常温度の<em&gt;エクスビボ</em&gt;腎臓の保全のための腎臓の灌流は移植前の移植片

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...

豚に自家移植用肝細胞Ex Vivoのレンチ ウイルス媒介性遺伝子治療

豚に自家移植用肝細胞Ex Vivoのレンチウイルス媒介性遺伝子治療