Name: lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine
Uploaded: 2018-11-04T13:00:00
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저자는 전문성 수술 절차 동안 지원을 위한 포털 정 맥 주입, 스티브 Krage, 조 앤 로버츠, 그리고로 리 Hillin를 수행에 대 한 드 웨인 Meixner을 감사 합니다. 이 작품은 어린이 병원의 미네소타 기초 및 재생 의학 미네소타에 의해 지원 되었다. R.D.H. 재생 의학 경력 개발 상을 위한 NIH K01 DK106056 보너스와 메이 요 클리닉 센터를 통해 투자 되었다.

모든 동물 절차 기관 지침에 따라 수행 된 검토 하 고 연구 행위 이전 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 했다. 여기에 설명 된 절차는 수술에 적합 하 고 건강 한 것으로 간주 되는 나이의 3 개월까지 남성과 여성의 큰 백색 농장 돼지 (50 %Landrace/50% 큰 화이트 유전 배경)에 수행 했다.  동물 기관 수의 관리 직원에 의해 호환 되지 않는 것으로 간주 하지 않는 한 사회적으로 지 내게 됩...

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	<li>Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+metabolism+and+expanded+newborn+screening:+review+and+update.">Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).</li><li>Hansen, K., Horslen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+liver+disease+in+children.">Metabolic liver disease in children.</a> Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).</li><li>Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors:+from+virology+to+transgene+expression.">Viral vectors: from virology to transgene expression.</a> British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).</li><li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+basic+to+translational.">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li><li>Chowdhury, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+improvement+of+hypercholesterolemia+after+ex+vivo+gene+therapy+in+LDLR-deficient+rabbits.">Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits.</a> Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).</li><li>Elgilani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Phenotype+Characterization+of+a+Large-Animal+Model+of+Hereditary+Tyrosinemia+Type+1.">Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1.</a> The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).</li><li>Patyshakuliyeva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+utilization+and+metabolism+is+highly+differentiated+in+Agaricus+bisporus.">Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus.</a> BMC Genomics. 14, 663 (2013).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumarylacetoacetate+hydrolase+deficient+pigs+are+a+novel+large+animal+model+of+metabolic+liver+disease.">Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease.</a> Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).</li></ol>

이 보고서에는 비보 전 헌 유전자 치료 접근을 돼지 모델 HT-1의 치료를 설명 합니다. 그것은 교정 transgene 들고 lenti 바이러스 비보 전 hepatocyte 고립과 격리 hepatocytes의 변환 다음 부분 hepatectomy 포함. 수정된 헌 hepatocytes는 다음 다시 문맥8파 결핍 동물에 이식 됩니다. 설명 하는 방법을 몇 가지 수정 모든 큰 동물 모델에 적용 됩니다, 하지만 파 불충분 한 돼지는 매우 ?...

선된 천 성 간 물질 대사의 총칭 1에 800 생존 출생1만큼 영향을 미치는 유전 질환의 가족입니다. 이 질병의 많은 단일 유전자 결함2 고 hepatocytes3의 충분 한 수에 영향을 받는 유전자의 단일 수정 된 복사본을 도입 하 여 기능적으로 치료 될 수 있습니다. 수정 해야 hepatocytes의 실제 비율 질병4 에 의해 변화 하 고 인코딩, 단백질 세포질 대 예 배설된 단백질의 특성에 크게 좌우 됩니다. 대부분의 경우, 신진 대사 질환에 대 한 어떤 치료의 효능은 순환에서 자주 사용할 수 있는 바이오 마커의 존재를 통해 쉽게 분석 됩니다.
HT-1은 fumarylacetoacetate 가수분해 효소 (파)5결함, 티로신 물질 대사6의 마지막 효소 단계에서 결과 간 대사의 선천적인된 오류가. 파 결핍 리드 빌드 급성 간 기능 장애 및 사망을 일으킬 수 있습니다 또는 질병의 만성 모양에서 경 변 증 및 간세포 암 하면 간 독성 대사 산물의. 질병은 임상 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), 효소 상류 파의 티로신 물질 대사에서의 작은 분자 억제 물의 행정에 의해 관리 됩니다. Hepatocytes의도 적은 수의 성공적인 교정 결국 모두 크고 작은 동물 모델에 수정 된 셀의 전체 간 repopulation에 발생 질병 유전자 치료 방법, 테스트할 수 있는 이상적인 환경을 제공 합니다. 7 , 8.이 때문에 발생 합니다 수정 세포는 깊은 생존 이점을 독성 대사 산물의 축적으로 인해 수정 되지 않은 셀에서 후자. 수정 되지 않은 hepatocytes의 손실 수 있습니다 수정된 hepatocytes의 선택적 확장 간 재생 용량와 일치. 치료는 쉽게 순환 이식 다음 티로신 및 succinylacetone 수준에 감소를 측정 하 여 다음 수 있습니다.
부분 hepatectomy 포함, 절차의 침략 적인 본질을 정당화 하기 위해이 방법의 목표 내구성 치료 해야 합니다. 따라서, 복제 무능 한 lentiviral 벡터 때문에 그들은 안정적으로 hepatocyte 게놈9를 통합할 것 이다 데 사용 됩니다. 간으로 모든 딸 세포에는 수정 된 유전자의 배달 보장 성장 하 고 확장 합니다 수정 되지 않은 세포의 급속 한 손실 대체. 이 주로 유사 분열10 주만 치료의 어떤 효력 든 지 그로 인하여 잃는 동안 단일 딸 세포에 전달 될 수 있는 episomes로 존재 adeno 관련 바이러스 (AAV) 벡터에 유리 하다.
문학의 성장 시체 위에 lentivirus11, 관심사의 안전 지원 하지만 차적인 이벤트 환경 제어 생체 외에서 호스트 셀 변환 제한 하 여 완화 됩니다. 이 방법은 수행 되는 문맥을 통해 헌 이식으로 다시 소개 될 hepatocytes에 노출 제한 무료 벡터 적 체계적으로 호스트에 도입 되었습니다.
이 보고서는 수술의 방법 및 절차 ex vivo 유전자 치료 비보 전 을 위한 hepatocytes와 HT-1 돼지8의 치료에 대 한 후속 헌 이식12 를 격리 하는 데 사용에 대해 설명 합니다. 1) 부분 hepatectomy hepatocytes와 호스트의 간 성장 자극의 근원, 2) 삭제 간 뒤에 ex vivo 유전자 보정, 그리고 마지막으로 3)의 재 소개부터에서 hepatocytes의 절연 역할을 포함 하는 전체 프로세스는 수정된 hepatocytes 호스트에 다시. 설명 하는 방법을 몇 가지 수정, 모든 큰 동물 모델에 적용 됩니다 하지만 파 불충분 한 돼지13 수정된 hepatocytes에 대 한 선택적 환경 활용 해야한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC)</td>
			<td style="width:139px;">Yecuris</td>
			<td style="width:127px;">20-0027</td>
			<td style="width:109px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B12STS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B5SHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 60</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA60AMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 45</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA45AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 30</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>SIG30AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo catch bag</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>173050G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0 PDS</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z340H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J459H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J426H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dermabond</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Sterile Dressing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Williams&#8217;-E Powder&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ME16060P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8875-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1679-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA (g/L)</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>45172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(N-A-C, g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2 2H2O (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D (mg/mL)</td>
			<td>Crescent Chemical</td>
			<td>17456.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexamethasone</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>NDC6337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine

유전자 치료는 치료 많은 선된 천 성 간 물질 대사의 이상적인 선택 이다. Ex vivo, lentiviral 벡터 사용 되었습니다 성공적으로 인 간에, 많은 조 혈 질환의 치료에 그들의 사용은 주인 게놈으로 통합 하는 벡터의 능력으로 인해 안정적인 transgene 식으로. 이 메서드는 유전 tyrosinemia 형식의 큰 동물 모델에 ex vivo 유전자 치료 hepatocytes의의 응용 프로그램을 보여 줍니다 나. 헌 혈 기증자/받는 동물, 2에서에서 기본 hepatocytes의 1) 절연 이루어져이 프로세스) ex vivo 유전자 배달 hepatocyte 변환 lentiviral 벡터와 포털을 통해 수정된 hepatocytes의 3) 헌 식을 통해 사출 맥락 메서드의 성공 일반적으로 간 절제, 격리 된 셀의 다시 engrafting, 높은 백분율 변환에 대 한 충분 한 실행 가능한 hepatocytes의 격리에 대 한 삭제 견본 취급 주의의 효율적이 고 살 균 제거에 의존 하 고 전체 감염을 방지 하기 위해 무 균 수술 절차입니다. 이 단계에서 기술적인 실패 자가 이식 가능한 불리고 hepatocytes의 낮은 수익률 또는 기증자/받는 사람 동물의 감염 발생 합니다. 인간의 유형 1 유전 tyrosinemia (HT-1)이이 접근에 대 한 선택의 돼지 모델은 이러한 메서드를 고유 하 게 의무가 engraftment 수정된 세포의 심지어 작은 비율 간 repopulation 건강 한 세포는 강력한 기반으로 이어질 것으로 기본 병 hepatocytes에 선택적인 이점입니다. 성장 선택이 모든 표시에 대 한 사실이 되지 않을 것입니다, 하지만이 방법은 다른 표시로 확장을 위한 기초 이며 추가 질병, 간 내에서 모두 해결 하 고 넘어, 동안에이 환경 조작할 수 있습니다. 바이러스 성 벡터와 오프 대상 독성 및 tumorigenicity에 대 한 기회에 대 한 노출 제어.

간 절제 및 자가 이식 개요로 그림 1에 표시 됩니다. 5 돼지 간 절제 수술의 대표적인 일대에 대부분의 수확량 했다 > 1 x 109 hepatocytes 약 80% 생존 (표 2)와 함께 모든 종류의 많은 셀을 제공 하는 조작, 유전자를 포함 하 여 원하는 치료입니다. 각 그 5 돼지 보여 좋은 생존 및 접착, 전형적인 hepatocyte 형태학 46 시간 후에 변환 및 초기 ?...

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Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

이 프로토콜은 돼지 hepatocyte 격리와 ex vivo 유전자 배달 모델 autologous 세포 이식 통해 대사 질환의 치료를 설명 하는 위한 것입니다. 이 특정 모델은 성공적인 치료를 선호 하는 독특한 장점, 있지만 응용 프로그램은 추가 질병 징후를 해결 하기 위해 관련 기초 이다.

돼지에서 자가 이식 Hepatocytes 전 비보 의 lentiviral 벡터 중재 된 유전자 치료

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

간에서 신진 대사의 태아 오류의 치료를위한 Ex 생체 유전자 치료 및 자가 세포 이식은 이러한 장애에 대한 치료에 중요한 대안이다. 그리고 우리는 이러한 장애를 치료 할뿐만 아니라 치료 결과를 달성하는 데 필요한 바이오 매스를 알아낼 수 있습니다. 이 접근은 또한 면역 억제의 중요한 결과 및 치료의 다른 모형을 가진 그밖 결과를 피합니다.현재 문맥에서, 우리는 유전 티로시혈증 타입 1을 취급하기 위하여 이 접근법을 사용하고 있습니다. 그러나, 아이디어는이 최소한의 변경으로 다른 간 질환의 무리를 치료하는 플랫폼 접근 방식이 될 것입니다. 이식을 위해 실행 가능한 간세포를 얻는 데 필수적인 관류의 효율성을 시각화할 때 약간의 가변성이 있기 때문에 이 기술을 시각화할 수 있어야 합니다.로버트 카이저와 조셉 릴레가드에 의해 수행 수술. 세포 격리는 지지 두, 브루스 아미오트에 의해 수행. UAU 세포 정화 및 세포의 전 생체 변환은 케이틀린 반리스에 의해 수행되었다.동물과 OR 준비의 준비는 카리 앨런과 로리 힐린에 의해 수행되었다. 초기 포트 사이트 항목을 수행하려면 최대 3 개월 된 대형 흰색 농장 돼지의 마취에 열려있는 Hasson 기술을 수행하십시오. 복강이 보이는 복강에 12mm 트로카를 도입합니다.트로카가 제자리에 있을 때, 진입 항을 통해 5밀리미터 30도 범위를 통과하고 이산화탄소로 복부를 15밀리미터의 수은으로 부수시게 합니다. 복강경 카메라로 직접 시각화하는 과정에서 2개의 5mm 포트를 추가로 배치하여 간 왼쪽 측면 엽에 삼각측량합니다. 그리고 하나의 새로운 포트에 복강경을 배치합니다.내측 및 왼쪽 측면 세그먼트를 분리하는 왼쪽 엽의 주요 균열 지점에서 간 왼쪽 측면 세그먼트를 식별합니다. 그리고 외과 스테이플러를 사용하여 혈관 구조와 이 균열을 따라 간 정맥을 확보하십시오. 순차적 발사 및 60, 45 또는 30mm 길이의 혈관 하중을 사용하여이 균열을 통해 parenchyma를 경유하십시오.절제술이 완료되면, 적절한 hemostasis를 보장하고 내시경 손아그및 내시경 조직 검색 가방을 사용하여 간 섹션을 검색하기 위해 남은 간을 평가합니다. 이제 포트를 제거하고 중간 선 근막에 대해 중단된 크기 0 봉합사를 사용합니다. 깊은 진피 층을 위한 2-0 봉합사.그리고 피하 층을 위한 4-0 봉합사를 실행하여, 3층에서 12밀리미터 포트 절개를 닫는다. 그런 다음 2-0 봉합사로 한 층에서 5mm 포트를 닫습니다. 그리고 절개에 멸균 드레싱을 놓습니다.간세포 절연을 위해 먼저 43도섭씨급수조로 유지된 분산 용액을 전달하는 연동 펌프세트를 간 단면의 크고 노출된 용기에 배치할 카테터에 연결한다. 관류 2개의 용액으로 펌프와 튜브를 프라임, 관류 하나 및 관류 두 용액 전달 사이를 전환하는 스톱 콕 위치까지. 그리고 스톱 콕을 관류 1 위치로 전환합니다.그런 다음 튜빙 세트의 나머지 부분을 프라임합니다. 조직에 기포를 도입하는 것을 방지하기 위해 인라인 버블 트랩을 완전히 채웁니다. 다음으로, 깨끗한 횡방향 절개를 하고, 간 순환에 수직으로 하여, 카테터화를 위한 포탈 정맥 가지의 단면을 드러내는다.그리고 사용 가능한, 노출 된 정맥을 카테터화하는 아늑한 피팅 카테터를 사용합니다. 카테터가 제자리에 있을 때, 분당 100밀리미터의 용액으로 절제된 간 조직을 따뜻한 관류 1개의 용액으로 퍼펫합니다. 콘센트 튜브를 정맥에서 정맥으로 30초에서 60초마다 이동합니다.그리고 피난 튜브를 사용하여 티슈 트레이에서 과도한 버퍼를 제거합니다. 15~20분 동안 사용 가능한 모든 정맥을 순환한 후 동일한 조건에서 두 가지 용액으로 전환하십시오. 리턴 펌프를 사용하여 관류 2개의 용액을 저수지로 다시 재활용하여 느린 유량으로 조직내재투여한다.거품 트랩의 표면 온도 및 간을 약 5분마다 확인하여 간세포가 차가워지지 않는지 확인합니다. 간관은 약 30분간 의 관류 후, 멸균 드랩으로 감싼 멸균 용기에 조직을 옮기고, 간세포 처리 중 멸균을 유지하기 위해 용기를 세포 배양 후드에 넣습니다. 간세포와 세포 분리의 콜라겐아제 분리는 완전히 수행되어야하므로 세포와 트랜스 듀피의 생존가능성을 감소시키는 세포의 응집력을 얻지 못합니다.간 세포 세척 매체와 간 을 침수 하 고 간 캡슐을 방해 하는 조직의 상단에 걸쳐 가위를 드래그. 멸균 장갑을 착용하고 간을 부드럽게 마사지하여 간장을 중간 크기로 방출합니다. 그리고 멸균 거즈를 통해 200 밀리리터 원심분리기 병으로 조직 상류체를 필터링합니다.원심분리에 의해 여과된 간구를 수집합니다. 신선한 간세포 세척 매체의 150 밀리리터에 세포를 풀링하여 2개의 추가 세척을 위해 2개의 추가 세척을 위한 단일 200 밀리리터 병으로 합니다. 그리고 세 번째 원심 분리 후 세포를 계산.그런 다음, 밀리리터 식염수 농도당 9번째 간세포로 세포를 1회 10배까지 희석시한다. 격리된 간세포의 자동 이식을 위해 2-5메가헤르츠 트랜스듀서를 사용하여 초음파를 통해 포문 정맥을 식별하고 5인치, 18게이지 바늘을 주 포털 정맥쪽으로 지시합니다. 총 세포 부피에 따라 60 밀리리터 주사기에 세포를 로드하고 주사기를 바늘에 부착하여 거품을 유발하지 않도록 주의하십시오.다음으로, 주사기 플런저를 천천히 우울하여 이식 중에 포알 압력을 모니터링하기 위해 주입 카테터를 사용하여 포털 정맥을 통해 1배에서 9번째 간세포까지 수동으로 주입한다. 모든 세포가 전달되면 카테터를 제거하고 혈전 증시의 존재와 초음파에 의한 전진 흐름을 위해 포털 정맥을 모니터링하십시오. 간 절제술을 받은 돼지 5마리의 대표적인 코호트에서는 대부분 10대에서 9번째 간세포까지 약 80%의 생존율을 보였습니다.유전자 치료를 포함하여 원하는 조작의 모든 모형을 위한 세포의 충분한 수를 제공합니다. 이들 준비된 간세포의 비이식 부분의 후속 배양은, 그들의 트랜스듀션 및 초기 도금 후에 전형적인 간구 체형 모폴로지 46시간 후에 좋은 생존력 과 접착을 보여주었습니다. 초기 이식은 이식 중에 재도입된 세포의 수에 따라 달라집니다.이 대표적인 생검은 유전자 보정된 세포 확장의 타임라인을 보여줍니다. 건강한 세포에 대한 양수 선택 압력을 즐기는 유전 티로시혈증 제 1형과 같은 질병에 국한되어 있습니다. 이 확장은 일반적으로 이식 후에 12 달 완료됩니다.이식된 fumarylacetoacetate 하이드로라세테이트 수압 녹아웃 동물이 간 내의 교정 된 간세포의 약 20 %의 재인구를 달성하면 티로신 수준은 야생 형 동물에 비해 정상화됩니다. 교정되지 않은 동물은 야생 형 동물에 비해 알칼리성 인산염과 아스파트 아파르타트 트랜스 아미나아제 모두에서 상당한 고도를 나타내지만, 전 생체 유전자 치료는 이러한 혈청 효소 수준을 정상으로 반환합니다. 또한, 일반적인 간 대사 건강은 치료된 간세포로 재인구 후 교정되는 순환 암모니아의 고도에 의해 표시된 바와 같이 치료되지 않은 녹아웃 돼지에서 중단된다.이 기술을 사용하여 조직을 가능한 한 적게 처리하고 조작하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 조직의 처리 또는 조작이 증가하면 세포의 생존가능성을 감소시키고 수율을 감소시깁니다. 이 접근 방식은 바이러스 성 트랜스듀션 프로토콜 이외의 다른 기술을 사용하여 라벨링 기술의 활 분포 및 그래프 비효율성을 연구하는 데 관심이 있는 사람들에게도 적용될 수 있습니다.바이러스 벡터로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 적절한 생체 안전 절차를 따르고 이러한 기술을 사용할 때 개인 보호 장비를 착용하는 것이 필요합니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

환자 조직 및 유전자 전달의 시험 전의 VIVO 문화

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

연구

의학

In Vivo Canine Muscle Function Assay

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VIVO 개 근육 기능 분석에

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

면역 결함 마우스의 확립과 인간 Retinoblastoma 종양의 전파

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

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암의 생산 및 반응 산소 종의 감지 (ROS)

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

태아 마우스 모델에서 Bioactive 에이전트의 Intratracheal 관리를위한 소설 외과 접근

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

도우미에 의존 Adenoviral 벡터로 인한 유전자의 전송에 의한 당뇨 쥐의 간에서 네오 - 작은 섬 형성

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Matrix-assisted Autologous Chondrocyte Transplantation for Remodeling and Repair of Chondral Defects in a Rabbit Model

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Articular cartilage defects are considered a major health problem because articular cartilage has a limited capacity for self-regeneration 1. Untreated ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

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The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

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기증자의 간을의 현지 외 정상 체온 기계 관류

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

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정상 체온<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 신장의 보존을위한 신장 관류는 이식 전에 이식

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...