Name: lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine
Uploaded: 2018-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine at JoVE.com

Forfatterne takker Duane Meixner for kompetanse i å utføre i portalen blodåre injeksjon, Steve Krage, Joanne Pederson og Lori Hillin for støtte under de kirurgiske prosedyrene. Dette arbeidet ble støttet av barnas Hospital of Minnesota Foundation og regenerativ medisin Minnesota. R.D.H. ble finansiert gjennom en NIH K01 DK106056 pris og et Mayo Clinic for regenerativ medisin karriere Development Award.

Alle dyr prosedyrer blir ble utført institusjonelle retningslinjer og gjennomgått og godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) før studie oppførsel. Prosedyrene som er beskrevet her ble utført på mannlige og kvinnelige store hvite jorbruk pigs (50% Landrace/50% store hvite genetisk bakgrunn) opp til 3 måneder gammel som anses sunt og passer for kirurgi.  Dyrene ligger sosialt med mindre betraktes som inkompatible av institusjonelle veterinary bekymre ansatte.  Dyr er matet riktig nivå av...

<ol>
	<li>Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+metabolism+and+expanded+newborn+screening:+review+and+update.">Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).</li><li>Hansen, K., Horslen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+liver+disease+in+children.">Metabolic liver disease in children.</a> Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).</li><li>Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+for+inborn+errors+of+metabolism:+advancing+towards+the+clinic.">Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic.</a> BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).</li><li>Brunetti-Pierri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+inborn+errors+of+liver+metabolism:+progress+towards+clinical+applications.">Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications.</a> Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).</li><li>Carlson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+TALEN-mediated+gene+knockout+in+livestock.">Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).</li><li>Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+enzymic+defects+in+hereditary+tyrosinemia.">On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+3-dimensional+imaging+of+liver+regeneration+in+a+mouse+model+of+hereditary+tyrosinemia+type+1+using+the+sodium+iodide+symporter+gene.">Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene.</a> Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curative+ex+vivo+liver-directed+gene+therapy+in+a+pig+model+of+hereditary+tyrosinemia+type+1.">Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1.</a> Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).</li><li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272 (5259), 263-267 (1996).</li><li>Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors:+from+virology+to+transgene+expression.">Viral vectors: from virology to transgene expression.</a> British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).</li><li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+basic+to+translational.">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li><li>Chowdhury, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+improvement+of+hypercholesterolemia+after+ex+vivo+gene+therapy+in+LDLR-deficient+rabbits.">Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits.</a> Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).</li><li>Elgilani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Phenotype+Characterization+of+a+Large-Animal+Model+of+Hereditary+Tyrosinemia+Type+1.">Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1.</a> The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).</li><li>Patyshakuliyeva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+utilization+and+metabolism+is+highly+differentiated+in+Agaricus+bisporus.">Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus.</a> BMC Genomics. 14, 663 (2013).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumarylacetoacetate+hydrolase+deficient+pigs+are+a+novel+large+animal+model+of+metabolic+liver+disease.">Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease.</a> Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).</li></ol>

Denne rapporten beskriver en ex vivo autologous gene terapi tilnærming for å kurere en porcine modell av HT-1. Det innebærer en delvis hepatectomy, etterfulgt av ex vivo hepatocyte isolasjon og signaltransduksjon isolert hepatocytes med lenti virus bærer den korrigerende transgene. Korrigert autologous hepatocytter er deretter transplanted til FAH mangelfull dyret til portalen blodåre8. Selv om metoden beskrevet gjelder alle store dyr modeller med noe modifisering, har FAH d...

Medfødte feil av metabolism av leveren er en familie av genetiske sykdommer som kollektivt påvirker så mange som 1 i 800 levendefødte1. Mange av disse sykdommene er ett gen mangler2 og funksjonelt kan kureres ved å introdusere én korrigert kopi av berørte genet til et tilstrekkelig antall hepatocytter3. Den faktiske prosenten av hepatocytter som må rettes varierer fra sykdom4 , og er svært avhengig av typen protein det koder, for eksempel utskilles proteiner versus cytoplasmatiske. I de fleste tilfeller er effekten av behandling for metabolsk sykdom lett assayed gjennom tilstedeværelse av biomarkers ofte tilgjengelig i sirkulasjon.
HT-1 er en medfødt feil av metabolismen av leveren som skyldes en feil i fumarylacetoacetate hydrolase (FAH)5, siste enzymatisk trinn i tyrosin metabolisme6. FAH mangel fører til bygge av giftige metabolitter i leveren som kan forårsake akutt leversvikt og død eller i kronisk form av sykdommen kan føre til skrumplever og hepatocellulært karsinom. Sykdommen er klinisk styrt av administrasjonen av 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), et lite molekyl inhibitor av et enzym oppstrøms av FAH i tyrosin metabolisme. Sykdommen gir et ideelt miljø å teste gene terapi metoder, som vellykket korrigering av selv en liten antallet av hepatocytter vil resultere i repopulation i hele leveren med korrigert celler i både små og store dyr modeller 7 , 8. Dette skjer fordi korrigert celler har en dyp overlevelse fordel over uncorrected celler på grunn av opphopning av giftige metabolitter i sistnevnte. Tap av uncorrected hepatocytter tillater selektiv ekspansjon korrigert hepatocytes samsvar med regenerativ kapasiteten til leveren. Behandling kan lett følges ved å måle nedgangen i sirkulerende tyrosin og succinylacetone nivåer etter transplantasjon.
For å rettferdiggjøre invasiv art på prosedyren, som inneholder en delvis hepatectomy, må målet av denne tilnærmingen være en holdbar kur. Derfor brukes replikering inkompetente lentiviral vektorer fordi de vil stabilt integrere i hepatocyte genomet9. sikre levering av korrigert genet til alle datter celler som leveren vokser og utvides for å erstatte rask tap uncorrected celler. Dette er en fordel over adeno assosiert virus (AAV) vektorer, som hovedsakelig finnes som episomes bare kan bli sendt til en enkeltcelle datter under mitose10 og dermed miste noen effekt av terapi i løpet av uker.
Selv om en økende mengde litteratur støtter sikkerheten til lentivirus11, bekymringer over kontrollere gentoksisk hendelser ved å begrense Albin på verten cellene til et kontrollert i vitro miljø. Gratis vector er aldri systemisk introdusert til verten når denne metoden utføres, begrense eksponering for hepatocytter som vil bli re-introdusert med autolog transplantasjon via portalen blodåre.
Denne rapporten beskriver metoden for den kirurgiske og ex vivo prosedyrer brukes til å isolere hepatocytter for gene terapi ex vivo og påfølgende autolog transplantasjon12 for behandling av HT-1 gris8. Den fullstendige prosessen inkluderer 1) en delvis hepatectomy som fungerer som en kilde til hepatocytter og vekst stimulans for vertens leveren, 2) isolering av hepatocytter fra forbrukeravgift leveren etterfulgt av ex vivo genet korreksjon, og til slutt 3) gjeninnføring av den korrigert hepatocytter tilbake til verten. Metoden beskrevet gjelder alle store dyr modeller med noen endring, men bare FAH dårlig gris13 vil ha fordelen av selektiv miljøet for korrigert hepatocytter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC)</td>
			<td style="width:139px;">Yecuris</td>
			<td style="width:127px;">20-0027</td>
			<td style="width:109px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B12STS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B5SHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 60</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA60AMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 45</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA45AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 30</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>SIG30AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo catch bag</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>173050G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0 PDS</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z340H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J459H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J426H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dermabond</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Sterile Dressing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Williams&#8217;-E Powder&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ME16060P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8875-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1679-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA (g/L)</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>45172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(N-A-C, g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2 2H2O (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D (mg/mL)</td>
			<td>Crescent Chemical</td>
			<td>17456.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexamethasone</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>NDC6337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine

Genterapi er et ideelt valg å kurere mange medfødte feil av metabolism i leveren. Ex-vivo, lentiviral vektorer har blitt brukt med hell i behandlingen av mange blodkreft sykdommer hos mennesker, som deres bruk tilbyr stabile transgene uttrykket på grunn av vektoren evne til å integrere i vert genomet. Denne metoden viser bruk av ex vivo genterapi hepatocytes til en stor dyr modell av arvelige tyrosinemia type jeg. Denne prosessen består av 1) isolasjon primære hepatocytes fra autologous donor/mottaker dyret, 2) ex vivo gen levering via hepatocyte signaltransduksjon med lentiviral vektor og 3) autolog transplantasjon korrigert hepatocytes via portalen vene injeksjon. Suksessen til metoden generelt avhengig av effektiv og sterile fjerning av leveren resection, forsiktig håndtering av forbrukeravgift prøven for isolering av levedyktig hepatocytter tilstrekkelig for nytt engrafting, høy andel signaltransduksjon isolert cellene, og aseptiske kirurgiske prosedyrer gjennom å hindre infeksjon. Teknisk svikt på noen av disse trinnene vil føre lav yield hepatocytes levedyktig transduced for autolog transplantasjon eller infeksjon av donor/mottaker dyret. Gris modell av menneskelig type 1 arvelig tyrosinemia (HT-1) valgt for denne tilnærmingen er unikt mottakelig for slik metode, som selv en liten prosentandel av engraftment korrigert celler vil føre til repopulation i leveren sunn cellene basert på en kraftig selektiv fordel over native-syke hepatocytter. Selv om dette vekst valget ikke vil være sant for alle indikasjoner, denne tilnærmingen er et grunnlag for ekspansjon i andre indikasjoner og gir mulighet for manipulasjon av dette miljøet å ta flere sykdommer, både i leveren og utover, mens kontrollere for eksponering for viral vektor og mulighet for off-målet giftighet og tumorigenicity.

Leveren resection og autolog transplantasjon er representert skjematisk i figur 1. I en representant kohort av 5 griser som gjennomgikk hepatic resection, de fleste hadde avkastning av > 1 x 109 hepatocytter med ca 80% levedyktighet (tabell 2), sørger for mange celler for alle typer ønsket manipulasjoner, inkludert gen terapi. Etterfølgende kultur av ikke-transplanted delen forberedt hepatocytes fra hver av de 5 griser viste god...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine at JoVE.com

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Denne protokollen er ment å beskrive svin hepatocyte isolasjon og ex vivo gen levering å kurere modeller av metabolske sykdommer via autologous cellen transplantasjon. Selv om denne modellen har unike fordeler som favoriserer vellykket behandling, er programmet et relevant grunnlag for å ta flere sykdommer og indikasjoner.

Lentiviral Vector-mediert genterapi av hepatocytter Ex Vivo for autolog transplantasjon i svin

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

Ex vivo genterapi og autolog celletransplantasjon for behandling av medfødte metabolismefeil i leveren er et viktig alternativ til terapi for disse lidelsene. Og tillater oss å ikke bare behandle disse lidelsene, men finne ut biomassen som er nødvendig for å kunne oppnå et terapeutisk resultat. Denne tilnærmingen unngår også de betydelige konsekvensene av immunsuppresjon og andre konsekvenser med ulike typer terapier.I dagens sammenheng bruker vi denne tilnærmingen til å behandle arvelig tyrosinemi type 1. Men ideen er at dette vil være en plattform tilnærming til å behandle en rekke forskjellige leversykdommer med minimal endring. Det er viktig å kunne visualisere denne teknikken fordi det er noe variasjon når det gjelder å visualisere effektiviteten av perfusjonen, noe som er viktig for å få levedyktige hepatocytter for transplantasjonen.Kirurgisk prosedyre utført av Robert Kaiser og Joseph Lillegard. Celleisolasjon utført av Zeji Du, Bruce Amiot. UAU cellerensing og ex vivo transduksjon av cellene ble gjort av Caitlin VanLith.Utarbeidelse av dyrene og OR prep ble gjort av Kari Allen og Laurie Hillin. For å utføre den første portstedet oppføring, utføre en åpen Hasson teknikk cephalad til navlestrengen av en bedøvet, opptil tre måneder gammel, stor, hvit gård gris. Vi presenterer en 12 millimeter trocar i bukhulen, hvor bukhinnen er synlig.Når trokaren er på plass, pass et 5 millimeter 30 graders omfang gjennom inngangsporten og utåle magen med karbondioksid til 15 millimeter kvikksølv. Under direkte visualisering med laparoskopisk kamera, plasser 2 ekstra 5 millimeter porter, triangulerende på venstre lateral lobe av leveren. Og plasser laparoskopet i en av de nye portene.Identifiser venstre lateral segment av leveren på punktet av den store sprekken i venstre lobe som skiller mediale og venstre laterale segmenter. Og bruk en kirurgisk stiftemaskin for å sikre de vaskulære strukturene og levervenen langs denne sprekken. Transekte parenchyma gjennom denne sprekken ved hjelp av sekvensielle avfyringer og 60, 45 eller 30 millimeter lange vaskulære belastninger.Når reseksjonen er fullført, vurdere restleveren for å sikre en tilstrekkelig hemostase og bruke endoskopiske gripere og en endoskopisk vev gjenfinning bag for å hente leveren delen. Nå, fjerne portene og bruke en avbrutt størrelse null sutur for midline fascia. En løpende 2-0 sutur for det dype dermallaget.Og en løpende 4-0 sutur for subcuticular laget, for å lukke 12 millimeter port snitt i de tre lagene. Lukk deretter de fem millimeterportene i ett lag med 2-0 suturer. Og plasser en steril dressing på snittene.For hepatocyte isolasjon, først koble en peristaltisk pumpe satt til å levere dispergeringsløsninger, vedlikeholdt i en 43 grader Celsius vannbad, til katetrene som skal plasseres i de store, eksponerte fartøyene i leverseksjonen. Prime pumpen og slangen med perfusjon to løsning, opp til en stopp kuk posisjon for å bytte mellom perfusjon en og perfusjon to løsning levering til vevet. Og bytt stoppkranen til perfusjonen en posisjon.Deretter prime resten av rørsettet. Fyll en inline boblefelle helt for å forhindre innføring av luftbobler i vevet. Deretter gjør du et rent tverrgående snitt, vinkelrett på leversirkulasjonen for å avsløre tverrsnitt av portalvenegrenene og leverårene for kateterisering.Og bruk et tettsittende kateter for å kateterisere de tilgjengelige, eksponerte venene. Når kateterene er på plass, perfuse resected levervev med varm perfusjon en løsning på en 100 millimeter per minutt strømningshastighet. Flytting av utløpsrøret fra vene til vene hvert 30 til 60 sekund.Og ved hjelp av et evakueringsrør for å fjerne overflødig buffer fra vevsbrettet. Etter å ha syklet gjennom alle tilgjengelige årer i 15 til 20 minutter, bytt til perfusjon to løsning under samme forhold. Bruk en returpumpe til å resirkulere perfusjonen to oppløsning tilbake til reservoaret, med en langsommere strømningshastighet, for re-administrasjon i vevet.Kontroller overflatetemperaturen i boblefellen og, eller leveren omtrent hvert femte minutt for å bekrefte at hepatocytter ikke blir kalde. Når leveren blanches etter ca 30 minutter med perfusjon, overføre vevet til en steril beholder, innpakket med en steril drapering, og plasser beholderen i en cellekultur hette for å opprettholde sterilitet under hepatocyte behandling. Kollagenaseisolasjonen av hepatocytter og celledisassociation må gjøres helt slik at du ikke får klumping av cellene som reduserer levedyktigheten til cellene og transduksjonsfrekvensen.Senk leveren med hepatocytt vaske medium og dra saks over toppen av vevet for å forstyrre leverkapselen. Iført sterile hansker, masser forsiktig leveren for å frigjøre hepatocytter inn i mediet. Og filtrer vevets supernatant, gjennom steril gasbind, i 200 milliliter sentrifugeflasker.Samle de filtrerte hepatocytter ved sentrifugering. Pooling cellene i 150 milliliter frisk hepatocytt vaske medium i en enkelt 200 milliliter flaske for 2 ekstra vasker. Og telle cellene etter den tredje sentrifugeringen.Deretter fortynner cellene til 1 ganger 10 til niende hepatocytter per milliliter saltvannskonsentrasjon. For autotransplantasjon av de isolerte hepatocytter, bruk en to-fem megahertz transduser for å identifisere portalvenen via ultralyd og rett en fem-tommers, 18-gauge nål mot hovedportalvenen, omtrent til bifurcation. Legg cellene i en 60 milliliter sprøyte, i henhold til det totale cellevolumet og fest sprøyten til nålen, og ta vare på å ikke introdusere bobler.Deretter senker du sakte sprøytestempelet for å sette inn opptil 1 ganger 10 til niende hepatocytter gjennom portalvenen ved hjelp av et infusjonskateter for å overvåke poraltrykket under transplantasjonen. Når alle cellene er levert, fjern kateteret og overvåk portalvenen for tilstedeværelse av trombotiske hendelser og fremoverstrømning ved ultralyd. I en representativ kohort av fem griser, som gjennomgikk leverreksjon, hadde de fleste utbytter på mer enn 10 til niende hepatocytter med ca 80% levedyktighet.Gir et tilstrekkelig antall celler for enhver type ønsket manipulasjon, inkludert genterapi. Påfølgende kultur av den ikke-transplanterte delen av disse forberedte hepatocytter, viste en god levedyktighet og vedheft med en typisk hepatocyte morfologi 46 timer etter transduksjon og innledende plating. En innledende engraftment vil variere etter antall celler gjeninnført under transplantasjonen.Disse representative biopsiene viser en tidslinje for gen corrected celleutvidelse. Unik for sykdommer, som arvelig tyrosinemi type 1, som nyter et positivt valgt trykk for friske celler. Denne utvidelsen er vanligvis fullført 12 måneder etter transplantasjon.Når en transplantert fumarylacetoacetate hydrolase knockout dyr har oppnådd ca 20% re-populasjon av korrigerte hepatocytter i leveren, tyrosin nivåer vil normalisere sammenlignet med vill-type dyr. Mens ukorrigerte dyr viser en signifikant økning i både alkalisk fosfatase og aspartattransaminase sammenlignet med ville dyr, returnerer ex vivo genterapi disse serumenzymnivåene til normale. Videre er den generelle leverens metabolske helse forstyrret i ubehandlede knockout griser, som indikert av økninger i sirkulerende ammoniakk som korrigeres etter re-populasjon med behandlede hepatocytter.Det er viktig å huske med å bruke denne teknikken til å håndtere og manipulere vevet nøye og så lite som mulig. Økt håndtering eller manipulering av vevet, fører til redusert levedyktighet av cellene og redusere utbyttet. Denne tilnærmingen kan også gjelde for personer som er interessert i å studere buefordeling og grafeffektivitet i merkingsteknikker, ved hjelp av andre teknikker utenfor virale transduksjonsprotokoller.Ikke glem at det kan være farlig å arbeide med virale vektorer, så det er nødvendig å følge riktige biosikkerhetsprosedyrer, samt bruk av personlig verneutstyr når du bruker disse teknikkene.

Research

JoVE Journal

Medicine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Produksjon og Påvisning av reaktive oksygen arter (ROS) i Kreft

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Neo-Islet Dannelse i leverskader av diabetiske mus med Helper-avhengig adenovirusvektor-mediert genoverføring

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Matrix-assisted Autologous Chondrocyte Transplantation for Remodeling and Repair of Chondral Defects in a Rabbit Model

Matrix-assistert Autolog kondrocytt Transplantasjon for ombygging og reparasjon av chondral Defekter i et Rabbit Model

Articular cartilage defects are considered a major health problem because articular cartilage has a limited capacity for self-regeneration 1. Untreated ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normotermisk<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Nyre Perfusjons for Bevaring av Kidney grafts før Transplantasjon

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...