Name: lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine
Uploaded: 2018-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine at JoVE.com

Авторы благодарят Дуэйн Meixner за профессионализм в выполнении инъекций воротной вены, Стив Краке, Джоан Педерсон и Лори Hillin для поддержки во время хирургических процедур. Эта работа была поддержана Детская больница Миннесота фонда и регенеративной медицины Миннесота. R.D.H. финансировалась через центр клиники Майо и NIH K01 DK106056 награду для регенеративной медицины премии развития карьеры.

Все животные процедуры были проведены в соответствии с институциональных руководящих принципов и были рассматриваются и утверждаются институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) до проведения исследования. Описанные здесь процедуры выполнялись на мужские и женские ...

<ol>
	<li>Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+metabolism+and+expanded+newborn+screening:+review+and+update.">Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).</li><li>Hansen, K., Horslen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+liver+disease+in+children.">Metabolic liver disease in children.</a> Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).</li><li>Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+for+inborn+errors+of+metabolism:+advancing+towards+the+clinic.">Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic.</a> BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).</li><li>Brunetti-Pierri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+inborn+errors+of+liver+metabolism:+progress+towards+clinical+applications.">Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications.</a> Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).</li><li>Carlson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+TALEN-mediated+gene+knockout+in+livestock.">Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).</li><li>Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+enzymic+defects+in+hereditary+tyrosinemia.">On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+3-dimensional+imaging+of+liver+regeneration+in+a+mouse+model+of+hereditary+tyrosinemia+type+1+using+the+sodium+iodide+symporter+gene.">Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene.</a> Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curative+ex+vivo+liver-directed+gene+therapy+in+a+pig+model+of+hereditary+tyrosinemia+type+1.">Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1.</a> Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).</li><li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272 (5259), 263-267 (1996).</li><li>Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors:+from+virology+to+transgene+expression.">Viral vectors: from virology to transgene expression.</a> British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).</li><li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+basic+to+translational.">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li><li>Chowdhury, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+improvement+of+hypercholesterolemia+after+ex+vivo+gene+therapy+in+LDLR-deficient+rabbits.">Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits.</a> Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).</li><li>Elgilani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Phenotype+Characterization+of+a+Large-Animal+Model+of+Hereditary+Tyrosinemia+Type+1.">Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1.</a> The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).</li><li>Patyshakuliyeva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+utilization+and+metabolism+is+highly+differentiated+in+Agaricus+bisporus.">Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus.</a> BMC Genomics. 14, 663 (2013).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumarylacetoacetate+hydrolase+deficient+pigs+are+a+novel+large+animal+model+of+metabolic+liver+disease.">Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease.</a> Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).</li></ol>

В настоящем докладе описываются ex vivo аутологичной генной терапии подход к вылечить свинину модель HT-1. Она включает в себя частичной гепатектомии, следуют ex vivo изоляции гепатоцитов и трансдукция изолированных гепатоцитов с вирусом lenti, проведение корректирующих трансген. Исп?...

Врожденные дефекты метаболизма печени — семейство генетических заболеваний, которые коллективно затрагивают как многие, как 1 в 800 живорожденных1. Многие из этих заболеваний одного гена дефекты2 и функционально могут быть вылечены путем введения одной исправленные копии гена пострадавших в достаточное количество гепатоцитов3. Фактический процент гепатоцитов, которые необходимо исправить варьируется в зависимости от заболевания4 и в значительной степени зависит от характера белка, который кодирует, например, экскретируется белки против цитоплазмы. В большинстве случаев эффективность любого лечения для метаболических заболеваний легко assayed через присутствие биомаркеров часто доступны в циркуляции.
HT-1 является врожденным ошибка метаболизма в печени, что приводит к от дефекта в fumarylacetoacetate гидролазы (ФА)5, последний шаг ферментативные тирозин метаболизм6. FAH дефицит приводит к построению токсичных метаболитов в печени, что может привести к острой печеночной недостаточности и смерти или в хронической формы болезни могут вызвать цирроз и гепатоцеллюлярной карциномы. Заболевание клинически управляется администрацией 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), малые молекулы ингибитора фермента вверх по течению от ФА в метаболизме тирозина. Заболевание представляет собой идеальную среду для проверки методов генной терапии, как успешной коррекции даже небольшое количество гепатоцитов в конечном итоге приведет к заселения всей печени с исправленной ячейки в больших и малых животных моделях 7 , 8. это происходит потому, что исправить клетки имеют глубокие выживания преимущество над нескорректированной клетки за счет накопления токсичных метаболитов в последнем. Потеря нескорректированной гепатоцитов позволяет для выборочного расширения исправленные гепатоцитов в соответствии с регенеративной способностью печени. Лечение может легко следовать измерения сокращение циркулирующих тирозин и succinylacetone уровнях, после трансплантации.
Для того, чтобы оправдать захватнический характер процедуры, которая включает в себя частичной гепатектомии, Цель этого подхода должен быть прочный лечения. Таким образом некомпетентных лентивирусные векторы репликации используются потому, что они будут стабильно интегрироваться в геном гепатоцитов9. обеспечение доставки исправленные гена для всех дочерних клеток в печени растет и расширяется заменить быстрой потери нескорректированной клеток. Это выгодно над адено связанных вирусных векторов (AAV), которые существуют главным образом как episomes, которые могут передаваться только на одну ячейку дочь во время митоза10 тем самым потерять любой эффект терапии в течение нескольких недель.
Несмотря на растущий объем литературы поддерживает безопасность человека11, опасения за генотоксичных события смягчаются путем ограничения трансдукции клеток хозяина в среде с контролируемой в пробирке . Бесплатные Векторные вводится никогда не системно принимающей страны при выполнении этого метода, ограничивая воздействие гепатоцитов, которые будет вновь внесен с аутологичной трансплантацией через воротной вены.
Этот доклад описывает метод хирургического и ex vivo процедуры, используемые для изоляции гепатоцитов для генной терапии ex vivo и12 последующих аутологичной трансплантации для лечения свинья HT-18. Весь процесс включает в себя 1) частичной гепатектомии, который служит источником гепатоцитов и стимулом роста для печени хоста, 2) изоляции гепатоцитов из подакцизным печени, следуют ex vivo гена коррекции и, наконец, 3) реинтродукция исправленные гепатоцитов обратно в узле. Метод, описанный для всех крупных животных моделей с некоторыми изменениями, но только свинья фа недостаточным13 будет иметь преимущество выборочного среды для исправленной гепатоцитов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC)</td>
			<td style="width:139px;">Yecuris</td>
			<td style="width:127px;">20-0027</td>
			<td style="width:109px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B12STS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B5SHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 60</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA60AMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 45</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA45AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 30</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>SIG30AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo catch bag</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>173050G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0 PDS</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z340H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J459H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J426H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dermabond</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Sterile Dressing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Williams&#8217;-E Powder&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ME16060P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8875-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1679-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA (g/L)</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>45172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(N-A-C, g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2 2H2O (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D (mg/mL)</td>
			<td>Crescent Chemical</td>
			<td>17456.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexamethasone</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>NDC6337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine

Генная терапия является идеальным выбором для лечения многие врожденные дефекты метаболизма печени. Экс vivo, лентивирусные векторы успешно используются в лечении многих кроветворных заболеваний в организме человека, как их использование обеспечивает стабильное трансген выражение благодаря вектор способность интегрироваться в хост геномов. Этот метод демонстрируется применение ex vivo генной терапии гепатоцитов к большой животной модели наследственных Тирозинемия типа I. Этот процесс состоит из 1) изоляции первичных гепатоцитов из аутологичной доноров/получателей помощи животным, 2) ex vivo гена доставки через гепатоцитов трансдукция с лентивирусные вектор и 3) аутологичной трансплантации исправленные гепатоцитов через портал вен инъекций. Успех метода обычно опирается на эффективный и стерильные удаления резекции печени, тщательной обработке подакцизным образца для изоляции жизнеспособных гепатоцитов достаточно для повторного голокоренные, высокий процент трансдукции изолированных клеток, и Асептические хирургические процедуры по всему для предотвращения инфекции. Технический сбой в любой из этих шагов приведет к низкой урожайностью жизнеспособных transduced гепатоцитов аутологичной трансплантации или заражения животного доноров/получателей помощи. Свинья модель наследственной Тирозинемия человека типа 1 (HT-1) выбрали для этого подхода является однозначно поддаются такой метод, как даже небольшой процент приживления исправленные клеток приведет к заселения печени с здоровые клетки, основанный на мощный Селективное преимущество над родной больной гепатоцитов. Хотя этот рост выбор не будет справедливо для всех указаний, этот подход является основой для расширения в другие показания и позволяет для манипулирования этой среды для решения дополнительных заболеваний, как в печени и за ее пределами, в то время как контроль за воздействием вирусный вектор и возможность пробить токсичности и tumorigenicity.

Резекция печени и аутологичной трансплантации схематически представлены на рисунке 1. Представитель когорты 5 свиней, которые подверглись резекции печени, большинство было урожайности > 1 х 109 гепатоцитов с приблизительно 80% жизнеспособность (<stron...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine at JoVE.com

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Этот протокол предназначен для описания свиных гепатоцитов изоляции и ex vivo гена доставки вылечить модели метаболических заболеваний через трансплантация аутологичных клеток. Хотя эта конкретная модель имеет уникальные преимущества, которые способствуют успешной терапии, является применение соответствующей основой для решения дополнительных заболеваний и указаний.

Лентивирусные вектор опосредованной генотерапии гепатоцитов Ex Vivo аутологичной трансплантации в свиней

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

Экстра-генная терапия и аутологичная трансплантация клеток для лечения врожденных ошибок обмена веществ в печени является важной альтернативой терапии этих расстройств. И позволяет нам не только лечить эти расстройства, но выяснить биомассу, необходимую для достижения терапевтического результата. Такой подход также позволяет избежать значительных последствий иммуносупрессии и других последствий с различными видами терапии.В данном контексте мы используем этот подход для лечения наследственной тирозинемии типа 1. Тем не менее, идея заключается в том, что это будет платформенный подход для лечения множества различных заболеваний печени с минимальными изменениями. Важно, чтобы иметь возможность визуализировать этот метод, потому что есть некоторая изменчивость, когда дело доходит до визуализации эффективности перфузии, которая имеет важное значение для получения жизнеспособных гепатоцитов для трансплантации.Хирургическая процедура в исполнении Роберта Кайзера и Джозефа Лиллегарда. Изоляция клеток в исполнении Зедзи Ду, Брюса Амиота. Очистка клеток UAU и экс-виво трансдукция клеток была сделана Кейтлин ВанЛит.Подготовка животных и OR подготовка была сделана Кари Аллен и Лори Хиллин. Для выполнения первоначального входа в порт, выполнить открытую технику Hasson головки для umbilicus анестезированной, до трех месяцев, большой, белый свиньи фермы. Представляем 12-миллиметровый трокар в брюшную полость, где виден брюшной полости.Когда трокар на месте, пройти 5 миллиметров 30 градусов области через порт входа и insufflate живота с углекислым газом до 15 миллиметров ртути. Под прямую визуализацию с лапароскопической камерой, поместите 2 дополнительных 5 миллиметровых портов, триангуляции на левой боковой доли печени. И поместите лапароскоп в один из новых портов.Определите левый боковой сегмент печени в точке основной трещины левой доли, которая отделяет медиальный и левый боковой сегменты. И использовать хирургический степлер для обеспечения сосудистых структур и печеночным вены вдоль этой трещины. Трансект parenchyma через эту трещину с помощью последовательных стрельб и 60, 45, или 30 миллиметров длиной сосудистых нагрузок.Когда ресекция завершена, оценить остатки печени, чтобы обеспечить адекватный гемостаз и использовать эндоскопические захваты и эндоскопической ткани поиска мешок для получения печени разделе. Теперь удалите порты и используйте прерванный нулевой размер шва для фасции средней линии. Бегущий 2-0 шов для глубокого дермального слоя.И работает 4-0 шва для подкожного слоя, чтобы закрыть 12 миллиметровый разрез порта в трех слоях. Затем закройте пятимиллиметровые порты одним слоем с 2-0 швами. И поместите стерильную повязку на разрезы.Для изоляции гепатоцитов сначала подключите перисталтический насос, установленный для доставки дисперсионных растворов, поддерживаемых в водяной бане 43 градусов по Цельсию, к катетерам, которые помещаются в большие открытые сосуды секции печени. Премьер насоса и трубки с перфузией два раствора, до остановки петух позиции переключаться между перфузией один и перфузии два решения доставки в ткань. И переключить стоп петух на перфузии одной позиции.Затем премьер остальной части трубки набора. Полностью заполнение вкольной ловушки, чтобы предотвратить введение пузырьков воздуха в ткани. Далее сделайте чистый поперечный разрез, перпендикулярно печеночным кровообращением, чтобы выявить поперечные сечения ветвей вен портала и печеночным венам для катетеризации.И использовать уютный установки катетера для катетеризации доступных, открытых вен. Когда катетеры на месте, perfuse повторной ткани печени с теплой перфузии один раствор на 100 миллиметров в минуту скорость потока. Перемещение розетки трубки из вены в вену каждые 30 до 60 секунд.И с помощью эвакуационные трубки, чтобы удалить избыток буфера из ткани лоток. После езды на велосипеде по всем доступным венам в течение 15-20 минут, переключитесь на перфузию два раствора при одинаковых условиях. Использование обратного насоса для переработки перфузии два раствора обратно в резервуар, на более медленной скорости потока, для повторного введения в ткани.Проверьте температуру поверхности пузырь ловушку и, или печени примерно каждые пять минут, чтобы подтвердить, что гепатоциты не остыть. Когда печень бланширует примерно через 30 минут перфузии, перенесите ткань в стерильный контейнер, завернутый в стерильную драпировку, и поместите контейнер в капюшон клеточной культуры для поддержания стерильности во время обработки гепатоцитов. Коллагеназа изоляции гепатоцитов и диссоциации клеток должно быть сделано полностью, так что вы не получите слипания клеток, что снижает жизнеспособность клеток и частоты трансдукции.Погрузить печень с гепатоцитов мыть среды и перетащить ножницы через верхнюю часть ткани, чтобы нарушить капсулу печени. Надев стерильные перчатки, нежно массируйте печень, чтобы выпустить гепатоциты в среду. И фильтровать ткань supernatant, через стерильную марлю, в 200 миллилитров центрифуги бутылки.Соберите отфильтрованные гепатоциты путем центрифугации. Объединение клеток в 150 миллилитров свежих гепатоцитов мыть среды в одну бутылку 200 миллилитров для 2 дополнительных моет. И подсчет клеток после третьей центрифугации.Затем разбавить клетки до 1 раза от 10 до девятого гепатоцитов на миллилитр солевой концентрации. Для аутотрансплантации изолированных гепатоцитов используйте двух-пять мегагерц-предуцеров для идентификации вены портала с помощью ультразвука и навемите пятидюймовую иглу 18-го калибра к главной вене портала, приближенной к ее бифуркации. Загрузите клетки в 60-миллилитровый шприц, в зависимости от общего объема клеток и прикрепите шприц к игле, заботясь о том, чтобы не вводить пузырьки.Далее, медленно угнетайте поршень шприца, чтобы вручную влить до 1 раза 10 до девятого гепатоцитов через портальный вены с помощью инфузионного катетера для мониторинга порального давления во время трансплантации. Когда все клетки были доставлены, удалить катетер и контролировать портал вены на наличие тромботических событий и вперед потока с помощью ультразвука. В репрезентативной когорте из пяти свиней, которые подверглись печеночным ресекции, большинство из них имели урожайность от более чем 10 до девятого гепатоцитов с примерно 80%жизнеспособности.Обеспечение достаточного количества клеток для любого типа желаемых манипуляций, включая генную терапию. Последующая культура не пересаженной части этих подготовленных гепатоцитов продемонстрировала хорошую жизнеспособность и адгезию с типичной морфологией гепатоцитов через 46 часов после их трансдукции и первоначального покрытия. Первоначальная при пересадка будет варьироваться в зависимости от количества клеток, восстановленных во время трансплантации.Эти репрезентативные биопсии демонстрируют хронологию расширения клеток, исправленных генами. Уникальный для заболеваний, таких как наследственная тирозинемия типа 1, которые пользуются положительным выбранным давлением для здоровых клеток. Это расширение обычно завершается через 12 месяцев после трансплантации.После пересадки фумарилакетоацетат гидролаза нокаут животных достигло около 20% повторной популяции исправленных гепатоцитов в печени, уровни тирозина нормализуются по сравнению с дикими животными типа. В то время как неисправленные животные демонстрируют значительную высоту как в щелочной фосфатазе, так и в трансаминазе аспартата по сравнению с животными дикого типа, генная терапия ex vivo возвращает эти уровни ферментов сыворотки в нормальное русло. Кроме того, общее метаболическое здоровье печени нарушается в необработанных свиней нокаут, как указано на высотах в циркулирующих аммиака, которые корректируются после повторной популяции с обработанными гепатоцитами.Важно помнить, с помощью этой техники для обработки и манипулировать ткани тщательно и как можно меньше. Повышенная обработка или манипуляция тканями, приводит к снижению жизнеспособности клеток и снижению урожайности. Этот подход также может быть применим для людей, которые заинтересованы в изучении распределения лука и график неэффективности в методах маркировки, используя другие методы за пределами вирусных протоколов трансдукции.Не забывайте, что работа с вирусными переносчиками может быть опасной, поэтому при использовании этих методов необходимо следовать надлежащим процедурам биобезопасности, а также носить средства индивидуальной защиты.

Research

JoVE Journal

Medicine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

Экс Vivo культуры тканей пациента и изучение генов доставки

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

В Vivo собак Пробирной функции мышц

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Создание и распространение опухолей человека Ретинобластома в иммунодефицитных мышей

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Производство и обнаружения активных форм кислорода (АФК) в Раки

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Новый хирургический подход к интратрахеального введения биологически активных веществ в фетальный модель мыши

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Neo-Иле формирования в печени мышей с диабетом по Helper-зависимых Аденовирусные Vector-опосредованного переноса генов

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Matrix-assisted Autologous Chondrocyte Transplantation for Remodeling and Repair of Chondral Defects in a Rabbit Model

Матрица-Assisted Аутологичный трансплантации хондроцитов для реконструкции и ремонта хрящевые дефекты в модели кролика

Articular cartilage defects are considered a major health problem because articular cartilage has a limited capacity for self-regeneration 1. Untreated ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Экс Ситу нормотермических машина перфузии Печени доноров

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Нормотермических<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Почки перфузии по охране почки графты до трансплантации

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...