Name: lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine
Uploaded: 2018-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine at JoVE.com

Författarna vill tacka Duane Meixner för expertis inom utför den portalen ven injektion, Steve Krage, Joanne Pederson och Lori Hillin för stöd under de kirurgiska ingrepp. Detta arbete stöds av Children's Hospital of Minnesota Foundation och regenerativ medicin Minnesota. R.D.H. finansierades genom en NIH K01 DK106056 utmärkelse och en Mayo Clinic Center för regenerativ medicin karriär Development Award.

Alla djur förfaranden var utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer och granskas och godkänns av institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) före studien beteende. Procedurerna som beskrivs här utfördes på manliga och kvinnliga stor vit gård svin (50% Landrace/50% stora vita genetisk bakgrund) upp till 3 månaders ålder som anses friska och lämpar sig för kirurgi.  Djuren hålls socialt såvida anses oförenlig av institutionella veterinärvård personal.  Djuren skall utfodras lä...

<ol>
	<li>Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+metabolism+and+expanded+newborn+screening:+review+and+update.">Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).</li><li>Hansen, K., Horslen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+liver+disease+in+children.">Metabolic liver disease in children.</a> Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).</li><li>Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+for+inborn+errors+of+metabolism:+advancing+towards+the+clinic.">Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic.</a> BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).</li><li>Brunetti-Pierri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+inborn+errors+of+liver+metabolism:+progress+towards+clinical+applications.">Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications.</a> Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).</li><li>Carlson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+TALEN-mediated+gene+knockout+in+livestock.">Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).</li><li>Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+enzymic+defects+in+hereditary+tyrosinemia.">On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+3-dimensional+imaging+of+liver+regeneration+in+a+mouse+model+of+hereditary+tyrosinemia+type+1+using+the+sodium+iodide+symporter+gene.">Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene.</a> Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curative+ex+vivo+liver-directed+gene+therapy+in+a+pig+model+of+hereditary+tyrosinemia+type+1.">Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1.</a> Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).</li><li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272 (5259), 263-267 (1996).</li><li>Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors:+from+virology+to+transgene+expression.">Viral vectors: from virology to transgene expression.</a> British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).</li><li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+basic+to+translational.">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li><li>Chowdhury, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+improvement+of+hypercholesterolemia+after+ex+vivo+gene+therapy+in+LDLR-deficient+rabbits.">Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits.</a> Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).</li><li>Elgilani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Phenotype+Characterization+of+a+Large-Animal+Model+of+Hereditary+Tyrosinemia+Type+1.">Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1.</a> The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).</li><li>Patyshakuliyeva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+utilization+and+metabolism+is+highly+differentiated+in+Agaricus+bisporus.">Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus.</a> BMC Genomics. 14, 663 (2013).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumarylacetoacetate+hydrolase+deficient+pigs+are+a+novel+large+animal+model+of+metabolic+liver+disease.">Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease.</a> Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).</li></ol>

Denna rapport beskriver en ex vivo autolog gen terapi metod för att bota en svin modell av HT-1. Det handlar om en partiell hepatectomy, följt av ex vivo hepatocyte isolering och transduktion av isolerade hepatocyter med lenti virus bär den korrigerande transgenens. Korrigerade autolog hepatocyter transplanteras sedan tillbaka till FAH bristfällig djuret via portvenen8. Även om den beskrivna metoden är tillämplig på alla stora djurmodeller med några ändringar, har FAH-b...

Medfödda rubbningar i ämnesomsättningen i levern är en familj av genetiska sjukdomar som kollektivt påverkar så många som 1 i 800 levande födda1. Många av dessa sjukdomar är enda gen defekter2 och funktionellt kan botas genom att införa en enda korrigerad kopia av drabbade genen i ett tillräckligt antal hepatocyter3. Den faktiska procentuella hepatocyter som måste rättas varierar av sjukdom4 och är till stor del beroende på vilken typ av protein det kodar, exempelvis utsöndras proteinerna kontra cytoplasmiska. I de flesta fall är effekten av någon behandling för metabola sjukdomar enkelt analyseras genom närvaron av biomarkörer ofta tillgängliga i cirkulationen.
HT-1 är ett medfött fel av metabolism i levern som resulterar från en defekt i fumarylacetoacetathydrolas hydrolas (FAH)5, sista enzymatiska steg i tyrosin metabolism6. FAH-brist leder till att bygga upp av toxiska metaboliter i levern som kan orsaka akut leversvikt och död eller i den kroniska formen av sjukdomen kan orsaka skrumplever och Hepatocellulär cancer. Sjukdomen är kliniskt förvaltas av administration av 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), en liten molekyl hämmare av ett enzym uppströms av FAH i tyrosin metabolism. Sjukdomen ger en idealisk miljö att testa genterapimetoder, eftersom framgångsrika korrigering av även ett litet antal hepatocyter kommer så småningom leda till återinsättning av hela levern med korrigerade celler i både små och stora djurmodeller 7 , 8. Detta beror på att korrigeras celler har en djupgående överlevnadsfördel över okorrigerad celler på grund av ansamling av toxiska metaboliter i den senare. Förlusten av okorrigerad hepatocyter tillåter selektiv expansion av korrigerade hepatocyter konsekvent med regenerativ kapacitet av levern. Behandling kan enkelt följas genom mätning av minskningen av cirkulerande tyrosin och succinylaceton nivåer efter transplantation.
För att motivera den invasiva karaktären av förfarandet, som omfattar en partiell hepatectomy, måste målet för denna strategi vara ett varaktigt botemedel. Replikering inkompetenta lentiviral vektorer används därför eftersom de stabilt kommer att integreras i den hepatocyte genom9. att säkerställa leverans av korrigerade genen till alla dotterceller som levern växer och expanderar för att ersätta den snabb förlusten av okorrigerad celler. Detta är fördelaktigt över adeno associerade virala vektorer (AAV), som främst finns som episomes som kan endast skickas till en enda dotter cell under Mitos10 därmed förlora någon effekt av terapin i några veckor.
Även om en växande mängd litteratur stöder säkerhet lentivirus11, oro över mildras genotoxiska händelser genom att begränsa transduktion av värdceller till en kontrollerad in vitro- miljö. Gratis vektor introduceras aldrig systemiskt till värden när denna metod utförs, begränsa exponering för de hepatocyter som kommer att återinföras med autolog transplantation via portalen ven.
Denna rapport beskriver metoden för den kirurgiska och ex vivo förfaranden som används för att isolera hepatocyter för gen terapi ex vivo och efterföljande autolog transplantation12 för behandling av HT-1 gris8. Hela processen inkluderar 1) en partiell hepatectomy som fungerar som en källa av hepatocyter och en tillväxt stimulans för värdens levern, 2) isolering av hepatocyter från exciderad levern följt av ex vivo gen korrigering, och slutligen 3) återinförandet av den korrigerade hepatocyter tillbaka till värden. Den beskrivna metoden är tillämplig på alla stora djurmodeller med några ändringar, men endast FAH-brist gris13 kommer att ha fördelen av selektiv miljön för korrigerade hepatocyter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC)</td>
			<td style="width:139px;">Yecuris</td>
			<td style="width:127px;">20-0027</td>
			<td style="width:109px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B12STS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B5SHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 60</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA60AMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 45</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA45AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 30</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>SIG30AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo catch bag</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>173050G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0 PDS</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z340H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J459H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J426H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dermabond</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Sterile Dressing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Williams&#8217;-E Powder&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ME16060P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8875-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1679-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA (g/L)</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>45172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(N-A-C, g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2 2H2O (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D (mg/mL)</td>
			<td>Crescent Chemical</td>
			<td>17456.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexamethasone</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>NDC6337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine

Genterapi är ett perfekt val att bota många medfödda metabolism i levern. Ex-vivo, lentiviral vektorer har framgångsrikt använts i behandlingen av många hematopoetiska sjukdomar hos människor, eftersom deras användning erbjuder stabil transgenens uttryck vektorn förmåga att integrera i värd genomet. Denna metod visar tillämpningen av ex vivo genterapi av hepatocyter på en stor djurmodell av hereditär tyrosinemi typ jag. Denna process består av 1) isolering av primära hepatocyter från autologa givare/mottagare djuret, 2) ex vivo gen leverans via hepatocyte transduktion med lentiviral vector och 3) autolog transplantation av korrigerade hepatocyter via portalen ven injektion. Framgången med metoden generellt bygger på effektiv och sterila borttagning av den levern resektion, noggrann hantering av exciderad förlagan för isolering av livskraftiga hepatocyter tillräckligt för åter implantation, hög andel transduktion i isolerade celler, och aseptiska kirurgiska ingrepp hela tiden för att förhindra infektion. Tekniskt fel på någon av dessa steg kommer att resultera i låg avkastning av livskraftiga sensorik hepatocyter för autolog transplantation eller infektion av givare/mottagare djuret. Gris modellen av människans typ 1 hereditär tyrosinemi (HT-1) valt för detta synsätt är unikt mottagliga för denna metod, eftersom även en liten andel av engraftment av korrigerade celler kommer att leda till återinsättning av levern med friska celler baserat på en kraftfull selektiv fördel över native-sjuka hepatocyter. Även om denna tillväxt urval inte kommer vara sant för alla indikationer, detta tillvägagångssätt är en stiftelse för expansion till andra indikationer och tillåter manipulering av denna miljö att ta itu med ytterligare sjukdomar, både i levern och bortom, medan Kontrollera för exponering för virala vektorn och möjlighet för off-target toxicitet och tumorigenicitetsprov.

De lever resektion och autolog transplantation är representerade schematiskt i figur 1. I en representativ kohort av 5 grisar som genomgick nedsatt resektion, de flesta hade avkastningarna av > 1 x 109 hepatocyter med cirka 80% viabilitet (tabell 2), vilket ger gott om celler för någon typ av önskad manipulationer, inklusive gen terapi. Efterföljande kultur av den icke-transplanterade delen av beredda hepatocyter från var och...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine at JoVE.com

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Detta protokoll syftar till att beskriva svin hepatocyte isolering och ex vivo gen leverans för att bota modeller av metabola sjukdomar via autolog stamcellstransplantation. Även om just denna modell har unika fördelar som gynnar framgångsrik terapi, är ansökan en relevant grund att ta itu med ytterligare sjukdomar och beteckningar.

Lentiviral Vector-medierad genterapi av hepatocyter Ex Vivo för autolog Transplantation hos svin

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

Ex vivo genterapi och autolog cell transplantation för behandling av inborn fel av metabolism i levern är ett viktigt alternativ till terapin för dessa sjukdomar. Och tillåter oss att inte bara behandla dessa sjukdomar, men räkna ut den biomassa som krävs för att kunna uppnå ett terapeutiskt resultat. Detta tillvägagångssätt undviker också de betydande konsekvenserna av immunsuppression och andra konsekvenser med olika typer av terapier.I det aktuella sammanhanget använder vi detta tillvägagångssätt för att behandla ärftlig tyrosinemi typ 1. Tanken är dock att detta kommer att vara en plattform strategi för att behandla en mängd olika leversjukdomar med minimal förändring. Det är viktigt att kunna visualisera denna teknik eftersom det finns vissa variationer när det gäller att visualisera effektiviteten i perfusion, vilket är viktigt att få livskraftiga hepatocyter för transplantation.Kirurgiskt ingrepp utfört av Robert Kaiser och Joseph Lillegard. Cellisolering utförd av Zeji Du, Bruce Amiot. UAU cell rening och ex vivo transduktion av cellerna gjordes av Caitlin VanLith.Beredning av djuren och OR prep gjordes av Kari Allen och Laurie Hillin. För att utföra den första porten plats posten, utföra en öppen Hasson teknik cephalad till umbilicus av en sövd, upp till tre månader gammal, stor, vit gård gris. Införa en 12 millimeter trocar i bukhålan, där bukhinnan är synlig.När trokaren är på plats, passera en 5 millimeter 30 graders räckvidd genom ingångsporten och insufflate buken med koldioxid till 15 millimeter kvicksilver. Under direkt visualisering med den laparoskopiska kameran, placera 2 ytterligare 5 millimeter portar, triangulera på vänster lateral lob i levern. Och placera laparoskopet i en av de nya portarna.Identifiera vänster laterala segmentet av levern vid punkten för de stora spricka av vänster lob som skiljer den mediala och vänster laterala segment. Och använd en kirurgisk häftapparat för att säkra de vaskulära strukturerna och den leverven längs denna spricka. Transect parenkymet genom denna spricka med hjälp av sekventiella skottlossningar och 60, 45, eller 30 millimeter långa vaskulära laster.När sambandet är klar, bedöma kvarleva levern för att säkerställa en adekvat hemostas och använda endoskopisk gripare och en endoskopisk vävnad hämtning väska att hämta levern avsnitt. Nu, ta bort portarna och använda en avbruten storlek noll sutur för mittlinjen fascia. En löpande 2-0 sutur för det djupa dermala lagret.Och en löpande 4-0 sutur för subkutikalskiktet, för att stänga 12 millimeters portsnitt i de tre skikten. Stäng sedan de fem millimeterportarna i ett lager med 2-0 suturer. Och placera ett sterilt förband på snitten.För hepatocyteisolering, anslut först en peristaltisk pump som för att leverera spridningslösningarna, som upprätthålls i ett 43 graders Celsius vattenbad, till katetrarna som ska placeras i de stora, exponerade kärlen i leversektionen. Prime pumpen och slangar med perfusion två lösning, upp till ett stopp kuk position för att växla mellan perfusion en och perfusion två lösning leverans till vävnaden. Och växla stopp kuk till perfusion en position.Sedan prime resten av slangen set. Helt fylla en inline bubbla fälla för att förhindra att införa luftbubblor i vävnaden. Därefter gör en ren tvärgående snitt, vinkelrätt mot den leveriska cirkulationen för att avslöja tvärsnitt av portalvenen grenar och de levervener för kateterisering.Och använd en ombonad passande kateter för att kateterisera de tillgängliga, exponerade venerna. När katetrarna är på plats, genomsyra den resected levervävnaden med varm perfusion en lösning på en 100 millimeter per minut flöde. Flytta utloppsröret från ven till ven var 30 till 60 sekunder.Och med hjälp av ett evakueringsrör för att avlägsna överskott buffert från vävnadsbrickan. Efter cykling genom alla tillgängliga vener i 15 till 20 minuter, växla till perfusion två lösning under samma förhållanden. Med hjälp av en returpump för att återvinna perfusion två lösning tillbaka till reservoaren, vid en långsammare flödeshastighet, för åter administrering i vävnaden.Kontrollera yttemperaturen på bubblan fällan och, eller levern ungefär var femte minut för att bekräfta att hepatocyterna inte blir kalla. När levern blanches efter ca 30 minuter perfusion, överföra vävnaden till en steril behållare, insvept med en steril drap, och placera behållaren i en cellkultur huva för att upprätthålla sterilitet under hepatocyte bearbetning. Kollagenasisolering av hepatocyter och cellavkoppling måste göras helt så att du inte får klumpar av cellerna vilket minskar livskraften hos cellerna och transduktionsfrekvensen.Submerge levern med hepatocyte tvätta medium och dra sax över toppen av vävnaden för att störa levern kapseln. Bär sterila handskar, försiktigt massera levern för att släppa hepatocyterna i mediet. Och filtrera vävnaden supernatant, genom steril gasväv, i 200 milliliter centrifugflaskor.Samla ihop de filtrerade hepatocyterna genom centrifugering. Poolning av cellerna i 150 milliliter färsk hepatocyte tvätta medium i en enda 200 milliliter flaska för 2 ytterligare tvättar. Och räknar cellerna efter den tredje centrifugeringen.Späd sedan cellerna till 1 gånger 10 till den nionde hepatocyterna per milliliter saltlösningskoncentration. För autotransplantation av de isolerade hepatocyterna, använd en två-fem megahertz givare för att identifiera portalvenen via ultraljud och rikta en fem-tums, 18-gauge nål mot huvudportalvenen, approximal till det är bifurcation. Ladda cellerna i en 60 milliliter spruta, enligt den totala cellvolymen och fäst sprutan på nålen, var noga med att inte införa bubblor.Därefter långsamt trycka ned sprutkolven för att manuellt infusera upp till 1 gånger 10 till den nionde hepatocyterna genom portalvenen med hjälp av en infusionskateter för att övervaka poraltrycket under transplantationen. När alla celler har levererats, ta bort katetern och övervaka portalvenen för förekomst av trombotiska händelser och framåtflöde genom ultraljud. I en representativ kohort av fem svin, som genomgick lever samband, hade de flesta avkastning på större än 10 till nionde hepatocyterna med cirka 80%lönsamhet.Att tillhandahålla ett tillräckligt antal celler för någon typ av önskad manipulation, inklusive genterapi. Efterföljande kultur av icke-transplanterade delen av dessa beredda hepatocyter, visat en god livskraft och vidhäftning med en typisk hepatocyte morfologi 46 timmar efter deras transduktion och inledande plätering. En inledande engraftment kommer att variera med antalet celler som återinförs under transplantationen.Dessa representativa tarmbiopsier visar en tidslinje för gen-korrigerade cell expansion. Unikt för sjukdomar, såsom ärftlig tyrosinemi typ 1, som åtnjuter ett positivt valt tryck för friska celler. Denna expansion är normalt komplett 12 månader efter transplantation.När en transplanterad fumarylacetoacetate hydrolas knockout djur har uppnått cirka 20%re-population av de korrigerade hepatocyterna i levern, kommer tyrosinnivåerna normalisera jämfört med vilda djur. Medan okorrigerade djur uppvisar en betydande förhöjning i både alkaliska fosfatas och aspartat transaminas jämfört med vilda djur, returnerar ex vivo genterapi dessa serum enzymer nivåer till det normala. Vidare störs den allmänna levermetaboliska hälsan hos obehandlade knockout-svin, vilket indikeras av förhöjningar i den cirkulerande ammoniak som korrigeras efter re-population med de behandlade hepatocyterna.Det är viktigt att komma ihåg med att använda denna teknik för att hantera och manipulera vävnaden noggrant och så lite som möjligt. Ökad hantering eller manipulering av vävnaden, leder till minskad livskraft hos cellerna och minska avkastningen. Detta tillvägagångssätt kan också vara tillämpligt för personer som är intresserade av att studera bogfördelning och grafineffektivitet i märkningstekniker, med hjälp av andra tekniker utanför virala transduktionsprotokoll.Glöm inte att arbeta med viral vektorer kan vara farligt, så efter korrekt bio säkerhetsrutiner, samt bär personlig skyddsutrustning är nödvändigt när du använder dessa tekniker.

Research

JoVE Journal

Medicine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

Ex vivo kultur Patient Tissue &amp; Undersökning av Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine muskelfunktion analys

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Fastställande och spridning av mänskliga Retinoblastom Tumörer i Immune deficienta möss

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Produktion och Detektering av reaktiva syreradikaler (ROS) i cancer

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

A Novel kirurgisk metod för intratrakeal administrering av bioaktiva ämnen i fosterställning musmodell

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Neo-Islet Bildning i Lever från diabetiska möss genom Helper-beroende adenovirusvektor genöverföring

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Matrix-assisted Autologous Chondrocyte Transplantation for Remodeling and Repair of Chondral Defects in a Rabbit Model

Matrix-assisterad Autologous kondrocyttransplantation för ombyggnad och reparation av chondral Defekter i en kanin modell

Articular cartilage defects are considered a major health problem because articular cartilage has a limited capacity for self-regeneration 1. Untreated ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Ex situ normotermisk Machine Perfusion av donator Lever

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normotermisk<em&gt; Ex vivo</em&gt; Njure Perfusion för bevarandet av Njure transplantat före transplantation

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...