Name: lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine
Uploaded: 2018-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine at JoVE.com

Yazarlar Duane Meixner destek için gösteri cerrahi işlemler sırasında portal ven enjeksiyon, Steve Krage, Joanne Pederson ve Lori Hillin uzmanlık için teşekkür ederiz. Bu eser Çocuk Hastanesi Minnesota Vakfı ve rejeneratif tıp Minnesota tarafından desteklenmiştir. R.D.H. rejeneratif tıp kariyer geliştirme Ödülü NIH K01 DK106056 ödül ve bir Mayo Kliniği Merkezi üzerinden finanse edildi.

Tüm hayvan yordamları kurumsal kılavuzlarınıza uygun olarak gerçekleştirilen ve incelenmeli ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından çalışma kuralları önce onaylanmalıdır. Burada açıklanan yordamları büyük beyaz çiftlik erkek ve dişi domuz (% 50 Landrace/50% büyük beyaz genetik arka plan) kadar sağlıklı ve cerrahi için uygun olarak kabul edilir 3 ay yaş için yapıldı.  Hayvan sosyal kurumsal hayvan hastalıklarıyla ilgili kaygı personeli tarafından uyumsuz kabu...

<ol>
	<li>Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inborn+errors+of+metabolism+and+expanded+newborn+screening:+review+and+update.">Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).</li><li>Hansen, K., Horslen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+liver+disease+in+children.">Metabolic liver disease in children.</a> Liver Transplantation. 14 (5), 713-733 (2008).</li><li>Schneller, J. L., Lee, C. M., Bao, G., Venditti, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+for+inborn+errors+of+metabolism:+advancing+towards+the+clinic.">Genome editing for inborn errors of metabolism: advancing towards the clinic.</a> BMC Medicine. 15 (1), 43 (2017).</li><li>Brunetti-Pierri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+inborn+errors+of+liver+metabolism:+progress+towards+clinical+applications.">Gene therapy for inborn errors of liver metabolism: progress towards clinical applications.</a> Italian Journal of Pediatrics. 34 (1), 2 (2008).</li><li>Carlson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+TALEN-mediated+gene+knockout+in+livestock.">Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17382-17387 (2012).</li><li>Lindblad, B., Lindstedt, S., Steen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+enzymic+defects+in+hereditary+tyrosinemia.">On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (10), 4641-4645 (1977).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+3-dimensional+imaging+of+liver+regeneration+in+a+mouse+model+of+hereditary+tyrosinemia+type+1+using+the+sodium+iodide+symporter+gene.">Noninvasive 3-dimensional imaging of liver regeneration in a mouse model of hereditary tyrosinemia type 1 using the sodium iodide symporter gene.</a> Liver Transplantation. 21 (4), 442-453 (2015).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curative+ex+vivo+liver-directed+gene+therapy+in+a+pig+model+of+hereditary+tyrosinemia+type+1.">Curative ex vivo liver-directed gene therapy in a pig model of hereditary tyrosinemia type 1.</a> Science Translational Medicine. 8 (349), (2016).</li><li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector.">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272 (5259), 263-267 (1996).</li><li>Bouard, D., Alazard-Dany, D., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors:+from+virology+to+transgene+expression.">Viral vectors: from virology to transgene expression.</a> British Journal of Pharmacology. 157 (2), 153-165 (2009).</li><li>Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors:+basic+to+translational.">Lentiviral vectors: basic to translational.</a> Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).</li><li>Chowdhury, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+improvement+of+hypercholesterolemia+after+ex+vivo+gene+therapy+in+LDLR-deficient+rabbits.">Long-term improvement of hypercholesterolemia after ex vivo gene therapy in LDLR-deficient rabbits.</a> Science. 254 (5039), 1802-1805 (1991).</li><li>Elgilani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Phenotype+Characterization+of+a+Large-Animal+Model+of+Hereditary+Tyrosinemia+Type+1.">Chronic Phenotype Characterization of a Large-Animal Model of Hereditary Tyrosinemia Type 1.</a> The American Journal of Pathology. 187 (1), 33-41 (2017).</li><li>Patyshakuliyeva, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+utilization+and+metabolism+is+highly+differentiated+in+Agaricus+bisporus.">Carbohydrate utilization and metabolism is highly differentiated in Agaricus bisporus.</a> BMC Genomics. 14, 663 (2013).</li><li>Hickey, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumarylacetoacetate+hydrolase+deficient+pigs+are+a+novel+large+animal+model+of+metabolic+liver+disease.">Fumarylacetoacetate hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic liver disease.</a> Stem Cell Research. 13 (1), 144-153 (2014).</li></ol>

Bu rapor bir domuz model HT-1'in tedavi bir ex vivo otolog gen terapisi yaklaşım açıklar. Ex vivo hepatosit yalıtım ve izole tetkikine iletim düzeltici transgene taşıyan lenti virüsle ardından kısmi bir hepatectomy içerir. Düzeltilmiş otolog tetkikine sonra geri FAH eksik hayvan ile portal ven8nakledilmektedir. Açıklanan yöntemi bazı değişiklik ile tüm büyük hayvan modelleri için geçerli olsa da, FAH eksikliği domuz için düzeltilmiş hücreleri<sup cl...

Karaciğer metabolizmasının doğuştan hataları topluca 1 800 canlı Doğum1en çok etkileyen genetik hastalıkların bir aileyiz. Çoğu bu hastalıkların tek gen kusurları2 ve işlevsel olarak etkilenen gen tek bir düzeltilmiş kopyasını tetkikine3yeterli sayıda tanıtarak tedavi edilebilir. Düzeltilmesi gereken tetkikine gerçek yüzdesi hastalığı4 tarafından değişir ve büyük ölçüde bu kodlar, örneğin, atılan protein karşı sitoplazmik protein niteliğine bağlıdır. Çoğu durumda, herhangi bir tedavi etmek için metabolik etkinliğini kolayca aracılığıyla biyolojik dolaşımda bulunan çoğu kullanılabilir varlığı denetlesinler.
HT-1 sonuç fumarylacetoacetate hidrolaz (FAH)5bir üründe, Tirozin metabolizma6enzimatik son adımda karaciğer metabolizmasının doğuştan bir hatadır. FAH eksikliği için sürüme akut karaciğer yetmezliğine ve ölüme neden olabilir veya hastalık kronik şeklinde siroz ve hepatosellüler karsinom neden olabilir karaciğerde toksik metabolitleri, uzun ve zorludur. Hastalığın klinik olarak 2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC), küçük molekül inhibitörü olan bir enzim akıntıya karşı FAH, Tirozin metabolizması İdaresi tarafından yönetilir. Gibi başarılı tetkikine bile az sayıda düzeltilmesi hem küçük hem de büyük hayvan modellerinde düzeltilmiş hücrelerle sonunda tüm karaciğer repopulation içinde sonuçlanır hastalık hangi gen tedavi yöntemleri, test etmek ideal bir ortam sağlar 7 , 8. bu düzeltilmiş için hücreleri var toksik metabolitleri birikimi nedeniyle düzeltilemeyen hücreleri üzerinde derin hayatta kalma avantaj ikincisi oluşur. Düzeltilmemiş tetkikine kaybı düzeltilmiş tetkikine seçici genişleme için karaciğer yeniden üretim kapasitesi ile tutarlı sağlar. Tedavi kolayca nakli takip tirozin ve succinylacetone düzeyleri dolaşan içinde azalma ölçerek izlenebilir.
Kısmi bir hepatectomy içerir, yordam, invaziv doğası haklı göstermek için bu yaklaşım amacı dayanıklı bir tedavi olmalı. Bu nedenle, stabil hepatosit genom9içine entegre olacak çünkü çoğaltma beceriksiz lentiviral vektörler kullanılır. karaciğer olarak tüm kızı hücreleri için düzeltilmiş gen teslim sağlanması büyür ve düzeltilmeyen hücrelerinin hızlı kaybı değiştirmek için genişler. Bu sadece tek bir kızı hücre mitoz10 böylece herhangi bir etkisi birkaç hafta içinde tedavisinin kaybetme sırasında geçirilen episomes olarak öncelikle mevcut ilişkili adeno virüs (AAV) vektörler üzerinde avantajlıdır.
Edebiyat büyüyen bir vücut üzerinde lentivirus11, endişeleri Emanet desteklese genotoksik olaylar kontrollü vitro ortama konak hücreleri iletim sınırlayarak hafifletilmiş. Bu yöntem gerçekleştirildiğinde portal ven yoluyla otolog nakli ile yeniden kullanılmaya olacak tetkikine maruz sınırlayan ücretsiz vektör asla sistemik ana bilgisayara giriliyor.
Bu rapor cerrahi yöntemin ve gen terapisi ex vivo için tetkikine ve sonraki otolog transplantasyon12 HT-1 domuz8tedavisi için ayırmak için kullanılan ex vivo yordamlar açıklanmaktadır. Tam işlem tetkikine ve bir ana bilgisayarın karaciğer için büyüme uyarıcı bir kaynak, 2) ardından ex vivo gen düzeltme ve son olarak 3) reintroduction eksize karaciğer üzerinden tetkikine yalıtım olarak hizmet veren 1) bir kısmi hepatectomy içerir düzeltilmiş tetkikine ev sahibi geri. Açıklanan yöntemi bazı değişiklik ile tüm büyük hayvan modeller için geçerlidir ama sadece FAH eksikliği domuz13 seçici çevre düzeltilmiş tetkikine için avantaj olacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC)</td>
			<td style="width:139px;">Yecuris</td>
			<td style="width:127px;">20-0027</td>
			<td style="width:109px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B12STS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mm Trocar</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>B5SHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 60</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA60AMT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 45</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>EGIA45AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo Surgical Stapler 30</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>SIG30AVM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endo catch bag</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>173050G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0 PDS</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Z340H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J459H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-0 Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J426H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dermabond</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>DNX12</td>
			<td>Sterile Dressing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Williams&#8217;-E Powder&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>ME16060P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaHCO3&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8875-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S1679-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA (g/L)</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>45172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Oakwood Chemical</td>
			<td>3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(N-A-C, g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2 2H2O (g/L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase D (mg/mL)</td>
			<td>Crescent Chemical</td>
			<td>17456.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dexamethasone</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>NDC6337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0314</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral vector-mediated gene therapy of hepatocytes ex vivo for autologous transplantation in swine

Gen tedavisi karaciğer metabolizmasının birçok doğuştan hataları tedavisi için ideal bir seçimdir. Ex vivo, lentiviral vektörler kullanılmıştır başarıyla insanlarda, hematopoetik birçok hastalığın tedavisinde kullanımları vector öğesinin ana bilgisayar genom entegre yeteneği nedeniyle istikrarlı transgene ifade sunduğundan. Bu yöntem ex vivo gen terapisi tetkikine, uygulamaya büyük bir hayvan modeli kalıtsal tyrosinemia türü gösterir ben. Bu işlem 1) birincil tetkikine otolog donör/alıcı hayvandan 2 yalıtım oluşur) bir lentiviral vektör ve düzeltilmiş tetkikine yolu ile taşınabilir 3) otolog nakli ile hepatosit iletim yoluyla ex vivo gen teslim Enjeksiyon damar. Başarı yöntemi genellikle karaciğer rezeksiyonu, uygun tetkikine izole hücreler yeniden engrafting, yüksek yüzdesi iletim için yeterli yalıtım için çıkarılan numune taşıma dikkatli verimli ve steril kaldırılması üzerine dayanır ve Aseptik cerrahi işlemler boyunca enfeksiyonu önlemek için. Bu adımlardan herhangi birini teknik başarısızlık otolog nakli için uygun transduced tetkikine düşük verim veya donör/alıcı hayvan enfeksiyonu neden olur. Düzeltilmiş hücre engraftment bile küçük bir yüzdesi için karaciğer repopulation sağlıklı hücreler üzerinde güçlü bir temel sağlayacaktır gibi domuz insan tipi 1 kalıtsal tyrosinemia (HT-1) Bu yaklaşım için seçilen benzersiz olarak böyle bir yönteme mükellef modeldir yerli hastalıklı tetkikine seçici avantaj. Bu büyüme seçimi için tüm göstergeler gerçek olmayacak olsa da, bu yaklaşım diğer göstergeler doğru genişleme için bir temel ve ek hastalıklar, her ikisi de karaciğer içinde adres ve ötesinde, süre için bu ortamda manipülasyon için sağlar viral vektör ve hedef kapalı toksisite ve tumorigenicity için fırsat maruz için kontrol etmek.

Karaciğer rezeksiyonu ve otolog transplantasyon şematik resim 1' de temsil edilir. Hepatik rezeksiyon uygulanan 5 domuz temsilcisi bir kohort içinde çoğu verimi vardı > hücreler bol sağlayan herhangi bir türü için 1 x 109 tetkikine yaklaşık % 80'i canlılık (Tablo 2), ile istenen manipülasyonlar, gene de dahil olmak üzere terapi. Her bu 5 domuz gösterdi iyi canlılığı ve yapışma, tipik hepatosit morfoloji ilet...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine at JoVE.com

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Bu iletişim kuralı modelleri otolog hücre transplantasyonu ile metabolik hastalıkların tedavisi için domuz hepatosit yalıtım ve ex vivo gen teslim açıklamak için tasarlanmıştır. Her ne kadar bu modelle başarılı terapi lehine benzersiz avantajlar sahiptir, uygulama ek hastalıklar ve göstergeler yönelik olarak ilgili bir temelidir.

Lentiviral vektör-aracılı gen terapisi tetkikine Ex Vivo domuz otolog nakli için

Gene therapy is an ideal choice to cure many inborn errors of metabolism of the liver. Ex-vivo, lentiviral vectors have been used successfully in the ...

Karaciğerde doğuştan gelen metabolizma hatalarının tedavisinde ek vivo gen tedavisi ve otolog hücre nakli bu hastalıkların tedavisine önemli bir alternatiftir. Ve bize sadece bu bozuklukları tedavi etmek için izin verir, ama biyokütle terapötik bir sonuç elde edebilmek için gerekli anlamaya. Bu yaklaşım aynı zamanda farklı tedavi türleri ile immünsupresyon ve diğer sonuçları önemli sonuçları önler.Mevcut bağlamda, kalıtsal tyrosinemia tip 1 tedavisinde bu yaklaşımı kullanıyoruz. Ancak, fikir bu minimal değişiklik ile farklı karaciğer hastalıklarının çok sayıda tedavi etmek için bir platform yaklaşım olacaktır. Bu tekniği görselleştirebilmek önemlidir, çünkü perfüzyonun verimliliğini görselleştirmek söz konusu olduğunda bazı değişkenlikler vardır, ki bu da transplantasyon için uygun hepatosit elde etmek için gereklidir.Robert Kaiser ve Joseph Lillegard tarafından yapılan cerrahi işlem. Zeji Du, Bruce Amiot tarafından gerçekleştirilen hücre izolasyonu. UAU hücre arınması ve hücrelerin ex vivo transdüksiyonu Caitlin VanLith tarafından yapıldı.Hayvanların hazırlanması ve ameliyatla hazırlık Kari Allen ve Laurie Hillin tarafından yapıldı. İlk liman sitesi girişini gerçekleştirmek için, üç aylık, büyük, beyaz çiftlik domuzuna kadar, anestezili bir domuzun göbek yumbilicus'una açık bir Hasson tekniğini gerçekleştirin. Karın boşluğuna 12 milimetrelik bir trokar girişi, periton görünür.Trokar yerinde olduğunda, giriş portu üzerinden 5 milimetre 30 derecelik bir kapsam geçmek ve cıva 15 milimetre karbondioksit ile karın insufflate. Laparoskopik kamera ile doğrudan görselleştirme altında, 2 ek 5 milimetrelik bağlantı noktaları yerleştirin, karaciğerin sol lateral lob üzerinde üçgenleme. Ve laparoskopu yeni limanlardan birine yerleştirin.Medial ve sol lateral segmentleri ayıran sol lob büyük çatlak noktasında karaciğerin sol lateral segmentini tanımlayın. Ve bu çatlak boyunca vasküler yapıları ve hepatik ven güvenli bir cerrahi zımba kullanın. Sıralı ateşlemeler ve 60, 45 veya 30 milimetre uzunluğunda damar yükleri kullanarak bu çatlak yoluyla paraenkim transect.Rezeksiyon tamamlandığında, yeterli hemostaz sağlamak için kalıntı karaciğer değerlendirmek ve karaciğer bölümünü almak için endoskopik kavrayıcılar ve endoskopik doku alma torbası kullanın. Şimdi, bağlantı noktalarını kaldırın ve orta hat fasya için kesilen boyutu sıfır dikiş kullanın. Derin dermal tabaka için çalışan 2-0 dikiş.Ve subcutiküler tabaka için çalışan 4-0 dikiş, üç katmanda 12 milimetrelik bağlantı noktası kesisini kapatmak için. Daha sonra beş milimetrelik bağlantı noktalarını 2-0 dikişlerle tek bir katmanda kapatın. Ve kesiklerin üzerine steril bir pansuman yerleştirin.Hepatosit izolasyonu için, ilk olarak 43 derece santigrat su banyosunda muhafaza edilen dağılım çözeltilerini karaciğer bölümünün büyük, maruz kalan damarlarına yerleştirilecek kateterlere teslim etmek için ayarlanmış bir peristaltik pompayı bağlayın. Prime pompa ve perfüzyon iki çözüm ile tüp, kadar bir stop horoz pozisyonuna kadar perfüzyon bir ve perfüzyon iki çözüm dokuya teslim arasında geçiş yapmak. Ve perfüzyon bir konuma stop horoz değiştirin.Sonra boru seti geri kalanı astar. Tamamen doku içine hava kabarcıkları girmesini önlemek için bir satır lı kabarcık tuzak doldurma. Daha sonra, portal ven dalları ve kateterizasyon için hepatik venlerin kesitlerini ortaya çıkarmak için hepatik dolaşıma dik, temiz bir enine kesi yapın.Ve mevcut, maruz damarları kateterize etmek için rahat bir uygun kateter kullanın. Kateterler yerinde olduğunda, rezeke edilmiş karaciğer dokusunu dakikada 100 milimetrelik akış hızında sıcak perfüzyon bir çözeltiile perfüzyon. Çıkış tüpünü her 30 ila 60 saniyede bir damardan damara taşımak.Ve doku tepsisinden fazla tamponu çıkarmak için bir tahliye tüpü kullanmak. 15 ila 20 dakika boyunca mevcut damarların tüm üzerinden bisiklet sonra, aynı koşullar altında perfüzyon iki çözüm geçmek. Perfüzyon iki çözeltigeri rezervuar geri dönüşüm için bir dönüş pompası kullanarak, daha yavaş bir akış hızında, doku içine yeniden yönetimi için.Hepatositlerin soğumadığını doğrulamak için kabarcık kapanının yüzey sıcaklığını ve karaciğeri her beş dakikada bir kontrol edin. Karaciğer perfüzyon yaklaşık 30 dakika sonra beyazlatma, steril bir drap ile sarılmış steril bir konteyner için doku transferi, ve hepatosit işleme sırasında kısırlık korumak için bir hücre kültür başlık içine konteyner yerleştirin. Hepatositlerin kollajenaz izolasyonu ve hücre ayrışması tamamen yapılmalıdır, böylece hücrelerin canlılığını ve transdüksiyon frekansını azaltan hücrelerde kümelenme olmaz.Karaciğer kapsülü bozmak için hepatosit yıkama orta ve doku üst boyunca makas sürükleyin ile karaciğer batırın. Steril eldiven ler giyerek, hepatositleri ortama salmak için karaciğere hafifçe masaj. Ve steril gazlı bezle 200 mililitre santimetrelik santimetre şişeye doku süpernatant filtre.Filtrelenmiş hepatositleri santrifüj ile toplayın. 150 mililitre taze hepatosit yıkama orta 200 mililitrelik şişe içine 2 ek yıkar için hücreleri havuzlama. Ve üçüncü santrifüjden sonra hücreleri saymak.Daha sonra, mililitre tuzlu konsantrasyonbaşına dokuzuncu hepatosit 1 kez 10 hücreleri seyreltin. İzole hepatositlerin ototransplantasyonu için, ultrason yoluyla portal damarı tanımlamak için iki-beş megahertz dönüştürücü kullanın ve beş inç, 18-gauge iğneana portal damar doğru doğrudan, bu bifurkasyon yaklaşık. Hücreleri toplam hücre hacmine göre 60 mililitrelik şırıngayükleyin ve şırıngayı iğneye takın, kabarcıkları tanıtmamaya özen takın.Daha sonra, nakil sırasında poral basıncı izlemek için bir infüzyon kateter kullanarak portal ven yoluyla 1 kez 10 dokuzuncu hepatositler kadar elle aşılamak için şırınga piston yavaş yavaş bastırın. Tüm hücreler teslim edildiğinde, kateteri çıkarın ve trombotik olayların varlığı ve ultrason ile ileri akışı için portal ven izlemek. Hepatik rezeksiyon yapılan beş domuzdan oluşan temsili bir kohortta, çoğu yaklaşık %80 canlılığa sahip 10'dan dokuzuncu hepatosite kadar verime sahipti.Gen terapisi de dahil olmak üzere istenilen manipülasyon her türlü için yeterli sayıda hücre sağlanması. Bu hazırlanan hepatositlerin nakledilmeyen kısmının sonraki kültürü, transdüksiyon ve ilk kaplamadan 46 saat sonra tipik bir hepatosit morfolojisi ile iyi bir canlılık ve yapVizyon göstermiştir. İlk engraftment transplantasyon sırasında yeniden getirilen hücre sayısına göre değişir.Bu temsili biyopsiler gen düzeltilmiş hücre genişlemesinin bir zaman çizelgesini gösterir. Kalıtsal tyrosinemia tip 1 gibi sağlıklı hücreler için pozitif seçilmiş bir baskıya sahip hastalıklara özgü. Bu genişleme genellikle transplantasyondan 12 ay sonra tamamlanır.Nakledilen fumarylacetoacetate hidrolaz nakavt hayvan karaciğer içinde düzeltilmiş hepatositlerin yaklaşık% 20 yeniden nüfus elde ettikten sonra, tirozin düzeyleri vahşi tip hayvanlara göre normale dönecektir. Düzeltilmemiş hayvanlar yabani hayvanlara göre hem alkali fosfataz hem de aspartat transaminazda önemli bir yükselme gösterirken, ex vivo gen tedavisi bu serum enzimlerini normale döndürür. Ayrıca, tedavi edilmeyen nakavt domuzlarda genel karaciğer metabolik sağlığı bozulur, tedavi edilen hepatositler ile yeniden popülasyondan sonra düzeltilen dolaşımdaki amonyadaki yükselmelerde belirtildiği gibi.Bu tekniği kullanarak kullanımı ile işlemek ve dikkatli ve mümkün olduğunca az doku işlemek önemlidir. Artan işleme veya doku manipülasyonu, hücrelerin canlılığını azaltmak ve verimi azaltmak için yol açar. Bu yaklaşım, viral transdüksiyon protokolleri dışındaki diğer teknikleri kullanarak, etiketleme tekniklerinde yay dağıtımı ve grafik verimsizlikleri üzerinde çalışmak isteyen kişiler için de uygulanabilir.Viral vektörler ile çalışan tehlikeli olabilir unutmayın, bu yüzden uygun biyo güvenlik prosedürleri aşağıdaki, hem de kişisel koruyucu ekipman giyen bu teknikleri kullanırken gereklidir.

Research

JoVE Journal

Medicine

Lentiviral Vector-mediated Gene Therapy of Hepatocytes Ex Vivo for Autologous Transplantation in Swine

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

Ex Vivo Culture of Patient Tissue & Examination of Gene Delivery

Hasta Doku ve Gen Teslimat Sınav Ex Vivo Kültür

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

In Vivo Canine Muscle Function Assay

In Vivo Canine Muscle Function Assay

Vivo Köpek Kas Fonksiyon Testi

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Bağışıklık Eksik Fare Kuruluş ve İnsan Retinoblastom Tümörler yayılımı

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Kanserler Üretim ve reaktif oksijen türlerinin (ROS Algılama)

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Bir Fetal Fare Modelinde Biyoaktif Ajan intratrakeal Yönetimi İçin Yeni Bir Cerrahi Yaklaşım

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

Helper bağımlı adenoviral vektör-Gen Transferi ile Diyabetik Sıçanların Karaciğerinde Neo-Islet Oluşumu

Type 1 diabetes is caused by T cell-mediated autoimmune destruction of insulin-producing cells in the pancreas. Until now insulin replacement is still the ...

Matrix-assisted Autologous Chondrocyte Transplantation for Remodeling and Repair of Chondral Defects in a Rabbit Model

Bir Tavşan Modelinde Kondral Kusurların Tadilat ve Onarım için matris destekli Otolog Kondrosit Nakli

Articular cartilage defects are considered a major health problem because articular cartilage has a limited capacity for self-regeneration 1. Untreated ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Donör karaciğerleri Ex Situ Normotermik Makinesi Perfüzyonu

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation

Normotermik<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Böbrek Koruma Böbrek Nakli Perfüzyon önce greftler

Kidney transplantation has become a well-established treatment option for patients with end-stage renal failure. The persisting organ shortage remains a ...