Name: a novel in vitro model of blast traumatic brain injury
Uploaded: 2018-12-21T13:00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury at JoVE.com

Støttet af: Royal Centre for Defence medicin, Birmingham, Det Forenede Kongerige, Royal British Legion Center for Blast skade studier, Imperial College London, Det Forenede Kongerige. Medical Research Council, London, Storbritannien (MC_PC_13064; MR/N027736/1). Gas sikkerhed tillid, London, Storbritannien. Rita Campos-Pires var modtager af en ph.d.-uddannelse award fra Fundação para en Ciência e Tecnologia, Lissabon, Portugal. Katie Harris var modtager af en PhD studentship fra den Westminster medicinsk skole forskning Trust, London, Storbritannien.
Denne model blev udviklet med støtte af Royal British Legion centrum for Blast skade undersøgelser (RBLCBIS) på Imperial College. Vi vil gerne anerkende den finansielle støtte fra Royal British Legion. Forskere interesseret i samarbejder eller yderligere detaljer kan kontakte forfatterne eller RBLCBIS.
Vi takker Dr Amarjit Samra, direktør for forskning, Royal Centre for Defence medicin, Birmingham, Det Forenede Kongerige, til støtte for dette arbejde, Scott Armstrong, Institut for kirurgi & kræft, Imperial College London, for assistance med foreløbige forsøg , Theofano Eftaxiopolou, Hari Arora & Luz Ngoc Nguyen, Institut for bioteknologi Imperial College London, og William Proud, Institut for fysik Imperial College London, for råd om chok-tube, Raquel Yustos, forskning tekniker, Institut Biovidenskab, Imperial College London, for teknisk support, Paul Brown MBE, workshop manager og Steve Nelson, workshop tekniker, ringe Institut for fysik, Imperial College London, for at gøre metal, Neal Powell af Institut for fysik, Imperial College London, for illustrationer.

De eksperimenter, der er beskrevet i dette manuskript blev udført i overensstemmelse med Det Forenede Kongerige dyr (videnskabelige procedurer) Act fra 1986 og er blevet godkendt af dyrevelfærd & etiske gennemgang kroppen af Imperial College London. Dyrs pleje var i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer fra Imperial College London.
1. hippocampus Organotypic skive forberedelse og kultur
Bemærk: Denne protokol giver mulighed for fremstilling af organotypic hippocampus skiver efter den grænseflademetode beskrevet af Stoppini og kolleger med mindre ændringer21,22,23. Ideelt set bør ikke mere end tre dyr aflives og dissekeret i én session at sikre hvert trin er udført hurtigt og til at undgå at kompromittere kvaliteten af udsnittene. Bruge aseptisk teknik i hele.
<ol><li>Sikre de følgende skridt før du starter dissektionen protokol.<ol>
<li>Forberede og filter sterilisere alle løsninger på forhånd ved hjælp af et 0,22 µm filter.</li>
		<li>Holde løsninger ved 4 ° C under lagring og i hele hjernen dissektion og hippocampus skive forberedelse ved at holde opbevaringsbeholdere og petriskåle på en metal køleprofil sidder på våde is på alle tidspunkter.</li>
		<li>Autoklave alle metal instrumenter, ringe og papir væv.</li>
		<li>Sikre, at alle instrumenter og materiale skal anvendes til hvert trin i protokollen er klar til brug, fastlagt på forhånd og sprøjtes med 70% ethanol. Sikre, at de får lov til at køle ned og tørre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aflive en 5-7 dag-gamle C57BL/6N mus pup af cervikal dislokation og kortvarigt tørre hele hudens overflade med steril papir serviet gennemblødt i 70% ethanol. DUP huden tør og halshugge hvalpen ved hjælp af Mayo saks.</li>
	<li>Skære hovedbund huden med iris saks langs midterlinjen af hovedet begynder i occipital regionen og slutter nær snuden og trække det sideværts.</li>
	<li>Indsæt spidsen af markriyor saks i foramen magnum og gøre to små laterale nedskæringer på knoglen langs de tværgående bihuler, og derefter skære kraniet langs midterlinjen op til den olfaktoriske pære og gøre to små snit vinkelret med midterlinjen i denne region.</li>
	<li>Ved hjælp af fine punkt buet pincet, trække sildelapper af knogle lateralt fra midterlinjen, forsigtigt fjerne hjernen med en lille spatel og overføre det til en 90 mm silikone elastomer-belagt petriskål indeholdende "dissektion medium". Bemærk: Dissektion medium er Geys afbalanceret saltopløsning (5 mg/mL D-glucose, 1% antibiotikum-antimykotikum løsning, med 10.000 enheder/mL penicillin, 10 mg/mL streptomycin og 25 µg/mL amphotericin B).</li>
	<li>Fjerne lillehjernen og adskille de cerebrale hjernehalvdele langs midterlinjen ved hjælp af et barberblad. Brug en spatel til at overføre hjernehalvdele til en ny 90 mm silikone elastomer-belagt petriskål fyldt med frisk iskold dissektion medium. Hvis mere end ét dyr der skal bruges i en session, skal du gentage trin 1,2-1,6.</li>
	<li>Under et stereomikroskop, skære de olfaktoriske pære og aflæsse af frontal cortex med et barberblad og hjernebarken er adskilt fra resten af den cerebrale væv ved hjælp af fin spids pincet. Dette trin efterlader hippocampus udsat på den mediale overflade af kortikale væv. Fra dette skridt fremad, bruge en laminar flow vævskultur hætte (ultraviolet steriliseret og rengøres med 70% ethanol løsning).</li>
	<li>Anvende iskold dissektion medium på en flad plastik sønderdeling disk, og ved hjælp af en spatel, Placer hjernevæv på disken så den mediale overflade af cortex vender opad og hippocampus akse er vinkelret på aksen af den sønderdeling blade.</li>
	<li>Fjern så meget som muligt af dissektion medium fra sønderdeling disk ved hjælp af en fin spids Pasteur pipette.</li>
	<li>Skær hjernen i 400 µm skiver ved hjælp af en væv chopper en 50% sønderdeling hastighed og kraft. Bemærk: Det er meget vigtigt, at dette skridt er gjort så hurtigt som muligt, da hjernevæv ikke er nedsænket i dissektion medium.</li>
	<li>Erstatte dissektion medium i silikone elastomer-belagt petriskål med friske iskold medium.</li>
	<li>Når væv chopper er færdig, omhyggeligt nedsænkes hjernevæv i frisk dissektion medium, og overføre cut vævet tilbage til 90 mm silikone elastomer-belagt petriskålen ved hjælp af en lige klinge skalpel.</li>
	<li>Under et stereomikroskop forsigtigt adskille kortikale skiver ved hjælp af fin spids pincet. For hver skive, inspicere hippocampus for morfologi og potentiale vævsskader som følge af dissektion eller udskæring.</li>
	<li>Adskille hippocampi fra entorhinal cortex og fra fimbria ved hjælp af små markriyor saks og fin spids pincet. Typisk genereres omkring 6 til 8 hippocampus skiver pr. halvkugle.</li>
	<li>Overføre op til 6 hippocampus skiver til en vævskultur indsætte ved hjælp af en cut Pasteur pipette og sted det inde i en 35 mm Petri fad. Sikre, at skiverne er spredes et par millimeter fra hinanden (Dette sikrer hver skive kan være afbildet individuelt).</li>
	<li>Straks tilføje iskold "vækstmedium" til bunden af hver petriskål, under Indsæt vævskultur lige under toppen af vævskultur indsætte rand. Bemærk: Vækstmediet indeholder 50% Minimum afgørende medium Eagle, 25% Hanks' afbalanceret saltopløsning, 25% hest serum, 5 mg/mL D-glucose, 2 mmol/L L-glutamin, 1% antibiotikum-antimykotikum løsning og 10 mmol/L HEPES, titreres til pH 7,2 med natriumhydroxid.</li>
	<li>Ændre vækstmediet dagen efter dissektion og derefter hvert 2 til 3 dage derefter (brug vækstmediet ved 37 ° C). Sikre at vækstmediet er tilføjet i tilstrækkelig mængde, men ikke så meget at det overløb over vævskultur Indsæt membran, som kunne kompromittere levedygtigheden af væv skiver.</li>
	<li>Holde væv skiver i en fugtig inkubator ved 37 ° C med 5% kuldioxid i luften i 12 til 14 dage før anvendes i eksperimenter.</li>
</ol>2. forberedelse af hippocampus Organotypic skiver for eksperimenterende Blast TBI protokol
Bemærk: Alle trin i dette afsnit, undtagen billedbehandling, der finder sted i en laminar flow vævskultur hætte.
<ol><li>Indsæt de skræddersyede rustfrit stål ringe i en 6 godt plade, (en pr. brønd). NOTER: Ringene har en rand med et hak, (som skal sidde i klokken-12-position) og passer stramt inde wells, mens vævskultur indsætter passer nemt i denne rand. Sikre, at ringene er vasket med en bakteriedræbende desinfektionsmiddel, grundigt skylles med renset vand, autoklaveres og lov til at køle ned i forvejen.</li>
	<li>Fyld godt af 6-godt plade med pre varmede (37 ° C) serumfrit "eksperimentelle medium" med propidium Iodid. Bemærk: Eksperimenterende medium med propidium Iodid er: 75% Minimum afgørende medium Eagle, 25% Hanks' afbalanceret saltopløsning, 5 mg/mL D-glucose, 2 mmol/L L-glutamin, 1% antibiotikum-antimykotikum løsning, 10 mmol/L HEPES og 4,5 µmol/L propidium Iodid, titreret pH til 7,2 med natriumhydroxid.</li>
	<li>Sikre, at niveauet af mediet ikke nå over notch af ringen. Overføre 6-godt pladen med ringene tilbage til rugemaskine for 1 h at sikre, at mediet er ved 37 ° C umiddelbart før vævskultur indsatser er overført.</li>
	<li>Overføre vævskultur skær med organotypic skiver fra 35 mm petriskåle til 6-godt plade med ringene og den eksperimentelle medium med pincet.</li>
	<li>Gøre en prik på Indsæt rand i 3 klokken stilling med en permanent tusch. Bemærk: Indsætter vil blive fjernet fra 6-godt plade under eksperimentet og dette trin letter tilbage indsætte til sin oprindelige position efter trykbølge eksponering og nemt holde styr på hver skive hele protokollen.</li>
	<li>Label hver 6-godt plade med et entydigt navn & dato og laver et kort over wells af hver plade, navngivning hver brønd (fx., A, B, C, osv.) og hver skive i hver brønd (fx., 1, 2, 3, osv.), således at hver skive har et entydigt id ( fx., A1, A2, A3, osv.).</li>
	<li>Overføre 6-godt plade til rugemaskine for 1 h sikre skiver ved 37 ° C umiddelbart før billeddannelse. Bemærk: Undgå overløb af medium eller nogen bobler af luft nedenunder vævskultur indsætte membran, som kunne kompromittere levedygtigheden af udsnittene.</li>
	<li>1 h efter overførsel til eksperimentelle medium, billede hver skive individuelt ved hjælp af et fluorescens mikroskop (2 X mål, NA 0,06) forsynet med en passende excitation (BP 535/50 nm) og emission (LP 610 nm) filter for at vurdere skive sundhed før skaden protokollen er udført. NOTER: I skiver, der udviser områder af tæt rød farvning på dette tidspunkt bør overvejes at præsentere kompromitteret levedygtighed og bør udelukkes fra yderligere analyse (disse repræsenterer typisk mindre end 10% af det samlede antal skiver genereret). Sikre at billeddannelse udføres sekventielt og så hurtigt som muligt for at minimere den tid, skiver er uden for rugemaskinen (typisk 6 wells bør tage lige under 30 min til billede).</li>
	<li>Holde låget af 6-godt plade på alle tidspunkter. Nogle kondens kan bygge på indersiden af låget. Hvis dette sker, kortvarigt brug en hårtørrer på den simpel nedgang.</li>
	<li>Sikre, at alle tænkelig betingelser er identiske på forskellige dage og mellem eksperimenter. Bemærk: Formålet med billedbehandling er at kvantificere væv fluorescens, derfor dette trin er vigtigt at sikre reproducerbarheden af resultaterne og give mulighed for sammenligning af oplysninger indhentet.</li>
</ol>3. neddykning og Transport af vævskultur indsætter med hippocampus Organotypic skiver
<ol><li>Umiddelbart efter imaging, i en laminar flow hætte, tage en vævskultur Indsæt ud af 6-godt pladen med pincet.</li>
	<li>Omhyggeligt boblede overførsel Indsæt til en steril polyethylen pose (3 "x 5") pre fyldt med 20 mL varm (37 ° C) eksperimentelle medium frisk med 95% ilt og 5% kuldioxid. Bemærk: Sikre, at ilt og kuldioxid beriget eksperimentelle mediet var boblede i mindst 40 min med 95% ilt og 5% kuldioxid ved hjælp af en scintered-glas absorptionskolbe inde i en Dreschel flaske og overføres til sterile polyethylen poserne indeni en laminar flow vævskultur hood ved hjælp af en 20 mL sprøjte med en bakteriel filter og en steril påfyldning røret (127 mm) vedlagt. Forsegl poserne straks og overføre dem til en 37 ° C inkubator i mindst 1 time før vævskultur indsætter overførsel.</li>
	<li>Sikre, at hver steril pose er korrekt mærket (med plade og godt identifikation). Gentag dette trin for hver vævskultur Indsæt. Udelukke luftbobler omhyggeligt efter forsegling sterile poser (gjort sikkert ved at dreje toppen af poserne og ved at anvende en plastic klemme).</li>
	<li>Returnere de sterile poser med vævskultur skær og 6-godt plader med eksperimentelle medium til 37 ° C inkubator.</li>
	<li>Efter 1 time, omhyggeligt pakke sterile poser med vævskultur skær i plastkasser inde en thermo-regulerede kasse fyldt med afioniseret vand ved 37 ° C for at holde organotypic skiver ved fysiologisk temperatur i hele trykbølge eksponering protokol.</li>
</ol>4. forberedelse af stødrørs stødbølgehastighed og hippocampus Organotypic skive trykbølge eksponering
<ol><li>Bære stål-tå beskyttende støvler, en laboratoriekittel og handsker under forberedelsen af stødrørs stødbølgehastighed og trykbølge eksponering.</li>
	<li>Bolt steril pose indehaveren ramme til chok tube distale flange, at sikre, at den centrale hul er justeret med stød rør outlet (ved hjælp af en afblænding stang).</li>
	<li>Montere to Tryktransducere radialt: sensor 1, i den midterste del af drevet sektion og sensor 2 i den distale flange stødrørs stødbølgehastighed (figur 1A). Tilslut Tryktransducere til et oscilloskop gennem en aktuel kilde magt enhed.</li>
	<li>Sikre, at alle stød rør release ventiler og flow kontrol er lukket.</li>
	<li>Åbn den eksterne Trykluftforsynede og opkræve magnetventil til 2,5 bar.</li>
	<li>Åbne trykluft cylinder sikkerhedsventil og langsomt åbne trykregulator for at øge trykket til cirka 5 bar. Bemærk: Det pres, der er angivet for denne regulator skal være lidt over højeste mellemgulvet sprængfyldt pres.</li>
	<li>Forberede membraner af skæring 23 µm-tyk polyester ark i 10 x 10 cm2 firkanter. Forberede håndtag ved hjælp af autoklave tape og stikke dem til toppen og bunden af hver membran.</li>
	<li>Placer en membran (enkelt slot af dobbelt underkroppræsentation - enkelt membran konfiguration) eller to membraner (begge slots af dobbelt underkroppræsentation - dobbelt membran konfiguration) i underkroppræsentation (figur 1B).</li>
	<li>Centrere membraner, og klemme dem ved hjælp af fire M24 bolte og møtrikker, fastgørelse dem sekventielt i en diagonalt symmetrisk måde, og at sikre, at membraner er rynke-fri.</li>
	<li>Klemme hver steril pose individuelt i lodret position på rammen indehaveren, sikre, at overfladen af vævskultur skær med organotypic hippocampus skiver står chok tube outlet og vævskultur Indsæt er centreret inde den sterile taske (figur 1 c). Sørg for, at den steril pose sikkert fastspændt rundt omkring for at sikre fast og endda immobilisering.</li>
	<li>Bære øre forsvarere og sikkerhed briller når pres stødrørs stødbølgehastighed. Tænd for den aktuelle kilde strømforsyning med oscilloskop at erhverve chok bølge data (erhvervelse sats på 50 mega-prøver/s, record længde 20 ms, 1 million point) og lukke magnetventil.</li>
	<li>Brug kontrolknappen flow på chok tube Kontrolpanel, langsomt presse driver volumen sektion af stødrørs stødbølgehastighed for enkelt membran konfiguration eller både driver volumen sektion og sektionen dobbelt underkroppræsentation af stødrørs stødbølgehastighed for dobbelt membran konfiguration. Bemærk: For enkelt membran konfiguration, brast pres vil afhænge kun mellemgulvet materiale og tykkelse og mellemgulvet vil briste spontant når materialet sprængfyldt pres er nået. Dobbelt membran konfiguration, bristende trykket også afhænge af gastryk differentieret i både driver og dobbelt underkroppræsentation kamre, og for membraner til at sprænge på en kontrolleret måde, dobbelt underkroppræsentation sikkerhedsventil åbnes manuelt en gang target pres er nået.</li>
	<li>Så snart mellemgulvet bristninger (producerer en knald), hurtigt lukke komprimeret luft flow ved hjælp af flow knop og åbne magnetventil. Bemærk: Det samlede volumen af driver sektion kan ændres ved indsættelse af afblænding segmenter, giver mulighed for en bredere vifte af shock wave peak overtryk og varigheder fremstilles. Den ideelle kombination af trykbølge parametre bør være nok til at forårsage vævsskade, men ikke så højt, at det forårsager væv kultur Indsæt eller steril pose forvrængning eller brud.</li>
	<li>Udsætte hver steril pose med en vævskultur indsætte til et enkelt rør trykbølge og returnere den straks til boksen thermo-regulerede, før en ny steril pose er taget fra boksen og fastspændt på rammen indehaveren. Sikre, at trin 4.10-4.14 udføres som glat og hurtigt som muligt (inden for et par minutter) for at forhindre den eksperimentelle medium afkøling ned, som temperaturer under 37 ° C kan forstyrre skade udvikling.</li>
	<li>Når alle vævskultur skær har været udsat for en trykbølge (eller sham protokol), returnere vævskultur skær til den originale 6-godt plade og til deres respektive godt (inde i en laminar flow vævskultur hætte) og vende tilbage til rugemaskine.</li>
	<li>Holde 6-godt plade i kuvøse med 5% kuldioxid i luften ved 37 ° C indtil videre imaging.</li>
	<li>Omfatte sham styringer til hvert eksperiment, sammen med skive trykbølge eksponering. Bemærk: Sham skiver behandles ens til skiverne er udsat for en trykbølge (forseglet i sterile poser med eksperimentelle medium, transporteres til chok tube laboratorium i samme thermo-reguleret boks og suspenderet på metal rammen for en tilsvarende periode tid) men chokket tube er ikke fyret.</li>
</ol>5. hippocampus Organotypic skive skade kvantificering
<ol><li>På 24, 48 og 72 h, image skiver som beskrevet i trin 2.8 og 2.9.</li>
	<li>Efter imaging på 72 h post trykbølge eksponering, kassér væv følgende lokale biologisk affald protokoller og desinficere og autoklave metal ringe.</li>
</ol>

Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Blandt alle mekanismerne af skade tilknyttet blast TBI (primære, sekundære og tertiære blast skade mekanismer), primære blast skade er unik for blast traumer og det er forstået mindst af blast-associerede mekanismer1,2 . Den nye protokol beskrevet her blev udviklet for at studere primære blast TBI ved hjælp af en open-ended stødrørs stødbølgehastighed for at eksponere in vitro- mus hippocampus skive kulturer til en enkelt chok bølge ved hjælp af en enkel og hurtig protokol, der tillader oprettelsen af en reproducerbar primære blast TBI med en høj overførselshastighed.
Første i vitro primære blast TBI modeller anvendes hydrostatisk trykbølger til celler26,27. Pres output ikke model Friedlander funktion som varigheden af en hydrostatisk tryk puls blev meget længere end luftbårne blast overtryk bølger13. Karakteristiske Friedlander funktion kan modelleres let i laboratoriet ved hjælp af et stød rør1,8. Stødrørs stødbølgehastighed kan producere chokbølger, som simulerer virkelige liv friland eksplosioner i en konventionel laboratoriemiljø, samtidig med at den præcis kontrol af bølge parametre, såsom peak overtryk, positive bølge varighed og impuls, ved at variere den mellemgulvet materiale og tykkelse, og driver bind8,28,29.
Enkel in vitro- modeller som cellekulturer mangler normalt heterogenitet celletyper og synaptisk forbindelse30. Effekten af blast på in vitro- hjerne celle 'spheroids' indarbejde forskellige celletyper har for nylig været undersøgte31. Yderligere undersøgelser af disse interessante præparater er fortjent; men det er ikke klart, hvordan deres cellulære organisation og connectivity spejle intakt hjernen. OHSC er en veletableret in vitro- eksperimentel model23,32, er nemme at kultur og deres tre-dimensionelle væv cytoarchitecture, Celledifferentiering og synaptisk forbindelse er godt bevaret og meget svarende til i vivo33,34,35,36. OHSCs repræsenterer en mellemliggende niveau af kompleksitet mellem cellekultur og en i vivo model23,32. OHSCs er blevet påvist at reproducere in vitro patologiske neurodegenerative cascades set i i vivo modeller og har været meget nyttig i screening af potentielle neuroprotektive narkotika og forstå deres mekanismer af aktion17,21,22,37,38. Endelig, den anatomiske område studerede, hippocampus, er yderst relevant i translationel TBI undersøgelser, som denne region er ofte beskadiget i TBI patienter39,40,41. OHSC har været brugt til model blast TBI28,42,43,44, men vores model er relativt simpel og kan være tilpasset til eksisterende stødrør i enten vandret eller lodret konfigurationer uden komplekse tilpasninger.
OHSC kan holdes i kultur i mange dage, som letter undersøgelsen af biologiske processer over tid34. I denne model, den vævsskade, der førte fra trykbølge eksponering blev målt dagligt over tre dage, efter at blast eksponering ved hjælp af propidium Iodid, en veletableret markør for celleskader. Propidium Iodid er en ugiftige meget polar farvestof, der trænger ind i celler med kompromitteret cellulære membraner, hvor det binder sig til nukleinsyrer og udstiller en karakteristisk lyse røde fluorescens24,25,45. Fluorescens målt med propidium Iodid har vist sig at have en god korrelation med tilskadekomne celletal bruger Nissl farvning46,47.
Betragtning af, at den skade, der er produceret i denne model var diffuse (figur 2 c), blev fluorescens af det hel skive målt ved udførelse af analyse, svarende til tidligere publicerede artikler i andre hjerne skade paradigmer21,22 , stedet for at bruge bestemte regioner, som er sket i andre in vitro- blast TBI modeller28,43,44,48. Den globale tilgang anvendes i den model, der er beskrevet i denne artikel også eliminerer den potentielle variabilitet, der indføres når skitserer definerede regioner af interesse og giver et mere omfattende billede af den blast-relateret skade. Både trykbølge peak overtryk, 50 kPa og 55 kPa, fremstillet signifikant (p < 0,05 og p < 0,0001, henholdsvis) skade sammenlignet med fingeret skiver (figur 2B). Som forventet, trykbølge med den højeste peak overtryk, fremstillet 55 kPa, mere skade end 50 kPa bølge. I en in vitro- model med isolerede hjernen udsat væv direkte for et shockwave, hvordan man præcist skala til hele organismen eller et menneske er ikke ligetil. Ikke desto mindre er chokbølger brugte vi inden for rækkevidde af peak overtryk observeret i området, typisk 50-1000 kPa8,49.
For at opretholde OHSC udsat for fysiologisk temperatur og niveauer af ilt og kuldioxid, samtidig med at de var fri for forurening i hele trykbølge eksponering protokol, blev vævskultur skær forseglet i sterile polyethylen poser efter en aseptisk teknik, nedsænket i eksperimentel medium opvarmet til 37 ° C og frisk boblede med 95% ilt og 5% kuldioxid, ligeledes til tidligere offentliggjorte arbejde28,43,44 ,48. I modsætning til disse modeller, hvor komplekse enheder blev brugt til at holde de sterile poser under trykbølge eksponering, i denne protokol, blev en enkel og hurtig metode brugt til at suspendere OHSC vævskultur skær foran chok tube outlet (figur 1A, C ). Den model, der er beskrevet i denne hvidbog giver mulighed for hurtig behandling og høj produktivitet, samtidig minimere risikoen for hypotermi. Disse aspekter er særligt relevante for neuroprotection undersøgelser, da nogle terapeutiske indgreb kan have en meget begrænset tidsvindue for potentielle anvendelse efter TBI. Denne roman trykbølge eksponering protokol giver 6 til 9 vævskultur indsætter (typisk 36 til 54 hippocampus organotypic væv skiver) for at blive udsat for en trykbølge i en kort tidsinterval (ca. 1 h).
OHSCs kræver god aseptisk teknik i hele. Det er vigtigt at bruge en aseptisk laminar flow hood i hele den dyrkning og ved overførsel til de sterile poser til blast. For at gennemføre slice imaging under aseptiske forhold med låg af 6-godt plader i sted, bruger vi skræddersyede metalringe for at øge celle kultur skær til brændplanet af mikroskopet. En vigtig del af vores protokol er, at vi medtager uskadt sham skiver i hvert eksperiment. Fingeret skiver behandles ens blast udsnit med den undtagelse at chok-rør ikke er fyret; et andet vigtigt skridt er, at alle skiver er afbildet 1 h før skade eller fingeret behandling, at sikre sundheden for befolkningen i skiver bruges identiske (figur 2B).
Ud over at kvantificere celle skade i skiver over tid, kan vævet fastsættes i slutningen af forsøget for konventionelle Immunhistokemi50. Vi udviklede og evalueret metoden ved hjælp af musen hippocampus skiver. Vores teknik kunne dog let tilpasses til brug andre væv, der kan dyrkes i kultur, såsom rygmarv, nethinden, lunge eller epitelvæv. I dette papir og vores tidligere arbejde med modellen undersøgt vi kun effekt af eksponering for en enkelt blast. Men modellen ville være velegnet til at undersøge virkningerne af gentagen low-level Blaster på hjernen eller andre væv. OHSCs kan opbevares i kultur i mange uger eller endda måneder, giver kroniske virkninger skal undersøges.
In vitro modeller, bliver enklere end i vivo modeller, har en højere overførselshastighed, er billigere og eksperimenter kan normalt gennemføres på en kortere tid skala17. Men resultaterne ved hjælp af in vitro- modeller skal valideres i dyremodeller, som in vitro- kulturperler væv er holdt i et kunstigt miljø og kan reagere på skade forskelligt fra, hvad de ønsker i vivo17. Ikke desto mindre, in vitro- modeller har været meget værdifulde i at øge vores forståelse af hjernen skade kaskader og i screening neuroprotektive narkotika før brug af mere komplekse i vivo modeller17,22 , 51 , 52. trods de mange fordele, som denne model, det er vigtigt at bemærke, at in vitro- modeller mangler nøglen funktioner til TBI er til stede i dyr og i vivo modeller, såsom effekter på vaskulære system, øget intrakranielt pres, systemisk immunrespons og funktionelle adfærdsmæssige værdiforringelse, som fremhæver behovet for at validere resultaterne fundet i in vitro- modeller i hele dyret. In vitro- modeller som den model, der er beskrevet i denne hvidbog er imidlertid yderst nyttige translationally relevante videnskabelige værktøjer.
Afslutningsvis, beskriver dette arbejde en enkel og ligetil roman metode hvor mus organotypic hippocampus vævskulturer udsættes for stramt kontrolleret og reproducerbare virkelige relevante chokbølger ved hjælp af et laboratorium stød rør. Den deraf følgende globale skade, som var kvantificeres ved hjælp af propidium Iodid, en veletableret markør for celleskader, reproducerbare meget og er proportional med peak overtryk af chokbølger anvendes.

Blast traumatisk hjerneskade (TBI) er en kompleks type af hjerneskade, at resultaterne fra detonationen af eksplosive anordninger1,2. Blast TBI fremstod som et stort sundhedsproblem i de sidste 15 år med de seneste militære konflikter i Irak og Afghanistan2,3. Samlet, det anslås, at mellem 4,4% og 22,8% af soldater vender hjem fra Irak og Afghanistan har lidt mild TBI, en stor del af disse er blast-relaterede, med en højere rapporterede blast TBI i de amerikanske styrker sammenlignet med UK styrker4 ,5.
Brugen af improviserede eksplosive anordninger har været ansvarlig for de fleste af blast-associerede traumer, herunder blast TBI, udholdt af militære styrker6. Detonation af en sprængladning resulterer i en meget hurtig — men forbigående — øge i tryk, forekommer i millisekunder. Den resulterende overtryk bølge fra en real-life gratis felt eksplosion er modelleret af funktionen Friedlander med en pludselig stigning til peak overtryk efterfulgt af en eksponentiel henfald7,8. Rækken af ekstreme kræfter og deres hurtige tidsforløb set i en blast begivenhed er normalt ikke oplevet i ikke-blast traumer1,9. Peak overtryk, som er den maksimale tryk af bølgeform, og varigheden af den positive bølge menes at være vigtige bidragsydere til blast hjerneskade og disse afhænger den sprængladning og afstanden fra detonation10, 11.
Det traume, at resultaterne fra en eksplosiv blast er klassificeret som fire diskrete komponenter, udpeget som primær, sekundær, tertiær og kvaternære blast skade10,12,13,14. Hver af disse komponenter er forbundet med specifikke mekanismer til skade. Primære blast skade skyldes direkte aktion af overtryk bølge på organer og væv,2,13. Sekundære blast skade resultaterne fra virkningen af projektil fragmenter, forårsager gennemtrængende og ikke-gennemtrængende sår2,15. Tertiære blast skade opstår når offerets krop er fordrevet mod jorden eller omkringliggende objekter og er forbundet med acceleration/deceleration styrker1,10,13. Kvaternære blast skade beskriver en heterogen gruppe af skader direkte relateret til eksplosionen ikke er omfattet af de første tre skade mekanismer beskrevne12,13. Det omfatter (men er ikke begrænset til) termisk skade, røg indånding, stråling, elektromagnetiske bølger og psykiske bivirkninger13,15. De fleste blast-associerede TBI resultater direkte fra de første tre mekanismer til skade, mens de Kvartære mekanismer af blast skade er normalt forbundet med systemisk skade13. Virkningerne af acceleration/deceleration kræfter (fx, whiplash), stumpe og gennemtrængende traumatisk hjerneskade er blevet grundigt undersøgt i forbindelse med andre typer af TBI (f.eks.motordrevet køretøj nedbrud, falls, ballistiske skade). Men den primære overtryk trykbølger er unikke til blast skade og dens virkninger på hjernevæv er langt mindre godt forstå16. De primære blast skade mekanismer, forbundet med et overtryk bølge, er først af de mekaniske kræfter til at interagere med hjernen.
Talrige prækliniske TBI modeller er blevet udviklet over de sidste årtier, der har været uvurderligt at forstå blast TBI mekanismer af skade og patofysiologi og undersøge potentielle nye behandlinger, som ellers ville være umuligt at gøre udelukkende i en klinisk indstilling17,18,19. Selv om ingen enkelt prækliniske model kan reproducere kompleksiteten af kliniske blast hjernen traumer, typisk kopiere forskellige prækliniske TBI modeller forskellige aspekter af menneskelig TBI. Den skadelige påvirkning af kræfter tilknyttet en blast eksplosion kan studeres, isoleret eller i kombination i både in vitro- og i vivo blast TBI modeller. In vitro modeller har fordelen, at en stram styring af eksperimenterende miljø (væv fysiologiske forhold og skade biomekanik), som reducerer biologiske variation og forbedrer reproducerbarhed, tillader undersøgelse af specifikke molekylære kaskader uden konfoundere stede i dyre modeller20. Vores mål var at udvikle en in vitro- model for at undersøge virkningerne af primære blast på hjernevæv. Vi havde til formål at udvikle en model med en supersoniske shockwave med Friedlander bølgeform repræsentant for et fri-felt eksplosion som den, der produceres af en improviserede eksplosive anordninger (IED).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Geys balanced salt solution</td>
			<td>Sigma UK</td>
			<td>G9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D- glucose</td>
			<td>Sigma UK</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic</td>
			<td>Sigma UK</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium Eagle</td>
			<td>Sigma UK</td>
			<td>M4655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks balanced salt solution</td>
			<td>Sigma UK</td>
			<td>H9269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Sigma UK</td>
			<td>H1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma UK</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR Prolabo, Belgium</td>
			<td>441476L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma UK</td>
			<td>S-0945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture inserts</td>
			<td>Millicell CM 30 mm low height Millipore</td>
			<td>PICM ORG 50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>NUNC, Denmark</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma UK</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile polyethylene bags - Twirl&#39;em sterile sample bags</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>01-002-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portex Avon Kwill Filling Tube 5&#34; (127mm)</td>
			<td>Smiths Medical Supplies</td>
			<td>E910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>NIKON Eclipse 80i, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objective</td>
			<td>Nikon Plan UW magn. 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter</td>
			<td>Nikon G-2B (longpass emission)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar electrical insulating film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm</td>
			<td>RS Components UK</td>
			<td>785-0782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure transducer</td>
			<td>Dytran Instruments Inc.</td>
			<td>2300V1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper</td>
			<td>Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, United Kingdom.</td>
			<td>Mcllwain tissue chopper</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>Dow Corning, USA</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing &#38; statistics software</td>
			<td>GraphPad Software, USA</td>
			<td>Prism 7.0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel in vitro model of blast traumatic brain injury

Traumatisk hjerneskade er en førende årsag til død og invaliditet i militære og civile befolkninger. Blast traumatisk hjerne skade resultaterne fra detonationen af eksplosive anordninger, men de mekanismer, der ligger til grund for hjerneskade som følge af blast overtryk eksponering er ikke helt forstået og menes at være unikke for denne type af hjerneskade. Prækliniske modeller er afgørende værktøjer, der bidrager til bedre for at forstå blast-induceret hjerneskade. En roman i vitro blast TBI model blev udviklet ved hjælp af en open-ended stødrørs stødbølgehastighed for at simulere virkelige open-felt blast bølger modelleret af Friedlander bølgeform. C57BL/6N mus organotypic hippocampus skive kulturer blev udsat for enkelt chokbølger og udviklingen af skade var kendetegnet op til 72 h, ved hjælp af propidium Iodid, en veletableret fluorescerende markør for celleskader at kun trænger celler med kompromitteret cellemembraner. Propidium Iodid fluorescens var betydeligt højere i skiverne er udsat for en blast wave sammenlignet med fingeret skiver hele varigheden af protokollen. Væv hjerneskade er meget reproducerbare og proportional med peak overtryk af chok bølge anvendes.

Stødrørs stødbølgehastighed brugt i denne metode giver mulighed for generation af overtryk transienter, der simulerer virkelige liv friland eksplosioner modelleret af Friedlander funktion7,8. Supersoniske chokbølger med en hastighed på 440 m/s (Mach 1.3) blev opnået (figur 2A). Bølgeform data rapporterede er fra sensor 2, placeret radiært i slutningen af afsnittet drevet af stødrørs stødbølgehastighed.
Ved hjælp af protokollen, der er beskrevet ovenfor, udvikle organotypic hippocampus skive kulturer udsat for en enkelt chok bølge (figur 2A) betydelig skade kvantificeres ved hjælp af propidium Iodid, et stærkt polar fluorescerende farvestof, der kun trænger celler med kompromitteret cellemembranerne24,25 (figur 2B, C).
Selv under optimale betingelser, og konsekvent til andre OHSC offentliggjort modeller21,22, der er et lavt niveau af baggrunden propidium Iodid fluorescens skyldes, dels at mindre skader som følge af de iboende væv manipulationer ( såsom media ændringer i den kultur eller fjernelse fra rugemaskinen for imaging). Denne blast TBI protokollen indebærer betydelige manipulation, der omfatter nedsænkningen af skiver i medium inde sterile tasker og en betydelig grad af håndtering under trykbølge eksponering protokol (fx., fastspænding sterile poser til den indehaveren ramme). Men hvis alle trin er udført omhyggeligt, denne ekstra manipulation ikke har indflydelse på den underliggende sundhedsmæssige af OHSC som ingen væsentlige forskelle blev set mellem en kontrolgruppe af skiver holdt i 6-godt plader på alle tidspunkter (dvs., indsætter var ikke neddykket eller håndteret) og gruppen sham, som omfattede udsnit, der var neddykket inde sterile poser fastspændt til chok røret (figur 2B).
De to chokbølger valgt, på 50 kPa og 55 kPa peak overtryk, produceret signifikant (p < 0,05 og p < 0,0001, henholdsvis) og reproducerbare skade sammenlignet med den uskadt sham skiver på alle tidspunkter efter blast eksponering protokol (figur 2B) uden at forårsage nogen skade på vævskultur skær eller de sterile poser. For at bestemme følsomheden af model til små forskelle i peak-overtryk, besluttede vi at vælge værdier, der var anderledes ved ~ 10%. Disse resultater viser også, at, som forventet, den skade som følge af 55 kPa er højere end efter en 50 kPa trykbølge.
Dataene, der er udtrykt i gennemsnit ± standard fejl af middelværdien. Betydning blev vurderet ved hjælp af en 2-vejs gentagne foranstaltninger variansanalyse brug af Holm-Sidak post hoc test. Faktor 1 var gruppe (kontrol, sham, blast) og faktor 2 var tid efter skade (-1 h, 24, 48 og 72 h), hvor faktor 1 var den gentagne faktor. Justering af p -værdi for flere sammenligninger blev brugt. P værdier af mindre end 0,05 blev taget til at angive en signifikant forskel mellem grupper. Statistiske test blev gennemført ved hjælp af en graftegning og statistik softwarepakke.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58400/58400fig1.jpg"> Figur 1: skematisk af stød rør enhed med steril pose indehaveren ramme. (A). stødrørs stødbølgehastighed er en 3,8 m lange rustfrit stål rør, fremstillet af tre 1,22 m lange strækninger, sluttet pakninger og flanger, med en indre diameter på 59 mm. (B) Inset viser den dobbelte underkroppræsentation forsamling. En eller to Mylar membraner kan blive fastspændt i forsamlingen med tætning af gummi o-ringe. (C) steril pose indehaveren ramme. Selve rammen består af to metalplader med en centreret cirkulært hul (59 mm diameter) der flugter med stød rør outlet. To tynde (4 mm) ark af silikoneelastomer er monteret mellem de to metalplader. Formålet med disse plader er at give en jævn og ikke-glatte overflade for at klemme de sterile poser. Afstanden mellem posen og outlet af stødrørs stødbølgehastighed er 7 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58400/58400fig1large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58400/58400fig2.jpg"> Figur 2: typisk shockwave og deraf følgende skade i organotypic hippocampus skær kulturer. (A) repræsentative eksempel på trykbølge fremstillet ved hjælp af 23 µm-tyk polyester film, 2.16 bar burst pres, 55 kPa peak overtryk, 0,4 ms positive bølge varighed, 10,1 kPa·ms impuls. Bølgeform data blev indhentet fra sensor 2 radialt monteret på den distale flange stødrørs stødbølgehastighed drevet sektion. Trykbølge hastighed var 440 m/s (Mach 1.3). (B) udviklingen af skade er proportional med intensiteten af trykbølge. Både 50 kPa og 55 kPa peak overtryk chokbølger forårsaget betydelig skade, der er udviklet i hele 72 h protokollen sammenlignet med gruppen humbug. Skade som følge af en 55 kPa peak overtryk bølge eksponering var betydeligt højere end efter 50 kPa på 48 timer og 72 h. Sham skiver blev behandlet identisk til blast skiver men stødrørs stødbølgehastighed blev ikke fyret. Kontrol skiver blev opretholdt i 6 godt plader i en inkubator uden manipulation. Søjler repræsenterer middelværdier og fejl barer er standard fejl (n = 7, objekter; n = 48, sham; n = 30, blast 50 kPa; n = 51, blast 55 kPa; n = antallet af skiver, fra 6 separate eksperimenter). * p < 0,05, *p < 0,0001 sammenlignet med humbug. # p < 0,05, #p < 0,01 sammenlignet med blast 55 kPa. (C) repræsentant propidium Iodid fluorescens billeder af organotypic skiver fra (jeg) sham, (ii) blast 50 kPa og (iii) blast 55 kPa grupper på 72 h efter skade. Fingeret skive viser lave niveauer af fluorescens, dvs., skade, og blast udsatte skiver viser høje niveauer af diffus skade, mere udtalt på 55 kPa peak overtryk udsat Skive (skalalinjen = 500 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58400/58400fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury at JoVE.com

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Dette papir beskriver en ny model af primære blast traumatisk hjerneskade. En komprimeret luft drevet stødrørs stødbølgehastighed bruges til at afsløre i vitro mus hippocampus skive kulturer til en enkelt trykbølge. Dette er en enkel og hurtig protokol skaber en reproducerbare hjernen vævsskade med en høj overførselshastighed.

En roman In Vitro Model af Blast traumatisk hjerneskade

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for blast skadelige traumatisk hjerneskade og kan bruges til at screene neuroprotektive lægemidler før brug af mere komplekse i Vivo modeller. Den største fordel ved denne teknik er, at det bruger et laboratorieinstrument til at udsætte i Vitro masse hjernevæv til en shockwave ved hjælp af en enkel og høj gennemløb protokol, der gør det muligt at skabe en reproducerbar skade. Først skal du indsætte sterile specialfremstillede rustfrit stålringe i brøndene på en seks brøndplade.Derefter tilsættes forstemt serumfrit eksperimentelt medium med propidium iodid til brøndene, hvilket sikrer, at medieniveauet ikke når over ringens hak. Overfør pladen til inkubatoren i en time for at sikre, at mediet er 37 grader Celsius, før vævskulturindsatserne overføres. Efter en time, overføre væv kultur skær med organotypic skiver fra deres vækst retter på ringene i de seks godt plade.Lav en prik på skærkanten i klokken tre med en permanent markørpen for at gøre det lettere at returnere skærene til sin oprindelige position, og marker derefter hver seks brøndplade med et unikt navn og dato og lav et kort over brøndene på hver plade, der navngiver hver brønd med et bogstav og hver skive i brønden med et tal, så hvert udsnit har et unikt identifikator. Inkubere ved 37 grader Celsius i en time for at sikre skiverne er på 37 grader Celsius umiddelbart før billeddannelse. En time efter overførsel til eksperimentel medium, vurdere skive sundhed ved hurtigt billeddannelse hver skive individuelt og sekventielt under lav effekt.Brug et fluorescensmikroskop, der er udstyret med et passende excitations- og emissionsfilter ideelt i et mørkt rum eller et rum med svagt lys. Hold låget på pladen, når der afsendes. Nogle kondens kan opbygge på indersiden af låget.Hvis dette sker, skal du kortvarigt bruge en hårtørrer på den lave indstilling på ydersiden af låget. Sørg for, at billeddannelsesforholdene er identiske på forskellige dage og mellem eksperimenter. Ved baseline, viser sunde skiver meget lidt fluorescerende farvning.Skiver, der udviser områder med tæt rød farvning, indikerer kompromitteret levedygtighed og bør udelukkes fra yderligere analyse. Til sammenligning vises fluorescens fra den skadede skive ved 72 timer her. Umiddelbart efter billeddannelse fjernes et vævskulturindsats fra seks brøndpladen, og indsatsen overføres forsigtigt til en steril polyethylenpose med 20 milliliter forvarmt eksperimentelt medium, der bobles med 95 % ilt og 5 % kuldioxid.Fjern forsigtigt eventuelle luftbobler og forsegle den sterile pose ved at vride toppen og anvende en plastik klemme. Sørg for, at hver steril pose er korrekt mærket med pladen og godt identifikation. Efter overførsel af hver vævskultur indsætte til en individuel steril taske, placere poser og de seks brøndplader med eksperimentel medium i 37 grader Celsius inkubator.Efter en time, omhyggeligt pakke sterile poser med væv kultur skær i plastkasser inde i en termisk reguleret kasse fyldt med ioniseret vand ved 37 grader Celsius. Vandet skal holde organotypiske skiver ved fysiologisk temperatur i hele shockwave eksponeringsprotokollen. Bær stål-toed beskyttende støvler, et laboratorium pels, og handsker under forberedelse af chokrøret og shockwave eksponering.Brug en afblændingsst til at bolte den sterile poseholderramme til stødrørets distale flange, der sikrer, at det centrale hul flugter med stødrørets udløb. Sensor et, en tryktransducer, er placeret i den midterste del af den drevne sektion, og sensor to er i den distale flange af chokrøret. Tilslut disse tryktransducere til et oscilloskop gennem en strømenhed i strømkilden, og tænd for oscilloskopet.Sørg for, at stødrørets magnetventil og flowstyring er lukket, og åbn derefter den eksterne trykluftledning, og oplad magnetventilen til 2,5 bar. Åbn trykluftcylinderens sikkerhedsventil, og åbn langsomt trykregulatoren for at øge trykket til ca. fem bar. Dernæst forberede membraner ved at skære 23 mikron tyk polyester plader i 10 af 10 centimeter firkanter.Forbered håndtag fra autoklave tape og holde dem til toppen og bunden af hver membran. Placer en membran i bruddet og sikre, at de er centreret. Dernæst klemme mellemgulvet ved hjælp af fire M24 bolte og møtrikker.Mode dem sekventielt i en diagonalt symmetrisk måde og samtidig sikre membraner er rynke fri. Klem en steril pose i lodret position på holderrammen, der sikrer, at vævskulturindsatsens overflade med de organotypiske hippocampale skiver vender mod stødrørets udløb, og vævskulturindsatsen er centreret inde i den sterile pose. For den dobbelte membran konfiguration, er sprængning tryk afhængig af gastrykforskellen mellem føreren og dobbelt brud kammer.Derfor åbnes sikkerhedsventilen for at sprænge membranerne på en kontrolleret måde manuelt, når måltrykket er nået. Sæt på høreværn og sikkerhedsbriller, hvis de ikke allerede er slidt. Luk magnetventilen.Tænd for den aktuelle kildestrømsenhed for at hente stødbølgedataene. Manipuler strømningskontrolknappen på stødrørets kontrolpanel for langsomt at presse førerens volumensektion i stødrøret for en enkelt membrankonfiguration eller både førerens volumensektion og stødrørets dobbelte brudsektion for dobbelt membrankonfiguration. Så snart mellemgulvet brister, hurtigt lukket trykluftstrømmen ved hjælp af flow knop og åbne magnetventilen.Den ideelle kombination af shockwave parametre bør være nok til at forårsage vævsskade, men ikke så høj, at det forårsager væv kultur indsætte eller steril pose forvrængning eller brud. Efter at have udsat hver skive for en enkelt chokrørsbølge, skal den straks returneres til den termisk regulerede boks. Tag derefter den næste sterile taske fra kassen og klem den på holderrammen.Udfør kontakten jævnt og hurtigt for at forhindre afkøling af forsøgsmediet, da temperaturer under 37 kan forstyrre udviklingen af personskader. Når alle væv kultur skær har været udsat for en shockwave eller fingeret protokol, returnere væv kultur skær til deres brønde i dig oprindelige seks godt plade og vende tilbage til inkubatoren indtil videre billeddannelse. Dette billede er et repræsentativt eksempel på en chokbølge opnået ved hjælp af 23 mikrotynde polyesterfilm med 55 kilopascal peak overtryk.Chokbølgehastigheden var 440 meter i sekundet. Både 50 og 55 kilopascal peak overtryk chokbølger forårsaget betydelig skade, der udviklede sig i hele 72 timer protokollen sammenlignet med fingeret gruppe. Skaden som følge af en 55 kilopascal peak overtryk bølge eksponering var betydeligt højere end efter 50 kilopascal på 48 timer og 72 timer, viser udviklingen af skaden er proportional med intensiteten af shockwave.Dette billede viser et udsnit 72 timer efter en 50 kilopascal blast. En høj grad af diffus skade er synlig. Skaden er mere udtalt efter en 55 kilopascal peak overtryk blast.Denne propidium iodid fluorescens billede viser en organotypic skive fra en fingeret eksperiment. Den fingeret skive viser lave niveauer af fluorescens. Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at opretholde en aseptisk teknik hele for at undgå forurening af vævet og til at manipulere væv kulturer hurtigt, men meget forsigtigt for at undgå utilsigtede celleskader.Efter denne procedure, andre metoder som immunfluorescens farvning kan udføres for at besvare yderligere spørgsmål som hvad er mekanismerne i celledød involveret i blast induceret traumatisk hjerneskade? Denne teknik giver mulighed for en høj throughput assay for forskere inden for neuroprotection at udforske potentialet for lægemidler til at forhindre spredning af celledød og hjernevæv efter udsættelse for blast chokbølger.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

Undersøgelser om Ændringer af hippocampus Circuit funktion efter Mild traumatisk hjerneskade

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

En metode til at påføre lukket hoved traumatisk hjerneskade i<em&gt; Drosophila</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila

A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila

En ny metode til at modellere kronisk traumatisk encephalopati i<em&gt; Drosophila</em

Chronic Traumatic Encephalopathy (CTE) is an established neurodegenerative disease that is closely associated with exposure to repetitive mild Traumatic ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Stereotactic Atlas-styrede Laser fange Microdissection af hjerneregioner ramt af traumatisk skade

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Virkningerne af Blast-induceret Neurotrauma på trykisoleret gnaver midt cerebrale arterier

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Investigating Alterations in Caecum Microbiota After Traumatic Brain Injury in Mice

Undersøgelse af ændringer i Caecum microbiota efter traumatisk hjerneskade i mus

Increasing evidence shows that the microbiota-gut-brain axis plays an important role in the pathogenesis of brain diseases. Several studies also ...

Murine Model of Controlled Cortical Impact for the Induction of Traumatic Brain Injury

Murine model af kontrolleret kortikale virkning for induktion af traumatisk hjerneskade

The Centers for Disease Control and Injury Prevention estimate that almost 2 million people sustain a traumatic brain injury (TBI) every year in the ...

Low-intensity Blast Wave Model for Preclinical Assessment of Closed-head Mild Traumatic Brain Injury in Rodents

Lavintensitets blastbølgemodel til præklinisk vurdering af mild traumatisk hjerneskade med lukket hoved hos gnavere

Traumatic brain injury (TBI) is a large-scale public health problem. Mild TBI is the most prevalent form of neurotrauma and accounts for a large number of ...

Electromagnetic Controlled Closed-Head Model of Mild Traumatic Brain Injury in Mice

Elektromagnetisk kontrolleret lukket hovedmodel af mild traumatisk hjerneskade hos mus

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and ...