Name: a novel in vitro model of blast traumatic brain injury
Uploaded: 2018-12-21T13:00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury at JoVE.com

נתמך על-ידי: המגישים ההגנה רפואה, בירמינגהם, אנגליה, רויאל בריטיש לגיון המרכז ללימודים הפיצוץ פציעה, אימפריאל קולג ' בלונדון, אנגליה. מועצת המחקר הרפואי, לונדון, הממלכה המאוחדת (MC_PC_13064; MR/N027736/1). הקרן בטיחות גז, לונדון, אנגליה. ריטה קמפוס-Pires היה מקבל פרס הכשרה דוקטורט מ פארא Fundação e Ciência Tecnologia, ליסבון, פורטוגל. קייטי האריס היה הנמען של studentship PhD מ ווסטמינסטר רפואי ספר מחקר אמון, לונדון, אנגליה.
מודל זה פותחה עם התמיכה של מרכז הלגיון הבריטי המלכותי עבור מחקרים פגיעה הפיצוץ (RBLCBIS) ב אימפריאל קולג '. ברצוננו להודות על התמיכה הכלכלית של הלגיון הבריטי המלכותי. חוקרים המעוניינים שיתופי פעולה או נוסף פרט ניתן לפנות את מחברים או RBLCBIS.
אנו מודים ד ר Amarjit סמרה, מנהלת המחקר, המגישים לתרופה ההגנה, בירמינגהם, בריטניה, לתמיכה שזה יעבוד, סקוט ארמסטרונג, המחלקה לכירורגיה & סרטן, אימפריאל קולג ' בלונדון, על סיוע ראשוני ניסויים , Theofano Eftaxiopolou, מצודת דוד הארי & לוז Ngoc נגוין, המחלקה של בביו-הנדסה אימפריאל קולג ' בלונדון, & ויליאם גאה, המחלקה של פיזיקה אימפריאל קולג ' בלונדון, לקבלת ייעוץ על המרקע-ההלם, רקל Yustos, טכנאי, מחלקת מחקר מדעי החיים, אימפריאל קולג ' בלונדון, תמיכה טכנית, בין פול בראון, מנהל סדנת ו סטיב נלסון, סדנת טכנאי המחלקה לפיסיקה, אימפריאל קולג ' בלונדון, להכנת המתכת מצלצל, ניל פאוול של הפקולטה לפיזיקה, אימפריאל קולג ' בלונדון, גרפיקה.

המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

בין כל המנגנונים של פגיעה המשויך הפיצוץ TBI (הדף הראשי, משניות ושלישוניות פגיעה במנגנונים), ראשי פגיעת הוא ייחודי הפיצוץ לטראומה וזה המעט הבין של מנגנונים הקשורים הפיצוץ1,2 . פרוטוקול הרומן שמתואר כאן פותחה כדי ללמוד פגיעה עיקריים TBI באמצעות שפופרת של שוק פתוח לחשוף במבחנה בתרבויות פרוסה בהיפוקמפוס העכבר גל הלם יחיד באמצעות פרוטוקול פשוטה ומהירה מאפשר היצירה של לשחזור . פיצוץ ראשי TBI עם תפוקה גבוהה
במבחנה פגיעה עיקריים TBI הדגמים הראשונים יחולו גלי הלחץ ההידרוסטטי תאים26,27. אולם, הפלט לחץ לא ביסס את הפונקציה פרידלנדר כמו משך הזמן של דופק הלחץ ההידרוסטטי היה הרבה יותר זמן מאשר הפיצוץ מוטס הלחץ גלים13. המאפיין פרידלנדר פונקציה יכולה להיות הדגם בקלות במעבדה בעזרת הלם צינור1,8. הצינור הלם יכול לייצר גלי המדמים שדה פתוח אמיתי פיצוצים בסביבת מעבדה קונבנציונאלי, תוך מתן אפשרות שליטה מדויקת של גל פרמטרים, כגון שיא הלחץ, משך גל חיובי, דחף, על ידי שינוי דיאפרגמה החומר עובי ו את התקן האחסון8,28,29.
מודלים פשוטים במבחנה כגון תרביות תאים בדרך כלל חוסר של הטרוגניות של סוגי תאים, קישוריות סינפטית30. לאחרונה, השפעת הפיצוץ על במבחנה לתא מוח 'spheroids' שילוב סוגי תאים שונים כבר ובדוקים31. בהמשך החקירה של ההכנות הללו מעניין זה מצדיק..; עם זאת, לא ברור איך הארגון הסלולר שלהם וקישוריות מראות את המוח ללא פגע. OHSC הם ומבוססת במבחנה דגם ניסיוני23,32, הם קלים לתרבות, cytoarchitecture רקמות תלת מימדי, תאית התמיינות וקישוריות הסינפטית שלהם הם שהשתמרה היטב מאוד דומה כי אין ויוו33,34,35,36. OHSCs מייצגים רמת ביניים של מורכבות בין תרבית תאים של ויוו דגם23,32. OHSCs הוכחו להתרבות בתוך חוץ גופית ניווניות פתולוגיים cascades ראיתי דגמים ויוו , היה מאוד שימושי בהקרנת הסרט neuroprotective תרופות וב -הבנת מנגנוני שלהם פעולה17,21,22,37,38. לבסוף, אזור אנטומי למד, ההיפוקמפוס, רלוונטי מאוד במחקרים TBI translational, אזור זה הוא לעתים קרובות פגועה TBI חולים39,40,41. OHSC שימשו מודל הפיצוץ TBI28,42,43,44, עם זאת, המודל שלנו הוא פשוט יחסית, יכול להיות מותאם כדי הלם-צינורות הקיים או אופקי או אנכי תצורות ללא עיבודים מורכבים.
ניתן לשמור OHSC בתרבות במשך ימים רבים, אשר מקלה על החקירה של תהליכים ביולוגיים מעל הזמן34. במודל זה, הפגיעה ברקמות שנבעו גל הלם החשיפה נמדדה מדי יום במשך כשלושה ימים, בעקבות החשיפה הפיצוץ באמצעות propidium יודיד, סמן ומבוססת של נזק לתאים. Propidium יודיד הוא צבע קוטבי מאוד רעילים זה חודר לתאי עם פרוץ ממברנות הסלולר, איפה זה נקשר חומצות גרעין ומוצגים האופיינית פלואורסצנטי אדום בהיר24,25,45. ידי קרינה פלואורסצנטית נמדד עם יודיד propidium הוכח שיש קשר טוב עם ספירת התא הפגוע באמצעות Nissl מכתים46,47.
נתון כי הפגיעה המיוצר במודל זה היה מפוזר (איור 2C), ידי קרינה פלואורסצנטית של כל פרוסה נמדד בעת ביצוע הניתוח, דומה לעבודה שפורסמו בעבר אחרים במוח פציעה פרדיגמות21,22 , במקום להשתמש באזורים ספציפיים, כפי שעשו אחרים במבחנה הפיצוץ TBI מודלים28,43,44,48. הגישה הכללית בשימוש המודל המתואר במאמר זה גם מבטל ההשתנות פוטנציאל זה מוצג כאשר חלוקה לרמות מוגדרים אזורים מעניינים ומספק תמונה מקיפה יותר של הפגיעה הקשורות הפיצוץ. Overpressures שיא גל הלם, 50 kPa ו 55 kPa, הפיק משמעותי (p < 0.05 ו- p < 0.0001, בהתאמה) פגיעה בהשוואה המזויפים פרוסות (איור 2B). לפי התכנון, גל ההלם עם מרב overpressure הגבוה, 55 kPa, הפיק פגיעה יותר מאשר הגל 50 kPa. במודל במבחנה עם המוח מבודדים רקמות נחשף ישירות shockwave, כיצד לשנות את קנה המידה באופן מדויק האורגניזם כולו או אדם אינה פשוטה. למרות זאת, ההלם היינו נמצאים בטווח של overpressures שיא נצפתה בשטח, בדרך כלל 50 – 1,000 kPa8,49.
כדי לשמר את OHSC נחשפים הפיזיולוגיות טמפרטורה ורמות של חמצן, פחמן דו חמצני, תוך הבטחת כי הם היו חינם מפני זיהום לאורך כל פרוטוקול חשיפה גל הלם, התוספות תרביות רקמה נאטמו לתוך סטרילי שקיות פוליאתילן בעקבות הטכניקה aseptic, שקוע במדיום ניסיוני התחמם עד 37 ° C, מבעבע טרי עם 95% חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני, באופן דומה כדי העבודה שפורסמו בעבר28,43,44 ,48. בניגוד מודלים אלה שבו מכשירים מורכבים שימשו כדי להחזיק את התיקים סטרילי במהלך החשיפה גל הלם, ב פרוטוקול זה, שיטה פשוטה ומהירה שימש להשעות את הכיסויים תרביות רקמה OHSC לפני ששקע צינור הלם (איור 1 א', C ). המודל המתואר במאמר זה מאפשר עיבוד מהיר של תפוקה גבוהה, תוך מזעור הסיכון של היפותרמיה. היבטים אלה רלוונטיות בעיקר ללימודי neuroprotection בהתחשב בכך כמה התערבויות טיפוליות שיש חלון זמן מוגבל מאוד של פוטנציאל היישום לאחר TBI. פרוטוקול חשיפה זה גל הלם הרומן מאפשרת 6 עד 9 תרביות רקמה מוסיף (בדרך כלל 36 עד 54 organotypic בהיפוקמפוס רקמות פרוסות) להיחשף גל הלם בתוך פרק זמן קצר של זמן (כ ג 1).
OHSCs דורשים אספטי טכניקה טובה בכל רחבי. חשוב להשתמש אספטי למינארי ברחבי את culturing, כאשר העברת התיקים סטרילי עבור הפיצוץ. לצורך ביצוע ההדמיה פרוסה בתנאים aseptic בשלמותם הלוחיות. ובכן 6 במקום, אנו משתמשים בהזמנה אישית טבעות מתכת כדי להרים את המכסים תרבות תא למישור מוקד של המיקרוסקופ. חלק חשוב של פרוטוקול שלנו היא כי אנו לכלול המזויפים שציווית פרוסות בכל ניסוי. פרוסות המזויפים מטופלים באופן זהה כדי הפיצוץ פרוסות עם יוצאי דופן כי ההלם-הצינור לא מפוטר; צעד חשוב נוסף הוא כי כל הפרוסות הם צילמו 1 h לפני הפציעה או טיפול דמה, כדי להבטיח כי הבריאות של האוכלוסייה של פרוסות שימוש זהה (איור 2B).
בנוסף לכימות תא פציעה על הפרוסות לאורך זמן, הרקמה יכול להיות קבוע בסוף הניסוי אימונוהיסטוכימיה קונבנציונאלי50. אנחנו פיתח, הערכה השיטה באמצעות העכבר פרוסות בהיפוקמפוס. עם זאת, הטכניקה שלנו יכול להיות מותאם בקלות להשתמש רקמות אחרות זה יכול להיות גדלה בתרבות, כגון חוט השדרה, רשתית, ריאות או רקמת האפיתל. הנייר הזה, העבודות הקודמות שלנו עם הדגם, חקרנו רק את ההשפעה של חשיפה פיצוץ יחיד. עם זאת, הדגם יהיה מתאימה כדי לחקור את ההשפעות של תקיעות ברמה נמוכה חוזרות ונשנות על המוח או רקמות אחרות. OHSCs יכול להישמר בתרבות במשך שבועות רבים או אפילו חודשים, ומאפשר אפקטים כרונית להיחקר.
במבחנה מודלים, להיות יותר ויוו מודלים, פשוט יש של תפוקה גבוהה יותר, פחות יקרים, ניסויים יכולים בדרך כלל להסתיים על סרגל זמן קצר יותר17. עם זאת, התוצאות המתקבלות באמצעות מודלים במבחנה צורך לאמת במודלים של בעלי חיים במבחנה תרבותי רקמות נשמרים בסביבה מלאכותית, עלול להגיב לפגיעה אחרת ממה שהם היו ויוו17. בכל זאת, מודלים במבחנה הייתה בעלת ערך רב מאוד להגדיל את ההבנה שלנו של אשדים פגיעה במוח, תוך הקרנת neuroprotective תרופות לפני השימוש מורכבים יותר ויוו מודלים17,22 , 51 , 52. למרות היתרונות הרבים המוצעים על ידי מודל זה, חשוב לציין במבחנה מודלים חסר מפתח תכונות של TBI להציג מודלים ויוו , כגון ההשפעות על מערכת כלי הדם, וחיות מוגברת תוך-גולגולתי לחץ, התגובה החיסונית מערכתית, התנהגותיות תיפקודי, המדגישה את הצורך כדי לאמת את התוצאות נמצאו במבחנה דגמים של כל החיות. למרות זאת, במבחנה מודלים כגון המודל המתואר במאמר זה הם כלים מדעיים הרלוונטיים translationally מאוד שימושי.
לסיכום, עבודה זו מתארת פשוט וברור שיטה שבו העכבר organotypic בתרביות רקמה בהיפוקמפוס נחשפים לשחזור ונשלטת היטב במציאות הרלוונטיים גלי הלם באמצעות צינור הלם מעבדה. הפגיעה הכללית המתקבלת, אשר הייתה לכמת באמצעות propidium יודיד, סמן ומבוססת של נזק לתאים, היא מאוד לשחזור והיא פרופורציונליים ל- overpressure שיא של גלי הלם מוחל.

הפיצוץ פציעת מוח טראומטית (TBI) הוא סוג מורכב של פגיעה מוחית כתוצאה מהפיצוץ של מטעני חבלה1,2. הפיצוץ TBI התפתחה גדול נושא הבריאות ב- 15 השנים האחרונות עם הקונפליקטים הצבאית האחרונה בעוד בעיראק ובאפגניסטן2,3. בסך הכל, ההערכה היא כי בין 4.4% 22.8% מהחיילים אותתה בעיראק ובאפגניסטן סבלו TBI מתון, אחוז גדול של אלה הקשורות הפיצוץ, עם שיעור גבוה יותר המדווחת של הפיצוץ TBI בצבא ארצות הברית לעומת כוחות בריטניה4 ,5.
השימוש של מטעני חבלה היה אחראי ביותר של הטראומה הקשורים הפיצוץ, כולל הפיצוץ TBI, שעבר על ידי כוחות הצבא6. הפיצוץ של פיצוץ מטען תוצאות מהירה מאוד — אבל ארעי – להגדיל בלחץ, המתרחשים באלפיות שניה. גל הלחץ שנוצר מפיצוץ שדה חינם אמיתי מדוגמנים על-ידי הפונקציה פרידלנדר, עלייה פתאומית כדי overpressure שיא ואחריו דעיכה מעריכית7,8. הטווח של כוחות קיצוניים וקורס זמן מהיר שלהם ראה באירוע הפיצוץ בדרך כלל מנוסים לא-הפיצוץ טראומות1,9. Overpressure שיא, המהווה את הלחץ המקסימלי של waveform, וכן את משך הזמן של הגל החיובי מאמינים כי חשוב כתורמים פגיעת מוח, הם תלויים מטען הנפץ, המרחק בין פיצוץ10, 11.
הטראומה כי תוצאות פיצוץ נפץ מסווגים ארבעה מרכיבים נפרדים, כמנהל ראשי, משני, שלישוני, רבעוני הפיצוץ פציעה10,12,13,14. כל אחד ממרכיבים אלה קשורה למנגנונים הספציפיים של פציעה. פגיעת העיקרית נובעת הפעולה הישירה של גל הלחץ על איברים ורקמות2,13. הפיצוץ משני פציעה תוצאות מן ההשפעה של קטעים קלע, גורם החודר, שאינו חודר פצעים2,15. פגיעת שלישוני מתרחשת כאשר גוף הקורבן הוא עקורים מפני הקרקע או האובייקטים שמסביב והיא קשורה עם האצה/ההאטה כוחות1,10,13. פגיעת רבעוני מתאר קבוצה הטרוגנית של פציעות הקשורות ישירות הפיצוץ אינו מכוסה על ידי הראשון פגיעה שלושה מנגנונים שתואר12,13. זה כולל (אך אינו מוגבל) פגיעה תרמי, שאיפת עשן, קרינה, גלים אלקטרומגנטיים, השפעות פסיכולוגיות שליליות13,15. רוב TBI הפיצוץ-הקשורים ישירות נובעת המנגנונים הראשונים של פגיעה, בעוד המנגנון רבעוני של פגיעת קשורות לרוב עם פגיעה מערכתית13. ההשפעות של האצה/ההאטה כוחות (למשל, צליפת שוט), קהה, חודר פציעת מוח טראומטית כבר חקרו בהרחבה ביחס לשאר סוגי TBI (למשללנפגעי תאונות, נפילות, פציעה בליסטי). אולם, גל הלחץ ההדף העיקרי הוא ייחודי כדי פגיעה הפיצוץ, השלכותיה על רקמת המוח הם הרבה פחות טוב הבין16. מנגנוני פגיעה פגיעה עיקריים, הקשורים עם גל הלחץ, הם הראשונים של הכוחות מכני לתקשר עם המוח.
רבים במודלים פרה TBI פותחו בעשורים האחרונים זה לא תסולא בפז להבין מנגנונים TBI הפיצוץ של פציעה, פתופיזיולוגיה ולחקור טיפולים חדשים פוטנציאליים, אשר שאחרת היה בלתי אפשרי לעשות באופן בלעדי בבמישור הקליני הגדרת17,18,19. למרות שאין דגם פרה אחד ניתן להפיק את המורכבות של הפיצוץ קליניים לפציעות, בדרך כלל במודלים שונים TBI פרה לשכפל היבטים ברורים של האדם TBI. ניתן יהיה ללמוד את הפעולה המזיקות של הכוחות המשויך פיצוץ פיצוץ בבידוד או בשילוב במודלים TBI הפיצוץ גם במבחנה וגם ויוו . מודלים במבחנה יש יתרון המאפשר שליטה חזקה מאוד של הסביבה ניסיוני (תנאים הפיזיולוגיות רקמות, ביומכניקה פציעה), אשר מפחית את השתנות ביולוגי ומשפר הפארמצבטית, המתיר חקר ספציפי מולקולרית מפלי מבלי confounders נוכחות חיה מודלים20. המטרה שלנו הייתה לפתח מודל במבחנה כדי לחקור את ההשפעות של פגיעה עיקריים על רקמת המוח. אנחנו נועדו לפתח מודל עם shockwave קולית עם נציג waveform פרידלנדר של פיצוץ חינם-שדות כגון זה המיוצר על ידי חבלה מאולתר (IED).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Geys balanced salt solution</td>
			<td>Sigma UK</td>
			<td>G9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D- glucose</td>
			<td>Sigma UK</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimycotic</td>
			<td>Sigma UK</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium Eagle</td>
			<td>Sigma UK</td>
			<td>M4655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks balanced salt solution</td>
			<td>Sigma UK</td>
			<td>H9269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Sigma UK</td>
			<td>H1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma UK</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR Prolabo, Belgium</td>
			<td>441476L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma UK</td>
			<td>S-0945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture inserts</td>
			<td>Millicell CM 30 mm low height Millipore</td>
			<td>PICM ORG 50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>NUNC, Denmark</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma UK</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile polyethylene bags - Twirl&#39;em sterile sample bags</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>01-002-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portex Avon Kwill Filling Tube 5&#34; (127mm)</td>
			<td>Smiths Medical Supplies</td>
			<td>E910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>NIKON Eclipse 80i, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objective</td>
			<td>Nikon Plan UW magn. 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope filter</td>
			<td>Nikon G-2B (longpass emission)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mylar electrical insulating film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm</td>
			<td>RS Components UK</td>
			<td>785-0782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure transducer</td>
			<td>Dytran Instruments Inc.</td>
			<td>2300V1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper</td>
			<td>Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, United Kingdom.</td>
			<td>Mcllwain tissue chopper</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer</td>
			<td>Dow Corning, USA</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphing &#38; statistics software</td>
			<td>GraphPad Software, USA</td>
			<td>Prism 7.0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel in vitro model of blast traumatic brain injury

פגיעה מוחית טראומטית היא הגורם המוביל למוות ונכות באוכלוסיות צבאיות ואזרחיות. תוצאות פגיעה מוחית טראומטית ההדף מהפיצוץ של מטעני חבלה, אולם, המנגנונים העומדים בבסיס הנזק המוחי כתוצאה מחשיפה הלחץ הפיצוץ אינה מובנת לחלוטין, מאמינים כי ייחודי לסוג זה של פגיעה מוחית. במודלים פרה הן כלי חיוני שתורמים להבין טוב יותר פגיעה מוחית הפיצוץ-induced. מודל TBI הפיצוץ הרומן במבחנה פותחה באמצעות שפופרת של שוק פתוח כדי לדמות את החיים האמיתיים בשדה פתוח הפיצוץ גלים וניסו מאת waveform פרידלנדר. עכבר C57BL/6N organotypic פרוסה בהיפוקמפוס תרבויות נחשפו גלי הלם יחיד ואת ההתפתחות של פציעה התאפיינה עד 72 h באמצעות propidium יודיד, סמן פלורסנט ומבוססת של נזק לתאים שרק חודר תאים עם נפגעת ממברנות הסלולר. קרינה פלואורסצנטית יודיד Propidium היה גבוה באופן משמעותי פרוסות נחשפים גל הדף בהשוואה עם פרוסות המזויפים בכל משך זמן של הפרוטוקול. הפגיעה ברקמות המוח הוא מאוד לשחזור פרופורציונליים ל- overpressure שיא של גל ההלם מוחל.

הצינור הלם נעשה שימוש בשיטה זו מאפשר את הדור של הלחץ שנחשולי המדמים שדה פתוח אמיתי פיצוצים וניסו מאת פרידלנדר פונקציה7,8. בגלי ההלם קולית עם מהירות של 440 מטר לשנייה (1.3 מאך) התקבלו (איור 2 א). צורת גל המידע המדווח הוא חיישן 2, ממוקם בצורה רדיאלית בסוף הסעיף מונע של הצינור הלם.
באמצעות פרוטוקול המתואר לעיל, organotypic פרוסה בהיפוקמפוס תרבויות נחשפים גל הלם יחיד (איור 2 א) לפתח נזק משמעותי לכמת באמצעות propidium יודיד, הפלורסנט מאוד קוטבי, כי רק חודר את התאים עם נפגעת ממברנות הסלולר24,25 (איור 2B, ג).
אפילו בתנאים אופטימליים, ועקביים כדי OHSC אחרים שפורסמו מודלים21,22, יש רמה נמוכה של הרקע propidium יודיד פלורסצנטיות נובע, בין השאר, קטין נזק הנובע (מניפולציות רקמות הטבועה כגון מדיה שינויים במהלך תקופת תרבות או הסרה של החממה עבור הדמיה). הפיצוץ הזה TBI פרוטוקול כרוך מניפולציה משמעותית הכוללת את ועלייתו הפרוסות בינוני בתוך שקיות סטריליות מידה ניכרת של טיפול במהלך פרוטוקול חשיפה גל הלם (למשל., מחבר חובק למעקה השקיות עקר בעל מסגרת). עם זאת, אם כל הצעדים מבוצעים בקפידה, זו מניפולציה נוספים לא יש השפעה על הבריאות הבסיסית של OHSC כפי נראו אין הבדלים משמעותיים בין קבוצת ביקורת של פרוסות שמרו על הלוחיות. ובכן 6 בכל עת (כלומר., התוספות היו לא שקוע או מטופלים) וקבוצת דמה, אשר כלל הפרוסות הוסתרו בתוך שקיות סטריליות כשכרטיס אל הצינור הלם (איור 2B).
גלי שני שבחרת, ב kPa 50 ו 55 kPa שיא הלחץ, הפיק משמעותי (p < 0.05 ו- p < 0.0001, בהתאמה), לשחזור הפציעה בהשוואה המזויף שציווית פרוסות כל הזמן-נקודות לאחר חשיפת הפיצוץ פרוטוקול (איור 2B) מבלי לגרום נזק את הכיסויים תרביות רקמה או את התיקים סטרילי. על מנת לקבוע את הרגישות של המודל להבדלים קטנים שיא-הלחץ, החלטנו לבחור ערכים שהיו שונים על ידי ~ 10%. תוצאות אלה גם להציג, כצפוי, הפגיעה הנובעת 55 kPa זו גבוהה יותר לאחר גל הלם 50 kPa.
הנתונים מבוטא זאת אומרת ± שגיאת התקן של הממוצע. משמעות הוערכה באמצעות אמצעים חוזרות 2-way השונות שימוש הולם-Sidak פוסט הוק מבחן. גורם 1 היה קבוצה (שליטה, העמדת פנים, הפיצוץ), פקטור 2 היה זמן לאחר הפגיעה (-1 h, 24 שעות ביממה, 48 שעות ו 72 h), שבו גורם 1 היה הגורם חוזרות ונשנות. ההתאמה של ערך p להשוואות מרובות שימש. ערכי P 0.05 פחות נלקחו כדי להצביע על הבדל משמעותי בין הקבוצות. בדיקות סטטיסטיות יושמו באמצעות חבילת תוכנה גראפית ונתונים סטטיסטיים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58400/58400fig1.jpg"> איור 1: סכימטי של המכשיר צינור הלם עם המסגרת מחזיק שקית סטרילית. (א). הצינור הלם הוא צינור ארוך מפלדת 3.8 מ', עשוי משלושה חלקים ארוכים 1.22 מ', המחוברים באמצעות אטמים, flanges, עם 59 מ מ. קוטר פנימי שיבוץ (B) מראה את מכלול עכוז כפול. להיות כשכרטיס אחד או שניים דיאפרגמות מיילר בהרכבה בחותם המסופקים על ידי o-טבעות גומי. מסגרת מחזיק שקית סטרילית (C). הגוף של המסגרת כוללת שני לוחות מתכת עם חור עגול ממורכז (59 מ מ קוטר) שמתיישר עם השקע צינור הלם. דק (4 מ מ) שני, יריעות סיליקון elastomer מצוידים בין שני לוחות מתכת. המטרה של גליונות אלה נועד לספק של השטח להחליק ואפילו כדי לצבוט את התיקים סטרילי. המרחק בין התיק לבין השקע של הצינור הלם הוא 7 ס מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58400/58400fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58400/58400fig2.jpg"> איור 2: shockwave טיפוסי ופציעה וכתוצאה מכך organotypic בהיפוקמפוס לחתוך תרבויות. (א) נציג דוגמה גל הלם שהושג באמצעות מיקרומטר-עבה 23 פוליאסטר, הסרט-2.16 בר פרץ לחץ, 55 kPa שיא הלחץ, משך גל חיובי 0.4 ms, 10.1 kPa·ms דחף. Waveform נתונים, התקבלו חיישן 2 רכוב בצורה רדיאלית-והסתיר דיסטלי הצינור הלם מונע סעיף. מהירות גל הלם היה 440 מטר לשנייה (1.3 מאך). (B) הפיתוח של פציעה הוא יחסי העוצמה של גל ההלם. 50 kPa והן 55 kPa שיא הלחץ גלי הלם נגרם נזק משמעותי שהתפתחה לאורך כל פרוטוקול 72 h בהשוואה לקבוצת המזויפים. הפגיעה כתוצאה מחשיפה גל 55 kPa שיא הלחץ היה גבוה באופן משמעותי אחרי kPa 50-48 שעות ה 72 המזויפים פרוסות טופלו באופן זהה על פרוסות הפיצוץ אבל צינור הלם לא פוטר. שליטה פרוסות היו בהשתתפות 6 צלחות טוב באינקובטור בלי שינוי כלשהו. העמודות מייצגות ערכים רעים, קווי שגיאה לשגיאות תקן (n = 7, פקדים; n = 48, דמה; n = 30, הפיצוץ 50 kPa; n = 51, הפיצוץ 55 kPa; n = מספר פרוסות, מ- 6 ניסויים נפרדים). * p < 0.05, *p < 0.0001 לעומת המזויפים. # p < #0.05,p < 0.01 לעומת הפיצוץ 55 kPa. (ג) נציג propidium יודיד פלורסצנטיות תמונות של organotypic פרוסות דמה (אני), (ii) הפיצוץ 50 kPa וכן (iii) הפיצוץ 55 kPa קבוצות ב- 72 שעות לאחר פציעה. הפרוסה המזויפים מראה רמות נמוכות של קרינה פלואורסצנטית, כלומר., פציעה, ואת הפיצוץ חשוף פרוסות להראות רמות גבוהות של פגיעה ' מאטום לשקוף ', יותר מבוטא על הפרוסה הלחץ נחשף שיא 55 kPa (סולם בר = 500 מיקרומטר). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58400/58400fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury at JoVE.com

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

מאמר זה מתאר מודל הרומן של פגיעה מוחית טראומטית פגיעה עיקריים. צינור אויר מונחה הלם משמש כדי לחשוף במבחנה בתרבויות פרוסה בהיפוקמפוס העכבר גל הלם יחיד. . זהו פרוטוקול פשוטה ומהירה ליצירת פגיעה ברקמות המוח לשחזור עם תפוקה גבוהה...

מודל הרומן במבחנה של פגיעה מוחית טראומטית הפיצוץ

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום של פגיעה מוחית טראומטית מזיקה הפיצוץ והוא יכול לשמש כדי לסנן תרופות neuroprotective לפני השימוש במודלים מורכבים יותר Vivo. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת במכשיר מעבדה כדי לחשוף רקמת מוח מסת ויטרו לגלי הלם באמצעות פרוטוקול תפוקה פשוט וגובה המאפשר יצירת פגיעה לשחזור. ראשית, הכנס טבעות נירוסטה סטריליות בהתאמה אישית לתוך בארות של צלחת שש בארות.לאחר מכן הוסיפו מדיום ניסיוני מחומם מראש ללא סרום עם פרופידיום יודיד לבאנות ומבטיחים כי רמת המדיום לא תגיע מעל לחיץ הטבעת. מעבירים את הצלחת לאנקובטור למשך שעה כדי להבטיח שהמדיום יהיה ב-37 מעלות צלזיוס לפני שתרבות הרקמה תועבר. לאחר שעה, מעבירים את תרבות הרקמות עם פרוסות אורגנוטיפיקות ממנות הגדילה שלהם לטבעות בצלחת ששת הטובים.הפוך נקודה על שפת הכניסה במיקום שלוש שעה עם עט סמן קבוע כדי להקל על החזרת מוסיפים למיקום המקורי שלה, ולאחר מכן תווית כל צלחת שש גם עם שם ייחודי ותאריך ולעשות מפה של הבארים של כל צלחת, שמות כל באר עם אות וכל פרוסה הבאר עם מספר, כך שלכל פרוסה יש מזהה ייחודי. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי להבטיח את הפרוסות הם ב 37 מעלות צלזיוס מיד לפני הדמיה. שעה לאחר המעבר למדיום ניסיוני, להעריך את בריאות הפרוסה על ידי הדמיה מהירה של כל פרוסה בנפרד ברצף תחת הספק נמוך.השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במסנן קריאה ו פליטה מתאים באופן אידיאלי בחדר חשוך או בחדר עם אור עמום. שמור את המכסה על הצלחת בעת הדמיה. עיבוי מסוים עשוי להצטבר בחלק הפנימי של המכסה.אם זה קורה, בקצרה להשתמש מייבש שיער על ההגדרה הנמוכה בצד החיצוני של המכסה. ודא שתנאי ההדמיה זהים בימים שונים ובין ניסויים. בבסיס, פרוסות בריאות מראות מעט מאוד כתמי פלואורסצנטיים.פרוסות המציגות אזורים של כתמים אדומים צפופים מצביעות על כדאיות נפגעת ויש להחריג אותן מניתוח נוסף. לשם השוואה, פלואורסצנטיות מהפיצוץ שנפצע פרוסה ב 72 שעות מוצג כאן. מיד לאחר ההדמיה, הסר הכנסת תרבות רקמה אחת מצלחת ששת הבאר והעבר בזהירות את התוסף לשקית פוליאתילן סטרילית המכילה 20 מיליליטר של מדיום ניסיוני מחומם מראש עם 95%חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני.בזהירות להסיר את כל בועות האוויר ולאטום את השקית סטרילית על ידי פיתול החלק העליון והחלת מהדק פלסטיק. ודא כי כל שקית סטרילית מסומנת כראוי עם הצלחת וזיהוי היטב. לאחר העברת כל תבומת רקמה להכניס לשקית סטרילית בודדת, מניחים את השקיות ואת שש צלחות גם עם מדיום ניסיוני לתוך החממה 37 מעלות צלזיוס.לאחר שעה, בזהירות לארוז את שקיות סטריליות עם תרבות הרקמה מכניס בקופסאות פלסטיק בתוך קופסה מוסדר תרמית מלא במים מיונים ב 37 מעלות צלזיוס. המים צריכים לשמור את הפרוסות האורגנוטיפיות בטמפרטורה פיזיולוגית לאורך כל פרוטוקול החשיפה לגלי הלם. ללבוש מגפי מגן בהון פלדה, מעיל מעבדה, וכפפות במהלך הכנת צינור ההלם ואת החשיפה גלי הלם.השתמש במוט ריק כדי לנעול את מסגרת מחזיק התיק הסטרילי לאוגן דיסטלי צינור ההלם להבטיח כי החור המרכזי מיושר עם שקע צינור ההלם. חיישן 1, מתמר לחץ, ממוקם בחלק האמצעי של החלק המונע, וחיישן 2 נמצא בגן הדיסטלי של צינור ההלם. חבר מתמרים לחץ אלה לאוצילוסקופ באמצעות יחידת כוח מקור נוכחית והדליק את אוסצילוסקופ.ודא שסתום סולנואיד של צינור ההלם ובקרת זרימה סגורים, ולאחר מכן לפתוח את קו האוויר הדחוס החיצוני לטעון את שסתום סולנואיד ל 2.5 בר. פתח את שסתום הבטיחות צילינדר אוויר דחוס לאט לפתוח את וסת הלחץ כדי להגביר את הלחץ על כחמישה בר. לאחר מכן, להכין דיאפרגמות על ידי חיתוך 23 גיליונות פוליאסטר עבה מיקרון לתוך 10 על ידי 10 ריבועים סנטימטר.הכן ידיות מקלטת autoclave ולתקוע אותם בחלק העליון והתחתון של כל דיאפרגמה. מקם דיאפרגמה אחת בהפרה וודא שהם מרוכזים. לאחר מכן, מהדקים את הסרעפת באמצעות ארבעה ברגים ואגוזים M24.לעצב אותם ברצף בצורה סימטרית באלכסון תוך הבטחת הסרעפות הם ללא קמטים. מהדקים שקית סטרילית בתחנה אנכית על מסגרת המחזיק ומבטיחים כי פני השטח של תרבות הרקמה הכנס עם פרוסות ההיפוקמפוס האורגנוטיפיות פונה לשקע צינור ההלם ותרבות הרקמה מוכנסת בתוך השקית הסטרילית. עבור תצורת הסרעפת הכפולה, הלחץ המתפרץ תלוי בהיפרפרנציאל לחץ הגז בין הנהג לתא ההפרה הכפול.לכן, עבור הסרעפות להתפוצץ בצורה מבוקרת, שסתום בטיחות הפרה כפולה נפתח באופן ידני לאחר הלחצים היעד הם הגיעו. לשים על מגיני האוזן ומשקפי בטיחות אם לא כבר שחוקים. סגור את שסתום סולנואיד.הפעל את יחידת הכוח הנוכחית המשמשת כמקור כדי להשיג את נתוני גלי ההלם. לתפעל את ידית בקרת זרימה על לוח הבקרה צינור ההלם לאט ללחוץ על קטע נפח הנהג של צינור ההלם עבור תצורת דיאפרגמה אחת או הן את סעיף נפח הנהג ואת קטע הפרה כפולה של צינור ההלם עבור תצורת דיאפרגמה כפולה. ברגע שהסרעפת נקרעת, סגר במהירות את זרימת האוויר הדחוסה באמצעות ידית הזרימה ופתח את שסתום סולנואיד.השילוב האידיאלי של פרמטרים גלי הלם צריך להיות מספיק כדי לגרום לפגיעה ברקמה אבל לא כל כך גבוה שזה גורם לתרבות הרקמה להכניס או עיוות שקית סטרילי או קרע. לאחר חשיפת כל פרוסה לגל צינור הלם יחיד, להחזיר אותו מיד לתיבה התרמית מוסדר. לאחר מכן קחו את התיק הסטרילי הבא מהתיבה והדקו אותו על מסגרת המחזיק.בצע את המתג בצורה חלקה ומהירה כדי למנוע קירור של המדיום הניסיוני כמו טמפרטורות מתחת 37 עלול להפריע להתפתחות פציעה. לאחר שכל מוסיף תרבות הרקמה נחשף לפרוטוקול גלי הלם או זיוף, להחזיר את תרבות הרקמה מכניסה ל בארות שלהם בצלחת המקורית שש באר ולחזור החממה עד הדמיה נוספת. תמונה זו היא דוגמה מייצגת של גל הלם שהושג באמצעות סרט פוליאסטר עבה 23 מיקרון עם 55 לחץ יתר שיא קילו-פסקל.מהירות גלי ההלם הייתה 440 מטר לשנייה. גם גלי הלם של 50 וגם 55 קילו-פסקל גרמו לפציעה משמעותית שהתפתחה לאורך כל פרוטוקול 72 השעות בהשוואה לקבוצת הזיוף. הפציעה כתוצאה מחשיפה לגל לחץ יתר של 55 קילו-פסקל הייתה גבוהה משמעותית מאשר לאחר 50 קילו-פסקל ב-48 שעות ו-72 שעות, מה שמוכיח שהתפתחות הפציעה פרופורציונלית לעוצמת גלי ההלם.תמונה זו מציגה פרוסה 72 שעות לאחר פיצוץ של 50 קילו-פסקל. רמה גבוהה של פציעה מפוזרת נראית לעין. פציעה בולטת יותר לאחר פיצוץ 55 קילופסקל שיא לחץ יתר.תמונת פלואורסצנטיות פרופידיום יודיד זו מציגה פרוסה אורגנותית מניסוי מזויף. פרוסת הזיוף מראה רמות נמוכות של פלואורסצנטיות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על טכניקה אספטית לאורך כל הדרך, כדי למנוע זיהום של הרקמה כדי לתפעל תרבות רקמות במהירות אך בעדינות רבה, כדי למנוע נזק לתאים לא מכוונים.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו כתמי שפעת חיסונית על מנת לענות על שאלות נוספות כמו מה הם המנגנונים של מוות תאי המעורבים בפיצוץ הנגרמת פגיעה מוחית טראומטית? טכניקה זו מאפשרת בדיקה תפוקה גבוהה עבור חוקרים בתחום neuroprotection לחקור את הפוטנציאל של תרופות כדי למנוע את התפשטות מוות של תאים רקמת המוח לאחר חשיפה גלי הלם הפיצוץ.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

נוזל הקשה Lateral: דגם של פגיעה מוחית טראומטית של עכברים

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

חקירות על שינויים בתפקוד המעגל היפוקמפוס בעקבות פגיעה מוחית טראומטית קלה

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

שיטה לגרום סגור ראש הפגיעה מוחית טראומטית ב<em&gt; דרוזופילה</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila

A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila

שיטה חדשנית מודל אנצפלופתיה כרונית טראומטית ב<em&gt; תסיסנית</em

Chronic Traumatic Encephalopathy (CTE) is an established neurodegenerative disease that is closely associated with exposure to repetitive mild Traumatic ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

לייזר מונחה אטלס סטיאוטטי ללכוד את Microdissection של אזורים במוח מושפע פציעה טראומטית

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

השפעות הפיצוץ-induced Neurotrauma על מכרסם מווסת המזרח התיכון העורקים המוחיים

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Investigating Alterations in Caecum Microbiota After Traumatic Brain Injury in Mice

חקירת שינויים Caecum Microbiota לאחר פציעה טראומטית במוח עכברים

Increasing evidence shows that the microbiota-gut-brain axis plays an important role in the pathogenesis of brain diseases. Several studies also ...

Murine Model of Controlled Cortical Impact for the Induction of Traumatic Brain Injury

מודל מורנה של השפעה בקליפת המוח הנשלטת על אינדוקציה של פגיעה מוחית טראומטית

The Centers for Disease Control and Injury Prevention estimate that almost 2 million people sustain a traumatic brain injury (TBI) every year in the ...

Low-intensity Blast Wave Model for Preclinical Assessment of Closed-head Mild Traumatic Brain Injury in Rodents

מודל גל פיצוץ בעצימות נמוכה להערכה פרה-קלינית של פגיעה מוחית טראומטית קלה בראש סגור במכרסמים

Traumatic brain injury (TBI) is a large-scale public health problem. Mild TBI is the most prevalent form of neurotrauma and accounts for a large number of ...

Electromagnetic Controlled Closed-Head Model of Mild Traumatic Brain Injury in Mice

מודל ראש סגור מבוקר אלקטרומגנטי של פגיעה מוחית טראומטית קלה בעכברים

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and ...