Name: measuring dengue virus rna in the culture supernatant of infected cells by real-time quantitative polymerase chain reaction
Uploaded: 2018-11-01T14:45:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

يشكر المؤلفون سوبهاش فاسوديفان زاي (اللائي يقبلن ديوك خريج كلية الطب، سنغافورة) لعزل DENV-2 EDEN2 3295 وشونرو إيمورا (محطة الحجر الصحي كوبي، باليابان) يفف د 17 سلالة اللقاح. الكتاب ممتنون أيضا لأعضاء قسم علم الأحياء الدقيقة و "السيطرة على العدوى" لمساعدتها. ويدعم هذا العمل يأمرون كاكينهي المنحة رقم JP16737900.

1-إعداد قالب الحمض النووي لمستوى الحمض النووي الريبي
<ol><li>إعداد بكر ميكس (إجمالي حجم 50 ميكروليتر، الجدول 1) باستخدام ناقلات بلازميد الحمض النووي الذي يحتوي على DENV-2 (ج) غينيا الجديدة (NGC، انضمام عدد: AF038403.1) 3 'أهمل المنطقة (3' UTR)8 والإشعال (T7-DENV 3 'الموجه إليه UTR و DENV 3' رفس UTR) في أنبوب 0.2 مل، كما المبينة في الجدول 2. ملاحظة: هذه الخطوة التي ستجري تحت غطاء محرك السيارة نظيفة (أو في غرفة نظيفة) لتجنب تلوث أي من المنتجات ذات الصلة أمبليكون.</li>
	<li>تضخيم PCR كدنا T7 تسلسل تنصهر DENV 3 ' UTR في ثيرموسيكلير، استخدام الشروط التالية: دورات 30 (98 درجة مئوية لمدة 10 ق، 55 درجة مئوية 5 s، و 72 درجة مئوية ل 5 s).</li>
	<li>مزيج تفاعل PCR مع 10 ميكروليتر 6 × صبغ هلام-تحميل وتحميل على 1% [اغروس] هلام مع الحمض النووي جزيئي سلم تتراوح من 0.1 إلى 10 كيلوبس أزواج (kbp).</li>
	<li>تصور المنتج بكر (479 زوج قاعدي [بي بي]) تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية الطويلة-الطول الموجي باستخدام أسلوب تصور الحمض النووي وهلام نظام التصوير. قطع الفرقة الحمض النووي باستخدام مشرط نظيف.</li>
	<li>استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات تنقية الحمض النووي (جدول المواد). ملاحظة: يمكن إجراء هذه الخطوة تنقية خارج غطاء محرك السيارة نظيفة، ولكن من الضروري للحفاظ على بيئة نظيفة خلال عملية لتفادي التلوث رناسي، ومشكلة رئيسية في الجيش الملكي النيبالي DENV التوليف القياسية الخطوات التالية.<ol>
<li>وزن الشريحة جل وإضافة 100 ميكروليتر من مخزن الالتقاط المؤقت كل 100 مغ شريحة جل في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.</li>
		<li>حل الجل بالحضانة عند 60 درجة مئوية لمدة 5-15 دقيقة.</li>
		<li>تجميع عمود تنقية الحمض النووي مع أنبوب جمع ونقل 600 ميكروليتر من عينة المذاب إلى العمود بتنقية.</li>
		<li>الطرد المركزي في 16,000 س ز 30 ثانية وتجاهل التدفق من خلال. إذا كان حجم العينة أكبر من 600 ميكروليتر، تطبيق بقية العينة إلى العمود تنقية الحمض النووي بعد الدوران الأول وكرر هذه الخطوة.</li>
		<li>تطبيق 500 ميكروليتر من الغسيل المخزن المؤقت إلى العمود تنقية الحمض النووي.</li>
		<li>أجهزة الطرد المركزي في 16,000 س ز لمدة 30 ثانية.</li>
		<li>مكان العمود في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل جديدة.</li>
		<li>إضافة 50 ميكروليتر من المخزن المؤقت شطف واحتضان العمود في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.</li>
		<li>الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 1 دقيقة الوت الحمض النووي.</li>
	</ol>
</li>
	<li>قياس الكثافة الضوئية للحمض النووي في 260 nm على جهاز المطياف الضوئي استخدام 3 ميكروليتر من عينة التيد. استخدام نفس حجم المخزن المؤقت شطف كقرص فارغ. ملاحظة: يمكن تخزين القالب الحمض النووي في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.</li>
</ol>2-تجميع DENV 3 ' UTR الحمض النووي الريبي القياسية
ملاحظة: الحفاظ على ريبونوكليسي (رناسي)-بيئة خالية قدر الإمكان لتنفيذ الخطوات التالية. ينبغي أن يجري تركيب الكاشف داخل غطاء نظيفة، باستخدام بيبيتس نوكلاس خالية ونصائح وأنابيب.
<ol><li>خلط في المختبر النسخ (IVT) رد فعل (إجمالي حجم 20 ميكروليتر) مع 100 نانوغرام رنا T7 المروج تنصهر فيها تسلسل DENV 3 ' الحمض النووي UTR قالب (من الخطوة 1، 6) في أنبوب بكر 0.2 مل كما هو موضح في الجدول 3.</li>
	<li>احتضان المخلوط في 37 درجة مئوية في ثيرموسيكلير ح 2.</li>
	<li>إضافة 1 ميكروليتر من الدناز إلى رد فعل IVT وتستمر في الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.</li>
	<li>تنقية في المختبر نسخها من الجيش الملكي النيبالي باستخدام مجموعة أدوات تنقية الحمض النووي الريبي (جدول المواد).<ol>
<li>إضافة 80 ميكروليتر خالية رناسي ح2س و 350 ميكروليتر من مخزن الالتقاط المؤقت، بما في ذلك 1% β-ميركابتوثانول.</li>
		<li>إضافة 250 ميكروليتر من الإيثانول 100% إلى رد فعل IVT وأنها مزيج جيد من قبل بيبيتينج.</li>
		<li>تجميع عمود تنقية الحمض النووي الريبي مع أنبوب جمع ونقل عينات الحمض النووي الريبي لتنقية العمود.</li>
		<li>الطرد المركزي من مبلغ 000 8 × ز 15 s وتجاهل التدفق من خلال.</li>
		<li>تطبيق 500 ميكروليتر من المخزن المؤقت للغسيل لتنقية الحمض النووي الريبي العمود والطرد المركزي أنه في 8,000 س ز 2 دقيقة.</li>
		<li>مكان العمود في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.</li>
		<li>إضافة 50 ميكروليتر من خالية رناسي ح2س واحتضان العمود في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.</li>
		<li>الطرد المركزي أنه في أقصى سرعة لمدة 1 دقيقة الوت الجيش الملكي النيبالي.</li>
	</ol>
</li>
	<li>قياس الكثافة الضوئية للجيش الملكي النيبالي في 260 nm على جهاز المطياف الضوئي، استخدام 3 ميكروليتر من عينة التيد. استخدم نفس الحجم من ح2س كقرص فارغ.</li>
	<li>تحديد عدد النسخ المركبة DENV 3 ' UTR الجيش الملكي النيبالي. 1 نانوغرام من DENV 3 ' UTR الحمض النووي الريبي (462 من القواعد، الشكل 2) قابل للمقارنة إلى 4.05 × 109 نسخ.</li>
	<li>تخزين مستوى الحمض النووي الريبي في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.</li>
</ol>3-تجهيز عينات الفيروس ل RT-قبكر
ملاحظة: الخطوات 3.1 – 3.3 التي يتعين القيام بها داخل مجلس الوزراء سلامة بيولوجية. على وجه الخصوص، يجب أن تتم معالجة المادة طافية الثقافة التي تحتوي على فيروسات معدية تحت بيئة السلامة الأحيائية مستوى 2 (أو أعلى).
<ol><li>ميكروليتر ميكس 199 معالجة المخزن مؤقت و 1 ميكروليتر من البروتيناز خالية نوكلاس ك.</li>
	<li>متسلسل تمييع المركب DENV 3 ' UTR الجيش الملكي النيبالي (من الخطوة 2، 6) 01:10 للحصول على 5 × 109 إلى 5 × 103 نسخ/ميكروليتر من الجيش الملكي النيبالي باستخدام معيار خلية الثقافة المتوسطة (مثلاً، دميم وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين والمضادات الحيوية [DMEM/10% FBS]) يحتوي على 40 وحدة/مل رناسي المانع.</li>
	<li>ميكروليتر 5 مزيج من المادة طافية ثقافة الخلايا المصابة DENV ومعيار DENV 3 ' رنا UTR مع 5 ميكروليتر من معالجة المخزن المؤقت/بروتيناز ك الحل (من الخطوة 3.1) باستخدام شرائط بكر 8-أنبوب أو لوحة بكر 96-جيدا. كعنصر تحكم غير القالب (المجلس الوطني الانتقالي)، مزيج 5 ميكروليتر من خلية الثقافة المتوسطة (أي، يتم تضمين أي فيروس) مع 5 ميكروليتر من الحل معالجة المخزن المؤقت/بروتيناز ك.</li>
	<li>وبعد الطرد المركزي موجزة، احتضان العينات في ثيرموسيكلير استخدام الشروط التالية: 1 دورة (25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق و 75 درجة مئوية لمدة 5 دقائق). ملاحظة: يمكن الاحتفاظ العينات المجهزة في 4 درجات مئوية إذا كان يتم تحليل PCR الوقت الحقيقي في نفس اليوم. للتخزين على المدى الطويل، يجب تخزين العينات في-80 درجة مئوية.</li>
</ol>4. تحليل PCR في الوقت الحقيقي
ملاحظة: ينصح بإجراء خطوات 4.1 – 4.4 داخل غطاء نظيفة لتقليل التلوث من أي المنتجات ذات الصلة amplicon أو رناسي.
<ol><li>إعداد مزيج رئيسي الرايت قبكر مع كاشف RT-PCR خطوة واحدة (جدول المواد) في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل (رناسي الحرة) باستخدام DENV 3 ' محددة UTR الإشعال وتحقيق فلوروجينيك (الجداول 1). مضاعفة حجم كل مكون (الجدول 4) ذكرت 11% أكثر من العدد الكلي للعينات، بما في ذلك ردود فعل الجيش الملكي النيبالي، والمجلس الوطني الانتقالي القياسية.</li>
	<li>اليكووت 8 ميكروليتر من مزيج الرئيسي في البئر لاستخدامها في صفيحة بكر 96-جيدا في الوقت الحقيقي (جدول المواد).</li>
	<li>بإيجاز، الطرد المركزي العينات المجهزة، بما في ذلك معيار DENV 3 ' UTR الجيش الملكي النيبالي، والمجلس الوطني الانتقالي (من الخطوة 3، 4) وإضافة 2 ميكروليتر من العينات لكل بئر من لوحة بكر 96-جيدا في الوقت الحقيقي.</li>
	<li>إغلاق لوحة بكر مع الفيلم لاصقة بصريا واضحة.</li>
	<li>الطرد المركزي باختصار اللوحة في 200 x ز لإزالة فقاعات الهواء.</li>
	<li>ضع اللوحة في صك PCR الوقت الحقيقي ودورة اللوحة باستخدام الشروط التالية: 1 دورة RT المرحلة (25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق)، دورة 1 من مرحلة تنشيط بوليميراز (95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة)، دورات 40 مرحلة التضخيم (95 درجة مئوية ل 10 s و 60 درجة مئوية لمدة 30 s [واحد الحصول على البيانات في هذه الخطوة]).</li>
	<li>تحديد عدد النسخ من الجيش الملكي النيبالي DENV في العينات باستخدام برمجيات المرتبطة ببكر في الوقت الحقيقي.<ol>
<li>في إطار الإعداد ، قم بتعيين من رد فعل ليتم تحليلها كنموذج غير معروف جيدا.</li>
		<li>تعيين بئر متسلسل المخفف DENV 3 ' UTR الجيش الملكي النيبالي معيار ، واكتب عدد النسخ المتوقع لمستوى الحمض النووي الريبي في كل بئر (مثلاً، إذا استخدمت 5 × 103 نسخ/ميكروليتر من الجيش الملكي النيبالي الحل القياسية، اكتب 5,000). تعيين جيدا مراقبة سلبية للمجلس الوطني الانتقالي.</li>
		<li>في إطار تحليل ، انقر فوق تحليل ، وتأكد من أن معامل الارتباط (ص2) المنحنى القياسي ولدت يساوي أو أكبر من 0.98.</li>
		<li>عموما، استخدام الإعدادات الافتراضية Ct (عتبة: السيارات، الأساس بدء دورة: السيارات، ودورة نهاية خط الأساس: السيارات) للتحليل. ملاحظة: عدد العينات غير معروف نسخة تلقائياً تحسب على أساس قيم العتبة دورة (Ct) من ردود الفعل الفردية. يعتبر عدد نسخ المحسوبة لكل عينة من نسخ الحمض النووي الريبي لكل 10 ميكروليتر RT qPCR رد فعل (مثلاً، إذا كان 12,345 هو المشار إليه في نموذج غير معروف ، وهذا يعني أن نسخ 12,345 من الجيش الملكي النيبالي DENV موجودة في رد فعل).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pastorino, B., Nougairede, A., Wurtz, N., Gould, E., de Lamballerie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+host+cell+factors+in+flavivirus+infection:+Implications+for+pathogenesis+and+development+of+antiviral+drugs.">Role of host cell factors in flavivirus infection: Implications for pathogenesis and development of antiviral drugs.</a> Antiviral Research. 87 (3), 281-294 (2010).</li><li>Fauci, A. S., Morens, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+in+the+Americas--Yet+Another+Arbovirus+Threat.">Zika Virus in the Americas--Yet Another Arbovirus Threat.</a> New England Journal of Medicine. 374 (7), 601-604 (2016).</li><li>Wen, Z., Song, H., Ming, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+Zika+virus+cause+microcephaly?.">How does Zika virus cause microcephaly?.</a> Genes and Development. 31 (9), 849-861 (2017).</li><li>Guzman, M. G., Harris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue.">Dengue.</a> Lancet. 385 (9966), 453-465 (2015).</li><li>Low, J. G., Ooi, E. E., Vasudevan, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Status+of+Dengue+Therapeutics+Research+and+Development.">Current Status of Dengue Therapeutics Research and Development.</a> Journal of Infectious Diseases. 215 (suppl_2), S96-S102 (2017).</li><li>Sukhavachana, P., Nisalak, A., Halstead, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+techniques+for+the+study+of+dengue+viruses.">Tissue culture techniques for the study of dengue viruses.</a> Bulletin of the World Health Organization. 35 (1), 65-66 (1966).</li><li>Tang, K. F., Ooi, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+dengue:+an+update.">Diagnosis of dengue: an update.</a> Expert Review of Anti-Infective Therapy. 10 (8), 895-907 (2012).</li><li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+RyDEN+(C19orf66)+as+an+Interferon-Stimulated+Cellular+Inhibitor+against+Dengue+Virus+Replication.">Characterization of RyDEN (C19orf66) as an Interferon-Stimulated Cellular Inhibitor against Dengue Virus Replication.</a> PLoS Pathogens. 12 (1), e1005357 (2016).</li><li>Callahan, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+serotype-+and+group-specific+fluorogenic+reverse+transcriptase+PCR+(TaqMan)+assays+for+dengue+virus.">Development and evaluation of serotype- and group-specific fluorogenic reverse transcriptase PCR (TaqMan) assays for dengue virus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 39 (11), 4119-4124 (2001).</li><li>Low, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Dengue+infection+and+outcome+study+(EDEN)+-+study+design+and+preliminary+findings.">Early Dengue infection and outcome study (EDEN) - study design and preliminary findings.</a> Annals of the Academy of Medicine, Singapore. 35 (11), 783-789 (2006).</li><li>Hishiki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-mediated+ISG15+conjugation+restricts+dengue+virus+2+replication.">Interferon-mediated ISG15 conjugation restricts dengue virus 2 replication.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 95-100 (2014).</li><li>Diamond, M. S., Zachariah, M., Harris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycophenolic+acid+inhibits+dengue+virus+infection+by+preventing+replication+of+viral+RNA.">Mycophenolic acid inhibits dengue virus infection by preventing replication of viral RNA.</a> Virology. 304 (2), 211-221 (2002).</li><li>Takhampunya, R., Ubol, S., Houng, H. S., Cameron, C. E., Padmanabhan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+dengue+virus+replication+by+mycophenolic+acid+and+ribavirin.">Inhibition of dengue virus replication by mycophenolic acid and ribavirin.</a> Journal of General Virology. 87 (Pt 7), 1947-1952 (2006).</li><li>Akondy, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+viral+load+determines+the+magnitude+of+the+human+CD8+T+cell+response+to+yellow+fever+vaccination.">Initial viral load determines the magnitude of the human CD8 T cell response to yellow fever vaccination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (10), 3050-3055 (2015).</li><li>Edwards, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+diagnosis+and+analysis+of+Chikungunya+virus.">Molecular diagnosis and analysis of Chikungunya virus.</a> Journal of Clinical Virology. 39 (4), 271-275 (2007).</li><li>Hummel, K. B., Lowe, L., Bellini, W. J., Rota, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+quantitative+gene-specific+real-time+RT-PCR+assays+for+the+detection+of+measles+virus+in+clinical+specimens.">Development of quantitative gene-specific real-time RT-PCR assays for the detection of measles virus in clinical specimens.</a> Journal of Virological Methods. 132 (1-2), 166-173 (2006).</li><li>Peeling, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+diagnostic+tests:+dengue.">Evaluation of diagnostic tests: dengue.</a> Nature Reviews: Microbiology. 8 (12 Suppl), S30-S38 (2010).</li><li>Bae, H. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+yellow+fever+virus:+a+comparison+of+quantitative+real-time+PCR+and+plaque+assay.">Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay.</a> Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).</li><li>Colton, L., Biggerstaff, B. J., Johnson, A., Nasci, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+West+Nile+virus+in+vector+mosquito+saliva.">Quantification of West Nile virus in vector mosquito saliva.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 21 (1), 49-53 (2005).</li><li>Richardson, J., Molina-Cruz, A., Salazar, M. I., Black, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+dengue-2+virus+RNA+during+the+extrinsic+incubation+period+in+individual+Aedes+aegypti.">Quantitative analysis of dengue-2 virus RNA during the extrinsic incubation period in individual Aedes aegypti.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 74 (1), 132-141 (2006).</li><li>Wang, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+dengue+virus+replication+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+dengue+virus+type+2-infected+patients+by+a+reverse+transcription-real-time+PCR+assay.">Detection of dengue virus replication in peripheral blood mononuclear cells from dengue virus type 2-infected patients by a reverse transcription-real-time PCR assay.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40 (12), 4472-4478 (2002).</li><li>Gnadig, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxsackievirus+B3+mutator+strains+are+attenuated+in+vivo.">Coxsackievirus B3 mutator strains are attenuated in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), E2294-E2303 (2012).</li><li>Rudenko, N., Golovchenko, M., Cihlarova, V., Grubhoffer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tick-borne+encephalitis+virus-specific+RT-PCR--a+rapid+test+for+detection+of+the+pathogen+without+viral+RNA+purification.">Tick-borne encephalitis virus-specific RT-PCR--a rapid test for detection of the pathogen without viral RNA purification.</a> Acta Virologica. 48 (3), 167-171 (2004).</li><li>Pastorino, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+TaqMan+RT-PCR+assay+without+RNA+extraction+step+for+the+detection+and+quantification+of+African+Chikungunya+viruses.">Development of a TaqMan RT-PCR assay without RNA extraction step for the detection and quantification of African Chikungunya viruses.</a> Journal of Virological Methods. 124 (1-2), 65-71 (2005).</li><li>Nishimura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+noroviruses+in+fecal+specimens+by+direct+RT-PCR+without+RNA+purification.">Detection of noroviruses in fecal specimens by direct RT-PCR without RNA purification.</a> Journal of Virological Methods. 163 (2), 282-286 (2010).</li><li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+real-time+polymerase+chain+reaction+assay+for+rapid+high-throughput+detection+of+highly+pathogenic+North+American+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+in+China+without+RNA+purification.">A direct real-time polymerase chain reaction assay for rapid high-throughput detection of highly pathogenic North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China without RNA purification.</a> Journal of Animal Science and Biotechnology. 5 (1), 45 (2014).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

اليوم، أصبح الكشف عن الحمض النووي الفيروسي PCR الوقت الحقيقي القائم على فلوري بمعيار الذهب للتشخيص الجزيئي للفيروسات البشرية المسببة للمرض، نظراً لحساسية وسرعتها7. هذا مهم خاصة لتأكيد الإصابة بعدوى الفيروس في المرحلة المبكرة من الأمراض المعدية الحادة مثل حمى الضنك17. أيضا، في ميدان البحوث الأساسية دنيف، مقايسة RT-قبكر هو أداة لا غنى عنها لرصد فيروس النسخ المتماثل في المختبر الثقافة، مما سيؤدي إلى فهم بيولوجيا النسخ المتماثل DENV واكتشاف مثبطات المضادة للفيروسات. في هذه الدراسة، المقايسة PCR الوقت الحقيقي القائم على فلوري كان تطويرها بمزيج من معالجة المخزن مؤقت وكاشف RT-PCR خطوة واحدة حيث أن DENV الجيش الملكي النيبالي في المادة طافية الثقافة من الخلايا المصابة استطاعت كمياً ب RT qPCR دون تنقية جينوم الرنا الفيروسي. عند مقارنتها بفحوصات روتينية للكشف عن الفيروسات النسخ المتماثل، مثل المقايسة اللوحة أو أليسا التقليدية RT-قبكر استخدام الحمض النووي الريبي تنقية6،7، بروتوكول مبسط للمقايسة RT-qPCR أسفرت عن انخفاض كبير في الوقت و الخطوات اللازمة لتحديد كمية الحمض النووي الريبي DENV. وهذا أيضا سمة هامة ومزايا في التقليل من التلوث وفقدان المواد الجينية. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن استخدام غطاء نظيف ضروري في تركيب IVT (الخطوة 2، 1) وردود الفعل RT-قبكر (خطوات 4.1-4.4) لتجنب التلوث عبر أي من المنتجات ذات الصلة amplicon أو رناسي. كما أنها حاسمة للتعامل مع ثقافة طافية، بما في ذلك الفيروسات المعدية، داخل السلامة الأحيائية مجلس الوزراء (الخطوة 3، 3) للحد من خطر الإصابة بالمختبر.
آخر أهمية الإنزيم RT qPCR المباشر أن طائفة واسعة من نسخ الرنا الفيروسي يمكن أن تحلل في نفس الوقت دون تخفيف أو تركيز العينة. عندما تستخدم تسلسلياً مخفف DENV 3 ' رنا UTR معياراً، البروتوكول RT qPCR مباشرة إنتاج منحنى قياسي خطي على مدى سبعة أوامر من حجم، والحد الأدنى للتقدير الكمي 500 نسخة الحمض النووي الريبي (الشكل 2). للكشف عن DENV في المادة طافية الثقافة من الخلايا المصابة، 8 × 103 إلى 8 × 10-2 بفو الفيروسات في 10 ميكروليتر RT qPCR كانوا ضمن مجموعة من DENV 3 ' المعيار UTR الحمض النووي الريبي، وتم حساب الحد الأدنى للكشف (8 × 10-2 بفو) تحتوي على 11 ، نسخ الحمض النووي الريبي ± 7,077 400 (الشكل 3B). علما، كما ورد في عدة مصفر الدراسات18،،من1920، لوحظ أيضا أن نسبة أكبر من الفيروسية نسخ الحمض النووي الريبي للفيروس عيار المعدية (أي، بفو) في عينات DENV في هذه الدراسة. هذه المبالغة في تقدير يفترض أن تكون إلى حد كبير بسبب وجود خلل (أيغير المعدية) فيروسات أو خالية من الجيش الملكي النيبالي الفيروسية أطلق سراحهم من الخلايا المصابة والميتة. على الرغم من أن نسبة نسخ الحمض النووي الريبي: بفو التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة (1.1 × 105 إلى 1.3 × 105 الجيش الملكي النيبالي نسخ/بفو) لا يتفق مع البيانات المعروضة سابقا (نسب تتراوح بين 1 إلى 3 سجل)21،20، وهذا قد يكون ويعزى إلى الفارق في سلالات الفيروسات أو الخلايا أو ظروف الثقافة المستخدمة. آخر التفسير المحتمل لهذا التباين، حيث لا توجد عملية تنقية الحمض النووي الريبي متورطة في مقايسة RT-qPCR المباشرة المبينة في هذا التقرير، أكثر من الجيش الملكي النيبالي DENV في المادة طافية الثقافة يمكن الكشف عنها بواسطة تحليل PCR الوقت الحقيقي دون فقدان الفيروسية المواد الجينية.
بساطة RT-qPCR المباشر يعزز القدرة على التعامل مع عدد كبير من العينات في تنسيقات متعددة جيدا، مثل لوحة 96-جيدا. ولذلك، ستساعد هذه الخاصية التطبيق المستقبلي للانزيم قبكر RT مباشرة إلى دراسة فرز الفائق لاكتشاف العقاقير المضادة-DENV. وفي الواقع، في هذا التقرير، تم بحث تطبيق الإنزيم RT qPCR مباشرة للتحقق من مثبط DENV المضادة، الآلام والكروب الذهنية،، والنتيجة أظهرت أنه يمكن مقارنته بقيمة50 IC من الآلام والكروب الذهنية التي حصل عليها المقايسة RT-qPCR المباشرة (الشكل 4) وذكرت في الدراسات السابقة باستخدام اللوحة المقايسة12،13. وهذا يدل على أن قبكر RT مباشرة مقايسة مفيدة لتقييم تأثير المثبطة للعوامل المضادة للفيروسات على نحو مناسب ويمكن اعتمادها في مخدرات فحص الدراسة في المستقبل.
في هذه الدراسة، بذلت محاولات لتطبيق مباشر RT-qPCR للكشف عن فيروسات الحمض النووي الريبي الأخرى. كما هو موضح في الشكل 5، عند تخفيف إذ ثلاثة فيروسات الحمض النووي الريبي الأخرى (يفف، تشيكف، ومليون إلكترون فولط) تصنف إلى أجناس مختلفة (فيروسات مصفرة وتوجافيريداي باراميكسوفيريداي، على التوالي) درست باستخدام سبق الإشعال المبلغ عنها وفلوروجينيك تحقيقات محددة إلى تسلسل الحمض النووي الريبي الفيروسية منها. تم الحصول على الارتباطات الجيدة بين التتر المعدية وقيم Ct بفحوصات قبكر RT مباشرة، والارتباط أوامر خطية 4-6 من حجم. وهذا يوحي بأن البروتوكول RT qPCR مباشرة قابلة للتكيف لأنواع مختلفة من فيروسات الرنا بمجرد تغيير الإشعال الخاصة بالفيروس ويَسْبِر فلوروجينيك.
ومع ذلك، تتفاوت الحساسية للكشف عن الفيروسات اختبرت في هذه الدراسة (الشكل 5). وينبغي تعديل واحد من البروتوكول التي يمكن تحسين الكشف عن هدف الفيروس الحمض النووي الريبي استخدام مجموعة جديدة من تسلسل التحقيق التمهيدي/. بالإضافة إلى ذلك، خطوة أساسية للمقايسة RT-qPCR المباشر الناجح يعتقد أن الإفراج عن كفاءة الجينوم الفيروسي خلال العينة تجهيز خطوة (الخطوات 3.1-3.4). سيكون هذا من أهمية خاصة للكشف عن فيروسات مستقرة مثل فيروسات غير المغلفة الكمية. على الرغم من أن كتجربة أولية، B3 كوكسساكيفيروس (CVB3)، فيروس الحمض النووي الريبي غير يلفها المنتمين إلى بيكورنافيريداي، تعرضت للمقايسة RT qPCR مباشرة باستخدام كبسولة تفجير CVB3 محددة هو موضح سابقا، ومسبار الفلورية22، تعذر الكشف عن إشارة amplicon إيجابية حتى مع مخزون فيروس عالية-عيار (1 × 105 بفو/mL). ويعتبر هذا يعزى إلى حد كبير إلى السلامة البدنية العالية للفيروسات غير المغلفة. وحتى الآن، بعض فحوصات RT-PCR التي لا تتطلب تنقية الحمض النووي قد وضعت للكشف عن فيروسات الرنا عدة، التي تستخدم بروتوكولات مختلفة في الإفراج عن الحمض النووي الريبي الخطوة23،،من2425، 26. وبالتالي، يزيد استخدام العلاجات البديلة (أو الإضافية)، مثل احتضان عينة الفيروس عند درجة حرارة عالية، يحتمل أن تكون الحساسية للكشف.
وباختصار، كان البروتوكول RT-qPCR المباشر نمواً في هذه الدراسة طريقة بسيطة وسريعة ولكن موثوق بها للتحديد الكمي للجيش الملكي النيبالي الفيروسية في المادة ثقافة طافية من الخلايا المصابة. بسبب هذه البساطة، يمكن عملية المقايسة RT qPCR مباشرة عدد من العينات في وقت قصير، التي تبشر بالتحليل الفائق للنسخ المتماثل الفيروس. وعلاوة على ذلك، تجلى أيضا تطبيق البروتوكول RT qPCR مباشرة إلى غيره من فيروسات الرنا. ولذلك، ينبغي هذا النهج أداة مفيدة لرصد كفاءة في حالات العدوى بالفيروس الحمض النووي الريبي في إعداد بحوث مختبرية، وربما في التشخيص السريري.

جنس مصفر من عائلة فيروسات مصفرة تضم أكثر من 70 يلفها، فيروسات الرنا إيجابية-الذين تقطعت بهم السبل التي هي المنقولة بواسطة البعوض والقراد. الأهم من ذلك، والعدوى مصفر في البشر غالباً ما يؤدي إلى المرض السريرية الشديدة، مثل التهاب الدماغ والحمى النزفية1. وفي الواقع، تفشي الفيروس Zika (زيكف)، مصفر، مؤخرا انتشر الفلزي في جميع أنحاء الأمريكتين وقد ثبت أن تترافق مع المضاعفات العصبية، بما في ذلك صغر الرأس2،3. Flaviviruses، وبالتالي، أثر كبير السريرية والاقتصادية في المجتمع الحديث.
مصفر مهم فيروس حمى الدنج (DENV)، أحد فيروسات المنقولة بالبعوض وزعت على نطاق واسع في المناطق الاستوائية وشبه الاستوائية من العالم. DENV يحيل بعوضة البعوض، بما في ذلك Aedes albopictus و بعوض الزاعجة المصرية، أدى إلى انتشار حالات تفشي حمى الضنك4على الصعيد العالمي. حاليا، ومنظمة الصحة العالمية (WHO) يصنف مرض حمى الضنك كثلاث فئات: حمى الضنك دون علامات التحذير، وحمى الضنك مع علامات التحذير، وحمى الضنك الشديد4. على الرغم من أن العدوى الأولية مع واحدة من اللقاح أربعة من DENV (DENV-1 إلى-4) غالباً غير متناظرة أو المقيدة ذاتيا، وقد أظهرت الدراسات الوبائية أن العدوى الثانوية للقاح مختلفة يزيد خطر الإصابة بأشكال أكثر خطورة من حمى الضنك. تجدر الإشارة إلى أن تعزيز تعتمد على جسم DENV العدوى الناجمة عن عدم أو سوبنيوتراليزينج الأجسام المضادة التي أنتجها خلال الإصابة الأولية قد اقترح كآلية محتملة للضنك الشديد الذي حدث كالعدوى الثانوية. لا من العقاقير المضادة للفيروسات المحددة غير متوفرة ل الإصابة DENV5.
لتطوير العوامل المضادة للفيروسات ضد DENV، الروتين وفحوصات قوية، وقابلة لإعداد الفائق، ضرورية للكشف عن النسخ المتماثل الفيروس كمياً. تقليديا، فحوصات بيولوجية (مثلاً، تحليل اللوحة) للتحديد الكمي للفيروسات المعدية وفحوصات مناعية (مثلاً، المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم [أليسا]) للكشف عن المستضدات الفيروسية قد استخدمت لرصد DENV النسخ المتماثل في المختبر و في فيفو6،7. ومع ذلك، هذه الاختبارات غالباً ما تكون شاقة ويتطلب عدة أيام لإنجاز، مما يعوق التعامل مع عدد كبير من العينات. وفي هذا الصدد، RT qPCR مقايسة موثوق بها للكشف عن الإصابة DENV: أنها محددة وحساسة وسريعة نسبيا7. وبالإضافة إلى ذلك، قد تقنية RT qPCR المزيد من المزايا في شكل الفائق. ومع ذلك، الإجراء النموذجي ل RT-PCR لفيروسات الرنا يطالب باسترداد الأحماض النووية الفيروسية من العينات التي تم جمعها. على الرغم من أن يمكن استخدام مختلف أساليب الاستخراج RT-قبكر، يزال يلزم خطوات متعددة للحصول على الحمض النووي الريبي الفيروسية المنقاة. أيضا، تتطلب فحوصات RT qPCR عادة أعمدة الدوران مكلفة أو المذيبات العضوية الخطرة، مما يجعل عملية إعداد أكثر تعقيداً. نظراً لتجنب سوء و/أو التلوث المتبادل بين العينات عامل حاسم لنجاح التحديد الكمي للجينوم الفيروسي، أسلوب أقل شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً المفضل، لا سيما إذا كان RT-qPCR ليتم تطبيقها على تنسيق الفائق.
هنا، نحن تقرير إجراء الرايت قبكر بسيطة لقياس الحمض النووي الريبي DENV في المادة طافية ثقافة من الخلايا المصابة لا تنطوي على تنقية الجيش الملكي النيبالي الفيروسية. هذا البروتوكول RT-قبكر الأمثل ويتألف من خطوتين: ط) الحضانة للمادة طافية ثقافة الخلية المصابة DENV مع معالجة المخزن المؤقت، وثانيا) خطوة واحدة RT-قبكر على صك PCR الوقت الحقيقي. وبناء على ذلك، يمكن الكشف عن الحمض النووي الريبي DENV في ثقافة طافية داخل 90 دقيقة (الشكل 1). ونحن أيضا وصف تطبيق RT-قبكر المباشر لعدوى فيروس الحمض النووي الريبي الأخرى.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max DNA Polymerase</td>
			<td>Takara Bio. Inc</td>
			<td>R045A</td>
			<td>Comparable PCR reagent kit can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A24811</td>
			<td>Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x Gel Loading Dye</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td>Comparable gel loading dye can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Log DNA Ladder</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3200</td>
			<td>0.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Scene Tablet</td>
			<td>Astec</td>
			<td>GST-33</td>
			<td>Comparable gel imaging system can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustra GFX PCR Purification Kit</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9034-70</td>
			<td>Comparable gel extraction kit can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSpectrometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6135000905</td>
			<td>Comparable spectrophotometer can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscrip T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2238</td>
			<td>Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Takara Bio. Inc</td>
			<td>2313A</td>
			<td>40 units/&#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Comparable RNA purification kit can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellAmp Direct RNA Prep Kit</td>
			<td>Takara Bio. Inc</td>
			<td>3733Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>15679-06</td>
			<td>&#62; 600 units/mL. Comparable reagent can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal Probes One-Step Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4346907</td>
			<td>Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>StepOnePlus-01</td>
			<td>Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring dengue virus rna in the culture supernatant of infected cells by real-time quantitative polymerase chain reaction

وفي الوقت الحاضر، بوليميراز في الوقت الحقيقي التفاعل المتسلسل (PCR) التكنولوجيا أداة لا غنى عنها للكشف والتحديد الكمي للجينوم الفيروسي في مختبرات البحوث، وكذلك للتشخيص الجزيئي، بسبب حساسيتها، خصوصية، و الراحة. ومع ذلك، في معظم الحالات، تحليل PCR (qPCR) الكمية تستخدم عادة للكشف عن الإصابة بالفيروس وقد اعتمدت على تنقية الحمض النووي الفيروسي قبل الخطوة PCR. في هذه الدراسة، يوضع الإنزيم qPCR (RT-qPCR) النسخ العكسي القائم على الأسفار من خلال الجمع بين معالجة المخزن مؤقت وكاشف RT-PCR خطوة واحدة حيث أن كل عملية، من الحصاد من المادة طافية الثقافة للمصابين بالفيروس الخلايا حتى الكشف في الوقت الحقيقي، يمكن أن يؤديها دون تنقية الجيش الملكي النيبالي الفيروسية. ويتيح البروتوكول المعمول التحديد الكمي لتركيزات طائفة واسعة من الجيش الملكي النيبالي فيروس حمى الضنك (DENV) في 90 دقيقة. وبالإضافة إلى ذلك، يتجلى تكيف الإنزيم RT qPCR مباشرة لتقييم وكيل المضادة للفيروسات بتجربة في المختبر باستخدام مثبط DENV سبق الإبلاغ عنها، حمض ميكوفينوليك (الآلام والكروب الذهنية). وعلاوة على ذلك، يمكن قياسها كمياً فيروسات الحمض النووي الريبي الأخرى، بما في ذلك فيروس الحمى الصفراء (يفف) وفيروس الشيكونغونيا (تشيكف) وفيروس الحصبة (مليون إلكترون فولط)، قبل qPCR RT مباشرة مع البروتوكول نفسه. ولذلك الإنزيم RT qPCR المباشرة الموصوفة في هذا التقرير مفيدة لمراقبة النسخ المتماثل فيروسات الرنا بطريقة بسيطة وسريعة، وستوضع كذلك إلى منصة واعدة لدراسة الفرز الفائق والتشخيص السريري.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

تحليل سلسلة من ردود الفعل بوليميريز الكمية في الوقت الحقيقي جنبا إلى جنب مع النسخ العكسي (RT-قبكر) وقد استخدمت على نطاق واسع لقياس مستوى الإصابة بفيروسات الرنا. نقدم هنا مقايسة RT-qPCR مباشرة، التي لا تتطلب خطوة تنقية الحمض النووي الريبي، وضعت للتحديد الكمي للعديد من الفيروسات الجيش الملكي النيبالي، بما في ذلك فيروس حمى الدنج.

قياس فيروس حمى الدنج الجيش الملكي النيبالي في المادة طافية الثقافة من الخلايا المصابة بسلسلة البلمرة الكمية في الوقت الحقيقي

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأمراض المعدية. فيما يتعلق بحمى الضنك، أو حمى شيكونغونيا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية نفسها، انها قادرة على قياس الحمض النووي الريبي الفيروسي بطريقة بسيطة وسريعة.على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في البحوث الأساسية للفيروسات، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على البحوث الأخرى مثل ارتفاع من خلال وضع دراسة فحص المخدرات والتشخيص السريري ضد الفيروسات الشعبية البشرية. إن البرهان الرئيسي على هذه الطريقة أمر بالغ الأهمية. كما عينات الطوابع معالجة ومجلس الوزراء السلامة الأحيائية مهمة لتجنب التلوث عبر أو العدوى المختبرية.وسوف يكون إثبات الإجراء أستاذ مساعد ومساعدنا التقني من مختبرنا. بعد إعداد قالب الحمض النووي لمعيار RNA ، اخلط رد فعل النسخ في vivo مع 100 نانوجرام من قالب الحمض النووي المعد في أنبوب PCR 0.2 ملليلتر. احتضان في 37 درجة مئوية في دورة الحرارة لمدة ساعتين.بعد ذلك، إضافة ميكرولتر واحد من DNAase ومواصلة الحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تعيين مجموعة تنقية الجيش الملكي النيبالي وإضافة 80 ميكرولترات من المياه الحرة RNAase و 350 ميكرولتر من مخزن الالتقاط، بما في ذلك 1٪ بيتاماركابتويتانول إلى خليط التفاعل في أنبوب 1.5 ملليلتر. إضافة 250 ميكرولترات من الإيثانول 100٪واستخدم ماصة لخلط.ثم، تجميع عمود تنقية RNA مع أنبوب جمع. نقل عينة RNA إلى عمود تنقية. الطرد المركزي العمود في 8، 000 مرات G لمدة 15 ثانية وتجاهل تدفق من خلال.بعد ذلك، تطبيق 500 ميكرولترات من الغسيل العازلة على العمود والطرد المركزي في 8، 000 مرات G لمدة دقيقتين. بعد ذلك، ضع العمود في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 ملليلتر. أضف 50 ميكرولترات من الماء المجاني RNAase واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة.الطرد المركزي العمود في السرعة القصوى لمدة دقيقة واحدة ل allute الجيش الملكي النيبالي. باستخدام مقياس الطيف، وقياس الكثافة البصرية من 3 ميكرولترات من الحمض النووي الريبي alluted في 260 نانومتر. ثم، تحديد عدد نسخة من فيروس حمى الضنك توليفها ثلاثة الجيش الملكي النيبالي UTR رئيس.تخزين معيار RNA في ناقص 80 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام. أولاً، امزج 199 ميكرولترات من مخزن المعالجة مع ميكرولتر واحد من البروتينات الخالية من النياتية K.Using خلية ثقافة المتوسطة، وتمييع مسلسل فيروس حمى الضنك المعدة ثلاثة RNA UTR الرئيسية 1-1 للحصول على معايير الحمض النووي الريبي في تركيزات تتراوح بين 5، 000، 000 إلى 5، 000 نسخة لكل ميكرولتر عن طريق تكرار الأنابيب و الدوامة. نقل 5 ميكرولتررس من ثقافة فائقة من الخلايا المصابة فيروس حمى الضنك وفيروس حمى الضنك 3 UTR RNA الرئيسي معيار إما شرائط A2 PCR أو الآبار من 96 جيدا PCR لوحة.مزيج في خمسة ميكرولترات من الحل الذي يحتوي على معالجة العازلة والبروتينات K.Centrifuge لفترة وجيزة في 200 مرة G لمدة خمس ثوان. احتضان العينات في دورة حرارية في 25 درجة مئوية لمدة عشر دقائق ثم في 75 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. باستخدام فيروس حمى الضنك ثلاثة primers المحددة UTR الرئيسية ومسبار الفلوروجينيك، وإعداد مزيج ماجستير RTQ PCR مع كاشف RT PCR خطوة واحدة في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير 1.5 ملليلتر.Alloquote ثمانية ميكروليتر من مزيج الرئيسي في بئر من 96 جيدا في الوقت الحقيقي لوحة PCR. ثم، إضافة اثنين microliters من كل عينة إلى كل بئر من 96 جيدا في الوقت الحقيقي PCR لوحة. ختم لوحة مع فيلم لاصق واضح بصريا.لفترة وجيزة الطرد المركزي لوحات في 200 مرة G لمدة خمس ثوان لإزالة أي فقاعات الهواء. ثم، ضع لوحة في صك PCR في الوقت الحقيقي. باستخدام PCR في الوقت الحقيقي البرامج المرتبطة ، انتقل إلى إطار الإعداد وتعيين بئر رد فعل لتحليلها على أنها عينة غير معروفة.المقبل, تعيين بئر من فيروس حمى الضنك المخفف تسلسليا ثلاثة الجيش الملكي النيبالي UTR رئيس كمعيار واكتب عدد نسخة المتوقع من معيار RNA في كل بئر. تعيين عنصر تحكم غير قالب كـ عنصر تحكم سالب. ثم، بدء تشغيل أداة RT PCR و cycle لوحة كما هو موضح في بروتوكول النص.في إطار التحليل، انقر فوق تحليل وتأكد من أن معامل الارتباط المنحنى القياسي الذي تم إنشاؤه يعادل أو أكبر من 0.98. بشكل عام، استخدم إعدادات CT الافتراضية للتحليل. في هذه الدراسة، يخضع تخفيف متسلسل عشرة أضعاف من فيروس حمى الضنك الحمض النووي الموحد إلى تحليل PCR RTQ مباشرة باستخدام ثلاثة primers UTR الرئيسي محددة ومسبار الفلوريك.منحنى خطي من هذا التحليل يبين أن الارتباط هو جيد. بعد ذلك، يتم تطبيق هذا المقايسة RTQ PCR المباشر لتحديد كمية فيروس حمى الضنك في ثقافة فائقة من الخلايا المصابة بالفيروس. وينظر إلى وجود ارتباط جيد بين تيتر عدوى فيروس حمى الضنك وCT، وهو رقم الدورة التي تعتبر أن النقطة التي ترتفع فيها إشارة الفلورسنت مع نمو أسي فوق الخلفية.عندما يتم رسم قيم CT المتولدة من تخفيف تسلسلي لمخزون فيروس حمى الضنك مع الاترات المعدية المعروفة على المنحنى القياسي الذي تم إنشاؤه سابقًا ، فإن بيانات العينات التي تتراوح بين 08 و 8 ، 000 PFU لكل رد فعل تعتبر ضمن نطاق تلك التي تخضع للرنا الريبي القياسي. وهذا يشير إلى أن عينات فيروس حمى الضنك مع مجموعة واسعة من الاترات المعدية يمكن تحليلها في نفس الوقت عند استخدام هذه التقنية. ويتم تقييم هذا الفحص من حيث قابليته للتطبيق على التحقق من صحة العوامل المضادة للفيروسات ضد فيروس حمى الضنك.عند المعالجة بـ 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من ال MPA، لوحظ انخفاض بنسبة 99.87٪ تقريباً من ثقافة التحكم المعالجة في DMSO. وأخيرا، يتم اختبار تطبيقات هذا الفحص مع فيروسات RNA الأخرى. عندما يتعرض مخزون من فيروس الحمى الصفراء 17D سلالة لقاح لبرقية PCR RTQ مباشرة، يتم إنشاء منحنى قياسي مع ارتباط مباشر جيد بين الثدي الفيروس وقيم CT.وبالمثل، فإن التحليل المباشر لـ RTQ PCR لفيروس الحصبة والأوراق المالية للسلالات الخام لفيروس شيكونغونيا يعطي تراجعاً جيداً بين قيم الاترات المعدية وقيم CT. وستمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال دراسة الفحص. السماح لعدد كبير من العينات لاستكشاف الأدوية المضادة للفيروسات الجديدة يساوي التبسيط.لا تنس أن العمل مع المواد المعدية يمكن أن تكون خطرة للغاية وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل استخدام معدات الحماية الشخصية وخزانة السلامة الحيوية النظيفة دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

الكشف عن الفيروسات المعدية التي جمعت من الحقل عن طريق البعوض فيرو خلية الفحص الثقافة

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

قياس الحمولة الجرثومية والاستجابات المناعية في الفئران المصابة المستوحدة الليستيريا</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

تصور فيروس حمى الضنك من خلال وصفها اليكسا فلور

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

تنقية تقارب من المجمعات الأنفلونزا فيروس بروتين نووي ريبوزي من لونين من الخلايا المصابة

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

التصوير في الوقت الحقيقي من خلايا الدم النخاعي في ديناميات<em&gt; APC<sup&gt; مين / +</sup</em&gt; الأورام المعوية التي كتبها غزل القرص متحد البؤر المجهر

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

قياس مرفق والتطبع الأنفلونزا A الفيروسات في خلايا A549 بواسطة التدفق الخلوي

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

تحديد بيوفيلم بدء في الخلايا المصابة بالفيروسات من قبل البكتيريا والفطريات

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

الجمع بين تحليل للحمض النووي في مجال استخراج النفط خام Virion بتحليل الحمض النووي الريبي من الأوراق المصابة اكتشاف جينومات الفيروس الجديد

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

تحليلات تستند إلى سلسلة من ردود الفعل بوليميريز الكمية الحجمية المعوية مورين بعد العلاج بالمضادات الحيوية عن طريق الفم

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...