Name: measuring dengue virus rna in the culture supernatant of infected cells by real-time quantitative polymerase chain reaction
Uploaded: 2018-11-01T14:45:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Les auteurs remercient Subhash G. VIARD (Duke-NUS Graduate Medical School, Singapour) pour le DENV-2 isoler EDEN2 3295 et Shunro Imura (Station de quarantaine Kobe, Japon) pour le VFJ souche utilisée comme vaccin 17D. Les auteurs sont également reconnaissants aux membres du département de microbiologie et contrôle des infections pour leur aide. Ce travail est soutenu par le MEXT KAKENHI Grant nombre JP16737900.

1. préparation de la matrice d’ADN de la norme de l’ARN
<ol><li>Préparer un mélange PCR (volume total de 50 μL, tableau 1) en utilisant un ADN de plasmide vecteur contenant DENV-2 C de la Nouvelle-Guinée (NGC, numéro d’acquisition : AF038403.1) 3' non traduite de région (3' UTR)8 et amorces (T7-DENV-3 'UTR Fwd et DENV 3' UTR Rvs) dans un tube de 0,2 mL, comme décrit dans le tableau 2. Remarque : Cette étape doit être effectuée sous une hotte propre (ou dans une salle blanche) pour éviter la contamination des produits axés sur l’amplicon.</li>
	<li>PCR-amplifier le cDNA de T7 séquence-fusionnée DENV 3' UTR dans un thermocycleur, en utilisant les conditions suivantes : 30 cycles (98 ° c pendant 10 s, 55 ° C pendant 5 s et 72 ° C pendant 5 s).</li>
	<li>Mélanger la réaction de PCR avec 10 μL de 6 x chargement gel colorant et charge sur un gel d’agarose de 1 % gel avec une échelle moléculaire ADN allant de 0,1 à 10 paires de kilobases (kbp).</li>
	<li>Visualiser le produit PCR (479 paires de bases [Pb]) sous la lumière UV de longueur d’onde à l’aide d’une méthode de visualisation de l’ADN et un gel de système d’imagerie. Découper la bande d’ADN à l’aide d’un scalpel propre.</li>
	<li>Extraire l’ADN à l’aide d’un kit de purification de l’ADN (Table des matières). Remarque : Cette étape de purification peut être effectuée à l’extérieur de la hotte propre, mais il est essentiel de garder un environnement propre au cours du processus pour éviter la contamination de RNase, qui est un problème majeur dans les étapes suivantes de synthèse standard DENV RNA.<ol>
<li>Peser la tranche de gel et ajouter 100 μL de tampon de capture par 100 mg de gel tranche dans un tube de microtubes de 1,5 mL.</li>
		<li>Dissoudre le gel par incubation à 60 ° C pendant 5 à 15 min.</li>
		<li>Monter une colonne de purification de l’ADN avec un tube de prélèvement et transférer 600 μl de l’échantillon dissous dans la colonne de purification.</li>
		<li>Centrifuger à 16 000 x g pendant 30 s et jeter le cheminement. Si le volume de l’échantillon est supérieur à 600 μL, appliquer le reste de l’échantillon à la colonne de purification d’ADN après le premier tour et répétez cette étape.</li>
		<li>Appliquer 500 μL de tampon de la colonne de purification de l’ADN de lavage.</li>
		<li>Centrifuger à 16 000 x g pendant 30 s.</li>
		<li>Placer la colonne dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL.</li>
		<li>Ajouter 50 μL de tampon d’élution et incuber la colonne à température ambiante pendant 1 min.</li>
		<li>Centrifuger à la vitesse maximale pendant 1 minute éluer ADN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mesurer la densité optique de l’ADN à 260 nm sur un spectrophotomètre à l’aide de 3 μl de l’échantillon éluée. Utilisez le même volume de tampon d’élution comme blanc. Remarque : La matrice d’ADN peut être conservée à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
</ol>2. synthèse de la norme RNA DENV 3' UTR
Remarque : Maintenir la ribonucléase (RNase)-environnement libre autant que possible d’effectuer les étapes suivantes. La mise en place du réactif doit être effectuée à l’intérieur d’une hotte propre, à l’aide de tubes, des conseils et exempte de nucléase pipettes.
<ol><li>Mélanger l’in vitro (IVT) réaction de transcription (d’un volume total de 20 μL) avec 100 ng d’ARN T7 promoteur séquence fusionnée DENV 3' UTR matrice d’ADN (de l’étape 1.6) dans un tube PCR de 0,2 mL comme indiqué dans le tableau 3.</li>
	<li>Incuber le mélange à 37 ° C dans le thermocycleur pendant 2 h.</li>
	<li>Ajouter 1 μL de DNase à la réaction d’IVT et poursuivre l’incubation à 37 ° C pendant 15 min.</li>
	<li>Purifier in vitro transcrit l’ARN utilisant un kit de purification d’ARN (Table des matières).<ol>
<li>Ajouter 80 ml d’exempte de RNase H2O et 350 μL de tampon de capture, dont 1 % de β-mercaptoéthanol.</li>
		<li>Ajouter 250 μL d’éthanol à 100 % à la réaction d’IVT et mélangez-le bien de pipetage.</li>
		<li>Monter une colonne de RNA purification avec un tube de prélèvement et transférer l’échantillon de RNA dans la colonne de purification.</li>
		<li>Il centrifuger à 8 000 x g pendant 15 s et jeter le cheminement.</li>
		<li>Appliquez 500 μL de tampon de lavage à la colonne de purification RNA et il centrifuger à 8 000 x g pendant 2 min.</li>
		<li>Placer la colonne dans un tube de microtubes de 1,5 mL.</li>
		<li>Ajouter 50 μL d’exempte de RNase H2O et incuber la colonne à température ambiante pendant 1 min.</li>
		<li>Centrifuger l’il à la vitesse maximale pendant 1 minute Éluer la RNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mesurer la densité optique de l’ARN à 260 nm sur un spectrophotomètre, à l’aide de 3 μl de l’échantillon éluée. Utilisez le même volume de H2O comme blanc.</li>
	<li>Déterminer le nombre de copies de la DENV 3' UTR ARN synthétisé. 1 ng d’ARN de DENV 3' UTR (462 bases, Figure 2) est comparable à 4,05 x 109 exemplaires.</li>
	<li>Conserver la norme RNA à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
</ol>3. traitement des échantillons de Virus pour la RT-qPCR
Remarque : Les étapes 3.1 – 3.3 sont à effectuer à l’intérieur d’une armoire de sécurité biologique. En particulier, manipulation du surnageant de culture contenant un virus infectieux doit être effectuée au titre de l’environnement de niveau 2 (ou supérieur) sur la biosécurité.
<ol><li>Mix 199 μL d’un tampon de traitement et 1 μL d’exempte de nucléase protéinase K.</li>
	<li>En série de diluer la DENV 3' UTR ARN synthétisé (de l’étape 2.6) 01:10 pour obtenir 5 x 109 à 5 x 103 copies/μL de RNA standard à l’aide de cellules milieu de culture (p. ex., DMEM additionné de sérum de veau fœtal 10 % et des antibiotiques [FBS DMEM/10%]) contenant un inhibiteur de RNase 40 unités/mL.</li>
	<li>Mix 5 μL du surnageant de culture de cellules infectées par le ministère de l’environnement et la norme DENV 3' UTR ARN avec 5 μL de solution tampon/protéinase K (à l’étape 3.1) de traitement à l’aide de bandes de 8 tubes PCR ou une plaque à 96 puits PCR. Comme une commande sans modèle (NTC), mélanger 5 μl de milieu de culture cellulaire (c.-à-d., aucun virus n’est inclus) avec 5 μL de la solution tampon/protéinase K de traitement.</li>
	<li>Après une brève centrifugation, incuber les échantillons dans un thermocycleur en utilisant les conditions suivantes : 1 cycle (de 25 ° C pendant 10 min et 75 ° C pendant 5 min). Remarque : Les échantillons traités peuvent être conservés à 4 ° C si l’analyse PCR en temps réel se fait le jour même. Pour le stockage à long terme, les échantillons doivent être conservés à-80 ° C.</li>
</ol>4. Real-time PCR analyses
Remarque : Il est fortement recommandé d’effectuer étapes 4.1-4.4 à l’intérieur d’une hotte propre pour minimiser la contamination des produits liés à l’amplicon ou RNase.
<ol><li>Préparer un mélange maître RT-qPCR avec un réactif de RT-PCR en une étape (Table des matières) dans un tube de microtubes de 1,5 mL (RNase-libre) à l’aide de DENV 3' UTR propres amorces et une sonde fluorogène (tableaux 1). La quantité de chaque composant (tableau 4) selon les 11 % de plus du nombre total d’échantillons, y compris les réactions de l’ARN et NTC standards suffisante.</li>
	<li>Aliquoter 8 μL de master mix dans le puits pour servir dans une assiette PCR en temps réel de 96 puits (Table des matières).</li>
	<li>En bref, centrifuger les échantillons traités, y compris la DENV 3' UTR RNA standard et NTC (de l’étape 3.4) et ajouter 2 μL des échantillons dans chaque puits de la plaque PCR en temps réel de 96 puits.</li>
	<li>Sceller la plaque PCR avec film optiquement transparent adhésif.</li>
	<li>Brièvement, centrifuger la plaque à 200 x g pour enlever les bulles d’air.</li>
	<li>Placer la plaque dans un appareil de PCR en temps réel et le cycle de la plaque à l’aide des conditions suivantes : 1 cycle de la RT en scène (25 ° C pendant 10 min), 1 cycle de l’étape d’activation polymérase (95 ° C pendant 2 min), 40 cycles de l’étape d’amplification (95 ° C pour 10 s et 60 ° C pendant 30 s [unique d’acquisition de données à cette étape]).</li>
	<li>Déterminer le nombre de copies de l’ARN DENV dans les échantillons à l’aide d’un logiciel associées à la PCR en temps réel.<ol>
<li>Dans la fenêtre paramètres , attribuer le bien d’une réaction qui doit être analysé comme échantillon inconnu .</li>
		<li>Assignez le puits de le dilués en série DENV 3' UTR ARN en tant que norme et tapez le numéro de copie attendue de RNA norme dans chaque puits (p. ex., si 5 x 103 copies/μL de solution étalon de RNA sont utilisée, tapez 5 000). Assignez le puits comme Contrôle négatif pour NTC.</li>
		<li>Dans la fenêtre d’analyse , cliquez sur Analyze et s’assurer que le coefficient de corrélation (R2) de la courbe standard générée est équivalente ou supérieure à 0,98.</li>
		<li>En règle générale, utilisez les paramètres de Ct par défaut (seuil : auto, cycle de début planifié : auto, cycle de fin de référence : auto) pour analyse. Remarque : Le nombre de copies d’échantillons inconnus est automatiquement calculé sur les seuils de cycle (Ct) des réactions individuelles. Le nombre de copies calculé de chaque échantillon est considéré comme copies RNA par 10 réaction de RT-qPCR μL (par exemple, si 12 345 est indiquée dans un échantillon inconnu , ce qui signifie que 12 345 copies d’ARN DENV sont présents dans la réaction).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Aujourd'hui, détection d’acide nucléique viral par PCR en temps réel basé sur fluorescentes devient un étalon-or pour le diagnostic moléculaire de pathogènes virus humains, en raison de sa sensibilité et rapidité,7. Cela est particulièrement important pour confirmer l’infection par le virus dans la phase précoce de maladies infectieuses aiguës telles que la fièvre dengue,17. En outre, dans le domaine de la recherche fondamentale de DNEV, RT-qPCR test est un outil indispensable pour la surveillance de la réplication virale in vitro culture qui mènera à la compréhension de la biologie de la réplication du ministère de l’environnement et la découverte d’antiviraux inhibiteurs. Dans cette étude, la fluorescent basée sur la PCR en temps réel a été développée par une combinaison d’un tampon de traitement et un réactif de RT-PCR en une étape pour que DENV ARN dans le surnageant de culture de cellules infectées a pu être quantifiée par la RT-qPCR sans purification le génome d’ARN viral. Par rapport aux tests de routine pour détecter la réplication du virus, tels que l’essai de plaque, ELISA ou conventionnelle RT-qPCR employant RNA purification6,7, un protocole simplifié de l’essai de la RT-qPCR a donné lieu à une grande réduction du temps et étapes nécessaires pour quantifier l’ARN DENV. C’est aussi une caractéristique importante qui a des avantages à réduire au minimum la contamination et la perte du matériel génétique. Néanmoins, il est à noter que l’utilisation d’un capot propre est indispensable à l’installation de l’IVT (étape 2.1) et les réactions de la RT-qPCR (mesures 4.1 – 4,4) pour éviter la contamination croisée des produits liés à l’amplicon ou RNase. Il est également crucial gérer le surnageant, y compris des virus infectieux, à l’intérieur d’une armoire de biosécurité (étape 3.3) afin de réduire un risque d’infection de laboratoire de culture.
Une autre signification du test RT-qPCR direct, c’est qu’une vaste gamme de copies de RNA virales peut être analysée en même temps sans dilution ni de la concentration de l’échantillon. Lorsqu’on utilise un dilués en série DENV 3' UTR RNA standard, le protocole RT-qPCR direct produit une courbe d’étalonnage linéaire sept ordres de grandeur, et la limite inférieure de quantification était 500 copies RNA (Figure 2). Pour la détection du ministère de l’environnement dans le surnageant de culture de cellules infectées, 8 x 10,3 , 8 x 10-2 virus de PFU dans un 10 μL RT-qPCR étaient dans la norme gamme de DENV 3' UTR ARN, et la limite inférieure de détection (8 x 10-2 PFU) a été calculée pour contenir 11 , 400 exemplaires de RNA ± 7 077 (Figure 3 b). À noter, comme l’indiquent plusieurs flavivirus études18,19,20, le rapport le plus élevé de copies de RNA virales à titre infectieux virus (p. ex., PFU) dans des échantillons de DENV a été également observé dans cette étude. Cette surestimation est supposée pour être en grande partie en raison de la présence de défectueux (c'est-à-direnon infectieuse) virus ou l’ARN viral gratuit libérés par les cellules infectées et morts. Bien que le ratio de RNA copies : PFU obtenus dans cette étude (1,1 × 105 à 1,3 x 105 RNA copies/PFU) était incompatible avec les données présentées précédemment (rapports vont de 1 à 3 log)21,20, cela peut être attribuée à la différence de souches de virus, des cellules ou des conditions de culture utilisées. Une autre explication plausible pour la différence est que, puisque aucun processus de purification de RNA a été impliqué dans le dosage direct de RT-qPCR décrit ci-après, plus DENV ARN dans le surnageant de culture pouvaient être détecté par analyse PCR en temps réel sans aucune perte de viral matériel génétique.
La simplicité de la RT-qPCR direct améliore la capacité à gérer un grand nombre d’échantillons dans les puits multiples formats, comme une plaque à 96 puits. Par conséquent, cette propriété aidera l’application future de la dosage direct de la RT-qPCR à une étude de criblage à haut débit pour la découverte de médicaments anti-DENV. En effet, dans ce rapport, application du test pour la validation d’un inhibiteur de l’anti-DENV, MPA, RT-qPCR directe a été examinée, et le résultat a montré qu’une valeur de50 IC MPa obtenus par le dosage direct de la RT-qPCR (Figure 4) a été comparable à celle rapportés dans les études précédentes à l’aide de plaque test12,13. Cela démontre que RT-qPCR direct est un test utile pour évaluer correctement l’effet inhibiteur d’agents antiviraux et peut être adopté dans un médicament à l’étude de dépistage à l’avenir.
Cette étude, on a essayé d’appliquer la RT-qPCR directe à la détection d’autres virus à ARN. Comme illustré à la Figure 5, quand 10 fois les dilutions de trois autres virus à ARN (VFJ, CHIKV et MeV) classés en différents genres (Flaviviridae, Togaviridaeet Paramyxoviridae, respectivement) ont été examinés à l’aide précédemment signalées amorces et fluorogène sondes spécifiques les séquences d’ARN virales respectifs. Bonnes corrélations entre titres infectieux et des valeurs de Ct ont été obtenues par des essais directs de RT-qPCR et les corrélations ont été linéaires de 4 à 6 ordres de grandeur. Cela suggère que le protocole de la RT-qPCR direct est adaptable aux différents types de virus à ARN en changeant simplement les amorces spécifiques du virus et sondes fluorogéniques.
Néanmoins, la sensibilité de détection variait entre les virus analysés dans cette étude (Figure 5). Une modification du protocole permettant d’améliorer la détection de l’ARN du virus cible devrait être d’utiliser un nouvel ensemble de séquences d’apprêt/sonde. En outre, une étape clé pour l’analyse de la RT-qPCR direct le succès semble être la libération efficace du génome viral au cours de l’échantillon de traitement pas (pas 3.1 à 3.4). Ce serait d’une importance particulière pour la détection quantitative des virus stables comme un virus non enveloppé. Bien que comme une expérience préliminaire, virus Coxsackie B3 (CVB3), un virus non enveloppés à ARN appartenant à Picornaviridae, a été soumis à l’essai de RT-qPCR directe en utilisant des amorces spécifiques aux CVB3 décrites précédemment et sonde fluorescente22, un signal de l’amplicon positive n’a pas pu être détecté même avec un stock de virus haut-titre (1 x 105 UFP/mL). Cela paraît en grande partie imputables à l’intégrité physique élevée du virus non enveloppé. Jusqu'à présent, certains tests de RT-PCR qui ne nécessitent pas la purification des acides nucléiques ont été développés pour détecter plusieurs virus à ARN, qui emploient différents protocoles dans la version de RNA étape23,24,25, 26. ainsi, l’utilisation des traitements alternatifs (ou autres), par exemple une incubation d’un échantillon de virus à une température élevée, potentiellement augmente la sensibilité de détection.
En résumé, le protocole de RT-qPCR direct développé dans cette étude était une méthode simple et rapide mais fiable de quantification de l’ARN viral dans un surnageant de culture de cellules infectées. À cause de cette simplicité, le dosage direct de la RT-qPCR pourrait traiter un nombre d’échantillons en peu de temps, qui semble prometteuse pour l’analyse de haut-débit de réplication du virus. En outre, l’application du protocole RT-qPCR direct aux autres virus à ARN a aussi été démontrée. Cette approche devrait, par conséquent, être un outil utile pour surveiller efficacement les infections de virus à ARN dans un environnement de laboratoire de recherche et, éventuellement, dans les diagnostics cliniques.

Le genre Flavivirus , de la famille des Flaviviridae comprend plus de 70 enveloppé, virus à ARN positif brin qui sont transmis par les moustiques et les tiques. Ce qui est important, les flavivirus infection chez l’homme souvent conduit à cliniques sévères, telles que la fièvre et l’encéphalite hémorragique1. En effet, une récente épidémie du virus Zika (ZIKV), un flavivirus, s’est propagé de façon explosive dans toute l’Amérique et s’est avérée être associée à des complications neurologiques, y compris une microcéphalie2,3. Flavivirus, par conséquent, ont des répercussions cliniques et économiques importantes sur la société moderne.
Un flavivirus important est le virus de la dengue (DENV), un virus transmises par les moustiques, largement répandu dans les régions tropicales et subtropicales du monde. DENV est transmise par les moustiques Aedes , y compris les Aedes albopictus , Aedes aegypti, ce qui entraîne la propagation mondiale des flambées de dengue4. Actuellement, l’Organisation mondiale de la santé (OMS) classe la maladie de la dengue dans trois catégories : la dengue sans signes avant-coureurs, la dengue avec signes avant-coureurs et sévère de la dengue4. Bien que la primo-infection avec l’un des quatre sérotypes du ministère de l’environnement (DENV-1-4) est souvent asymptomatique ou spontanément vers la guérison, les études épidémiologiques ont montré que l’infection secondaire des sérotypes différents augmente le risque de formes plus graves de la dengue. Il est à noter que l’amélioration de l’infection à DENV causée par le non dépendante des anticorps ou subneutralizing les anticorps produits au cours de l’infection primaire a été proposée comme un mécanisme potentiel de la dengue sévère qui a eu lieu comme l’infection secondaire. Toutefois, aucun médicament antiviral spécifique n’est disponible pour DENV infection5.
Pour le développement d’agents antiviraux contre le ministère de l’environnement, routine et dosages robustes, qui soient prêtent bien à un cadre de haut débit, sont indispensables pour détecter la réplication du virus quantitativement. Classiquement, des dosages biologiques (p. ex., plaque assay) pour quantifier les virus infectieux et des tests immunologiques (p. ex., immuno enzymatique [ELISA]) pour la détection des antigènes viraux ont été utilisés pour surveiller la DENV réplication in vitro et in vivo6,7. Toutefois, ces tests sont souvent laborieux et nécessitent plusieurs jours à accomplir, qui empêche le traitement d’un grand nombre d’échantillons. À cet égard, RT-qPCR est un test fiable pour détecter une infection DENV : c’est relativement rapide, sensible et spécifique7. En outre, la technique de RT-qPCR a plus d’avantages dans un format haut débit. Néanmoins, la procédure typique de RT-PCR pour les virus à ARN exige la récupération des acides nucléiques viraux dans des échantillons recueillis. Bien que les différentes méthodes d’extraction peuvent être utilisés pour la RT-qPCR, plusieurs étapes sont encore nécessaires pour obtenir l’ARN viral purifiée. En outre, RT-qPCR tests exigent habituellement colonnes à centrifuger coûteux ou des solvants organiques dangereux, rendant ainsi le processus de préparation plus lourd. Puisqu’en évitant d’abus et/ou de la contamination croisée entre les échantillons est un facteur critique de succès quantification des génomes viraux, une méthode moins laborieuse et fastidieux est préférable, surtout si la RT-qPCR doit être appliquée à format de haut débit.
Nous rapportons ici une simple procédure de RT-qPCR pour mesurer DENV ARN dans un surnageant de culture de cellules infectées qui n’implique pas de purification de RNA virale. Ce protocole optimisé de la RT-qPCR est composée de deux étapes : i) l’incubation d’un surnageant de culture de cellules infectées par le ministère de l’environnement avec un tampon de traitement et en une seule étape ii) RT-qPCR sur un appareil de PCR en temps réel. En conséquence, DENV RNA dans un surnageant de culture peuvent être détecté dans les 90 min (Figure 1). Nous décrivons également l’application de la RT-qPCR direct aux autres infections à virus à ARN.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR Max DNA Polymerase</td>
			<td>Takara Bio. Inc</td>
			<td>R045A</td>
			<td>Comparable PCR reagent kit can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A24811</td>
			<td>Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x Gel Loading Dye</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td>Comparable gel loading dye can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Log DNA Ladder</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3200</td>
			<td>0.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Scene Tablet</td>
			<td>Astec</td>
			<td>GST-33</td>
			<td>Comparable gel imaging system can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustra GFX PCR Purification Kit</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28-9034-70</td>
			<td>Comparable gel extraction kit can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioSpectrometer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6135000905</td>
			<td>Comparable spectrophotometer can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAscrip T7 Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2238</td>
			<td>Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant RNase Inhibitor</td>
			<td>Takara Bio. Inc</td>
			<td>2313A</td>
			<td>40 units/&#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>Comparable RNA purification kit can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellAmp Direct RNA Prep Kit</td>
			<td>Takara Bio. Inc</td>
			<td>3733Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>15679-06</td>
			<td>&#62; 600 units/mL. Comparable reagent can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal Probes One-Step Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4346907</td>
			<td>Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>StepOnePlus-01</td>
			<td>Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring dengue virus rna in the culture supernatant of infected cells by real-time quantitative polymerase chain reaction

À l’heure actuelle, la technologie de Real-Time polymerase chain reaction (PCR) est un outil indispensable pour la détection et la quantification des génomes viraux dans les laboratoires de recherche, ainsi que pour le diagnostic moléculaire, en raison de sa sensibilité, spécificité, et plus de commodité. Toutefois, dans la plupart des cas, la PCR quantitative (qPCR) généralement utilisé pour détecter l’infection par le virus s’est appuyé sur la purification de l’acide nucléique viral avant l’étape de l’ACP. Dans cette étude, l’essai de qPCR (RT-qPCR) basés sur la fluorescence de la transcription inverse est développé grâce à la combinaison d’un tampon de traitement et un réactif de RT-PCR en une étape pour que l’ensemble du processus, à la récolte du surnageant de culture d’infectées par le virus les cellules jusqu'à la détection en temps réel, peuvent être effectuées sans purification de RNA virale. Le protocole établi permet la quantification d’un large éventail de l’ARN des concentrations de virus de la dengue (DENV) dans les 90 min. En outre, la capacité d’adaptation du RT-qPCR test direct à l’évaluation d’un agent antiviral est démontrée par une expérience in vitro à l’aide d’un inhibiteur de la DENV a déjà été indiqué, l’acide mycophénolique (MPA). En outre, les autres virus à ARN, y compris le virus de la fièvre jaune (SVA), le virus Chikungunya (CHIKV) et le virus de la rougeole (MeV), peuvent être quantifiés en direct RT-qPCR suivant le même protocole. Par conséquent, le dosage direct de RT-qPCR décrit dans le présent rapport est utile pour surveiller la réplication des virus à ARN d’une manière simple et rapide, qui sera développée en une plate-forme prometteuse pour une étude de criblage à haut débit et le diagnostic clinique.

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Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

Analyse de réaction en chaîne de polymérase quantitative en temps réel combinée avec la transcription inverse (RT-qPCR) a été largement utilisée pour mesurer le niveau des infections à virus à ARN. Nous présentons ici un dosage direct de la RT-qPCR, ne nécessitant pas une étape de purification du RNA, mis au point pour la quantification de plusieurs virus à ARN, y compris le virus de la dengue.

ARN du Virus Dengue dans le surnageant de Culture de cellules infectées par PCR Quantitative en temps réel de la mesure

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies infectieuses. En ce qui concerne la dengue, ou fièvre chikungunya. Principal avantage de cette technique elle-même, elle est capable de quantifier l’ARN viral d’une manière simple et rapide.Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu d’une recherche fondamentale sur le virus, elle peut également être appliquée à d’autres recherches telles que l’étude de dépistage des médicaments à haute teneur en médicaments et le diagnostic clinique contre les virus populogènes humains. Une démonstration majeure de cette méthode est essentielle. Comme les timbres de traitement de l’échantillon et une armoire de biosécurité sont importants pour éviter la contamination croisée ou l’infection en laboratoire.Démonstration de la procédure sera un professeur adjoint et notre assistant technique de notre laboratoire. Après avoir préparé le modèle d’ADN pour la norme d’ARN, mélanger la réaction de transcription in vivo avec 100 nanogrammes du modèle d’ADN préparé dans un tube PCR de 0,2 millilitre. Incuber à 37 degrés Celsius dans un cycleur thermo pendant deux heures.Après cela, ajouter un microlitre de DNAase et poursuivre l’incubation à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Mettez en place un kit de purification de l’ARN et ajoutez 80 microlitres d’eau libre RNAase et 350 microlitres de tampon de capture, y compris 1% de bêtamarcaptoéthanol au mélange de réaction dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter 250 microlitres de 100% d’éthanol et utiliser une pipette pour mélanger.Ensuite, assemblez une colonne de purification de l’ARN avec un tube de collecte. Transférez l’échantillon d’ARN dans la colonne de purification. Centrifugez la colonne à 8000 fois G pendant 15 secondes et jetez le flux à travers.Ensuite, appliquez 500 microlitres de tampon de lavage sur la colonne et centrifugeuse à 8000 fois G pendant deux minutes. Après cela, placez la colonne dans un tube de micro centrifugeuse de 1,5 millilitre. Ajouter 50 microlitres d’eau libre RNAase et incuber à température ambiante pendant une minute.Centrifugez la colonne à vitesse maximale pendant une minute pour alluter l’ARN. À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurer la densité optique de 3 microlitres de l’ARN alluté à 260 nanomètres. Ensuite, déterminez le numéro de copie du virus de la dengue synthétisé trois ARN UTR premier.Conserver la norme d’ARN à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi. Tout d’abord, mélanger 199 microlitres de tampon de traitement avec un microlitre de proteinase sans nucléase K.En utilisant le milieu de culture cellulaire, diluer en série le virus de la dengue préparé trois ARN UTR premier un à dix pour obtenir des normes d’ARN à des concentrations allant de 5000,000 à 5000 exemplaires par microlitre en répétant pipetting et vortex. Transférer 5 microlitres du supernatant de culture des cellules infectées par le virus de la dengue et la norme d’ARN UTR de premier choix du virus dengue 3 aux bandes A2 PCR ou aux puits d’une plaque PCR de 96 puits.Mélanger en cinq microlitres de la solution contenant le tampon de traitement et la proteinase K.Centrifugeuse brièvement à 200 fois G pendant cinq secondes. Incuber les échantillons dans un cycleur thermo à 25 degrés Celsius pendant dix minutes, puis à 75 degrés Celsius pendant cinq minutes. À l’aide du virus dengue, trois amorces spécifiques à l’UTR de premier plan et une sonde fluorogène préparent un mélange principal de PCR RTQ avec un reagent RT PCR d’une étape dans un tube de micro centrifugeuse de 1,5 millilitre.Alloquote huit microlitres du maître se mélangent dans un puits d’une plaque PCR en temps réel 96. Ensuite, ajoutez deux microlitres de chaque échantillon à chaque puits de la plaque PCR en temps réel de 96. Sceller la plaque avec un film adhésif optiquement clair.Centrifugez brièvement les plaques à 200 fois G pendant cinq secondes pour enlever les bulles d’air. Ensuite, placez la plaque dans un instrument PCR en temps réel. À l’aide d’un logiciel associé au PCR en temps réel, accédez à la fenêtre de mise en place et attribuez le puits d’une réaction à analyser sous forme d’échantillon inconnu.Ensuite, attribuez le puits du virus de la dengue dilué en série trois ARN UTR premier comme norme et tapez le numéro de copie prévu de la norme d’ARN dans chaque puits. Attribuez le contrôle non-modèle comme le contrôle négatif. Ensuite, démarrez l’instrument RT PCR et faites le cycle de la plaque tel qu’il est décrit dans le protocole texte.Dans la fenêtre d’analyse, cliquez sur analyser et assurez-vous que le coefficient de corrélation de la courbe standard générée est équivalent ou supérieur à 0,98. En général, utilisez les paramètres CT par défaut pour l’analyse. Dans cette étude, une dilution en série dix fois de l’ARN standard du virus de la dengue est soumise à une analyse directe rtq PCR à l’aide de trois amorces spécifiques utr premier et une sonde fluorogène.La courbe linéaire de cette analyse montre que la corrélation est bonne. Ensuite, cet essai direct rtq PCR est appliqué pour quantifier le virus de la dengue dans la culture supernatant des cellules infectées par le virus. Une bonne corrélation est observée entre le litre d’infection par le virus de la dengue et le CT, un numéro de cycle qui est considéré comme le point où le signal fluorescent augmente avec une croissance exponentielle au-dessus de l’arrière-plan.Lorsque les valeurs de CT générées par une dilution en série du stock du virus dengue avec des titres infectieux connus sont tracées sur la courbe standard précédemment générée, les données pour les échantillons allant de 08 à 8 000 PFU par réaction sont considérées comme se situent dans la fourchette de ceux soumis à l’ARN standard. Cela indique que les échantillons de virus de la dengue avec un large éventail de titres infectieux peuvent être analysés en même temps lors de l’utilisation de cette technique. Cet essai est en outre évalué pour son applicabilité à valider les agents antiviraux contre le virus de la dengue.Lorsqu’il est traité avec 50 microgrammes par millilitre de MPA, une réduction d’environ 99,87% de la culture de contrôle traitée par DMSO est observée. Enfin, les applications de ce test avec d’autres virus ARN sont testées. Lorsqu’un stock de souche vaccinale Virus 17D du virus de la fièvre jaune est soumis à un RTQ PCR direct, une courbe standard est générée avec une bonne corrélation directe entre les titres du virus et les valeurs de CT.De même, l’analyse directe du RTQ PCR du virus de la rougeole et du stock brut de souches du virus du chikungunya donne une bonne régression entre les titres infectieux et les valeurs de tomodensitaire. Cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de l’étude de dépistage. Permettre à un grand nombre d’échantillons d’explorer de nouveaux médicaments antiviraux est simpliste.N’oubliez pas que le travail avec des matériaux ré infectieux peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’utilisation d’équipement de protection individuelle et d’une armoire de biosécurité propre doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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