Name: isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing
Uploaded: 2018-10-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing at JoVE.com

هذا العمل كان يدعمها برنامج NINDS داخلية (1 ضياء NS003153 02) و NIDCD (1 ضياء DC000059 18). ونحن نشكر لي ل. و C.I. دوبروت للدعم الفني ومناقشات مفيدة، وكاثي جيم لاستعراض المخطوطة.

جميع الحيوانات الأعمال قد أنجزت وفقا لبروتوكول أقرها المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة. متوازنة في عينات من ذكور وإناث الفئران الممثل المدني الدولي/مؤتمر نزع السلاح-1 البرية من نوع، بين 8 وأسابيع 12 القديمة، كانت تستخدم لجميع التجارب. وينبغي ?...

<ol>
	<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex.">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li><li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Cell-Type+Composition+and+Activity-Dependent+Transcriptional+State+in+Mammalian+Brains+by+Massively+Parallel+Single-Nucleus+RNA-Seq.">Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.</a> Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq.">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>Sathyamurthy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Single+Nucleus+Transcriptional+Profiling+Defines+Spinal+Cord+Neurons+and+Their+Activity+during+Behavior.">Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior.</a> Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell.">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li><li>Campbell, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+census+of+arcuate+hypothalamus+and+median+eminence+cell+types.">A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types.</a> Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).</li><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets.">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li><li>Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Hypothalamic+Cell+Diversity.">Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity.</a> Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types.">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li><li>Li, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatosensory+neuron+types+identified+by+high-coverage+single-cell+RNA-sequencing+and+functional+heterogeneity.">Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.</a> Cell Research. 26 (8), 967 (2016).</li><li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+RNA-Seq+with+Waterfall+Reveals+Molecular+Cascades+underlying+Adult+Neurogenesis.">Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li><li>Villani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+new+types+of+human+blood+dendritic+cells,+monocytes,+and+progenitors.">Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors.</a> Science. 356 (6335), (2017).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li><li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation.">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7, 11022 (2016).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain.">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li><li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-sequencing+from+single+nuclei.">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li><li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons.">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li><li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue.">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li><li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cardiomyocyte+nuclei+from+post-mortem+tissue.">Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li><li>Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Filtration-based+Method+of+Preparing+High-quality+Nuclei+from+Cross-linked+Skeletal+Muscle+for+Chromatin+Immunoprecipitation.">A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li><li>Halder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+changes+in+plasticity+genes+accompany+the+formation+and+maintenance+of+memory.">DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq.">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li><li>. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing Available from: <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing</a> (2018)</li><li>10X Genomics. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).</li><li>Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+composition+characterizing+postnatal+development+and+maturation+of+the+mouse+brain+and+spinal+cord.">Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord.</a> Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).</li><li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA.">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).</li><li>Bakken, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equivalent+high-resolution+identification+of+neuronal+cell+types+with+single-nucleus+and+single-cell+RNA-sequencing.">Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Div-Seq:+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons.">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li></ol>

والهدف النهائي لهذا البروتوكول عزل الأنوية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي عالية الجودة لتحليل النسخي المتلقين للمعلومات. علينا تكييف أساليب Seq سنرنا أجل الشخصية كافة أنواع الخلايا في الحبل الشوكي. وفي البداية، وجدنا أن الخلية النموذجية الانفصال من أساليب غير فعالة لتسلسل وحيد الخلي?...

الجهاز العصبي يتكون من مجموعات مستمدة من الخلايا التي تعرض مجموعة متنوعة من الخصائص المورفولوجية والبيوكيميائية والكهربية. أثناء تسلسل الحمض النووي الريبي السائبة كانت مفيدة لتحديد التغيرات على صعيد الأنسجة في التعبير الجيني في ظروف مختلفة، فإنه يحول دون الكشف عن التغييرات النسخي على مستوى خلية واحدة. التقدم الذي أحرز مؤخرا في تحليل النسخي خلية واحدة قد مكنت تصنيف الخلايا ايربان إلى المجموعات الوظيفية استناداً إلى ذخيرتهم الجزيئية ويمكن حتى أن تكون الاستدانة للكشف عن مجموعات من الخلايا العصبية التي نشطت مؤخرا. 1 , 2 , 3 , 4 على مدى السنوات العشر الماضية، قد مكن تطوير الجيش الملكي النيبالي خلية مفردة التسلسل (سكرنا-Seq) دراسة التعبير الجيني في الخلايا الفردية، وتقديم وجهة نظر إلى تنوع من نوع الخلية. 5
وقدمت ظهور نهج قابلة للتطوير مثل سرنا موازية على نطاق واسع-Seq، منصات لتسلسل أنسجة غير متجانسة، بما في ذلك مناطق عديدة في الجهاز العصبي المركزي. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 ومع ذلك، أساليب تفكك خلية مفردة يمكن أن يؤدي إلى موت الخلية، فضلا عن التغييرات التجريبية في التعبير الجيني. 16 العمل مؤخرا بتكييف أساليب تسلسل خلية واحدة لتمكين المحافظة على الملامح النسخي الذاتية. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 وكانت هذه الاستراتيجيات ملائمة بصفة خاصة للكشف عن التعبير الجيني (IEG) المبكر الفوري عقب التحفيز الحسي أو السلوك. 3 , 4 في المستقبل، هذه الاستراتيجية أيضا يمكن لدراسة التغيرات الدينامية في الأنسجة في الحالات المرضية أو استجابة للتأكيد. من هذه الأساليب، هو تسلسل واحد نواة الجيش الملكي النيبالي (سنرنا-Seq) نهج واعدة التي لا تنطوي على الإجهاد يحفز تفكك الخلية ويمكن استخدامها على صعوبة أن تنأى بالانسجة (مثل الحبل الشوكي)، فضلا عن تجميد الأنسجة. 4 , 17 , 18 , 19 مواءمة من أساليب العزلة نويات السابقة،20،،من2122،،من2325 سنرنا Seq عادة يستخدم التقويض السريع الأنسجة والخلية تحلل تحت الظروف الباردة والطرد المركزي، وفصل النوى عن الحطام الخلوية. 4 نواة يمكن أن تكون معزولة لتسلسل الجيل المتلقين للمعلومات على منصات متعددة في تغليف الحبرية موائع جزيئية. 4 , 7 , 24 , 25 يسمح هذا الأسلوب للقطة من النشاط الترانسكربتي الآلاف من الخلايا في لحظة من الزمن.
وهناك استراتيجيات متعددة للإفراج عن نواة من الخلايا قبل عزلة والتسلسل، كل منها بمزاياها وعيوبها. هنا، يمكننا وصف ومقارنة البروتوكولين الملحقين بتمكين عزل نواة من الحبل الشوكي الكبار لكثافة موازية المتلقين للمعلومات سنرنا-Seq: تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية وتحلل ناقص التوتر والميكانيكية. ويوفر تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية اختلال الأنسجة كاملة وارتفاع عائد نهائي من الأنوية. ناقص التوتر الميكانيكية-تحلل يتضمن درجة السيطرة عليها من اختلال الأنسجة، مما أتاح فرصة لتحديد توازن بين الكمية ونقاء الغلة النووي نهائياً. وتوفر هذه النهج مقارنة الحمض النووي الريبي الغلة، أرقام تم اكتشاف الجينات كل نواة، والتنميط نوع الخلية وأيضا على حد سواء استخدامها بنجاح لما يليها سنرنا

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15503-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES (pH = 8.0)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgAc</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028-10X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH = 8.0)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-46034CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Add DTT just prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-238-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Tris-HCl (pH = 7.4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 M NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59222C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate-A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A12475-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Crystalgen</td>
			<td>221-133-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.04% BSA</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 U/&#956;L RNAse Inhibitor</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>30281-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oak Ridge Centrifuge Tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Tissue Dounce (2 ml)</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885303-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass large clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885301-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass small clearance pestle</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>885302-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3737001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersing tool (S 10 N &#8211; 5G)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers, 30 &#956;m</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>1000799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75003698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF16034F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemgenes Barcoding Beads</td>
			<td>Chemgenes</td>
			<td>Macosko-2011-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 &#956;m)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#8217; Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish (60 x 15 mm)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus rna sequencing

سبر التعبير الجيني خلية واحدة يمكن التعرف على نوع الخلية والخلية الدولة. وقد ظهرت تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة كأداة قوية لدراسة الملامح النسخي للخلايا، ولا سيما في الأنسجة غير المتجانسة مثل الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك، تفكك الأساليب المطلوبة لتسلسل وحيد الخلية يمكن أن يؤدي إلى تغييرات تجريبية في وفاة خلية والتعبير الجيني. وعلاوة على ذلك، هذه الأساليب تقتصر عموما على أنسجة جديدة، مما يحد من دراسات بشأن المحفوظات والمواد البيولوجية-البنك. تسلسل واحد نواة الجيش الملكي النيبالي (سنرنا-Seq) هو بديل جذاب للدراسات النسخي، نظراً لأنه يحدد أنواع الخلايا بدقة، ويسمح بدراسة الأنسجة المجمدة أو يصعب فصل، ويقلل من فعل الانفصال النسخ. نقدم هنا، بروتوكول الفائق لعزل السريع من الأنوية للمتلقين للمعلومات سنرنا--ما يليها هذا الأسلوب يتيح عزل نواة من عينات النخاع الشوكي الطازجة أو المجمدة، ويمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع اثنين من منصات تغليف الحبرية موازية على نطاق واسع.

هنا، نحن تنفيذ عزل نواة من الحبل الشوكي القطني الماوس الكبار المصب تسلسل الحمض النووي الريبي موازية على نطاق واسع. البروتوكول شملت ثلاثة عناصر رئيسية: الأنسجة التعطيل والخلوية تحلل السكروز وتجانس الكثافة الطرد المركزي (الشكل 1). في غضون ثوان، أثمر تحلل ال...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing at JoVE.com

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

نقدم هنا، بروتوكولا لسرعة عزل نواة عالية الجودة من الأنسجة الطازجة أو المجمدة المصب تسلسل الحمض النووي الريبي موازية على نطاق واسع. نحن تشمل الأنسجة الميكانيكية والمنظفات الصناعية والميكانيكية وناقص التوتر تعطل وخلية تحلل الخيارات، التي يمكن أن تستخدم لعزل نواة.

عزل نويات الحبل الشوكي الكبار لتسلسل الحمض النووي الريبي المفرد-نواة موازية على نطاق واسع

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية هو أداة قوية لدراسة ملفات تعريف النسخ للخلايا، وخاصة في الأنسجة غير المتجانسة، مثل الجهاز العصبي المركزي. يوفر هذا البروتوكول طريقة لعزل النوى لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة. باستخدام النوى بدلا من الخلايا، يمكن تطبيق هذه الطريقة على الأنسجة التي يصعب تفكيكها، وكذلك الأنسجة المجمدة.وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة نوع الخلية التغييرات الخاصة في الخلايا التالية للمرض أو الإصابة. ابدأ هذا الإجراء بالقتل الرحيم للماوس، كما هو موضح في بروتوكول النص. المقبل، وجعل شق على طول الجسم لفضح الأجهزة الداخلية.Eviscerate الماوس عن طريق سحب الأعضاء الداخلية من تجويف الجسم باستخدام ملقط. لا تستخدم مناشف ورقية لتنظيف المنطقة أو لإزالة الأعضاء ، لأن هذا قد يؤدي إلى إدخال الملوثات. باستخدام المقص، قطع العمود الفقري بين الفقرات الشوكية L2 و L3.لإخراج الحبل الشوكي، تناسب حقنة ثلاثة ملليلتر تحتوي على PBS الجليد الباردة مع إبرة قياس 25 1/4 بوصة. ضع طرف الإبرة في النهاية الكاسية للعمود الفقري. استخدام إصبعين لقرص فقرات لخلق ختم ضيق حول غيض من الإبرة، واضغط على المكبس إلى أسفل لإخراج الحبل الشوكي rostrally.ضع الحبل الشوكي في طبق بيتري مع PBS بارد. إذا كان هناك حاجة فقط إلى الجزء القطني من الحبل، تقليم بعيدا الأجزاء الصدرية والصدرية من الحبل الشوكي. عند هذه النقطة ، وتجميد الأنسجة وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية ، أو استخدامها على الفور إما لتحلل الخلايا الميكانيكية المنظفات كما هو موضح هنا ، أو التحلل الميكانيكية الهابوتونية كما هو موضح في بروتوكول النص.لتحديد تحلل الخلايا الميكانيكية المنظفات، ضع الحبل الشوكي القطني في هجنة Dounce المبردة مسبقًا وأضف 500 ميكرولترات من عازل المنظفات المبردة مسبقًا. Dounce مع خمس ضربات من الآفة فضفاضة ، A ، ثم خمس إلى 10 السكتات الدماغية من الآفات الضيقة ، B.Avoid رفع المهيجين خارج حل التحلل بين السكتات الدماغية ، وتجنب إدخال الفقاعات. الآن، ضع مصفاة 40 ميكرون على أنبوب مخروطي 50 ملليلتر مبرد مسبقًا ومبلل مسبقًا مع ملليلتر واحد من عازل السكروز المنخفض.إضافة ملليلتر واحد من العازلة السكروز منخفضة إلى التجانس Dounce التي تحتوي على النوى الخام في العازلة تحلل، واخلط بلطف عن طريق الأنابيب مرتين إلى ثلاث مرات. تمرير الإعدادية نوى الخام على مصفاة 40 ميكرون, في ما قبل المبردة 50 ملليلتر أنبوب مخروطي. تمرير إضافية ميليلتر منخفضة السكروز العازلة على 40 ميكرون مصفاة، وبذلك حجم النهائي إلى ثلاثة ملليلتر من العازلة السكروز منخفضة و 500 ميكرولترات من العازلة تحلل.كرر هذه الخطوات إذا الجمع بين أسلاك متعددة، والتبريد في نفس أنبوب مخروطي. ثم، الطرد المركزي العينة في 3200 مرات G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. بمجرد اكتمال الطرد المركزي، يندد بالناذر.نعلق لوحة باستخدام ثلاثة ملليلتر من انخفاض sucrose العازلة. دوامة بلطف لإزالة بيليه من الجدار لتسهيل resuspension. بعد السماح للعينة الجلوس على الجليد لمدة دقيقتين، ونقل التعليق إلى أنبوب أوك ريدج.باستخدام التجانس في وضع واحد، التجانس النوية في العازلة السكروز منخفضة لمدة 15 إلى 30 ثانية، والحفاظ على العينة على الجليد. ثم، استخدام ماصة المصلية لطبقة 12.5 ملليلتر من العازلة السكروز كثافة، تحت التجانس العازلة السكروز منخفضة، مع الحرص على عدم خلق فقاعة أن يعطل طبقات الكثافة. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 3200 مرات G، لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية.مرة واحدة في الطرد المركزي كاملة، على الفور ديسانت عظمى في حركة الخفقان. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر لإزالة أنبوب أوك ريدج فورا من جهاز الطرد المركزي، وبسرعة طاردة فائقة. باستخدام 100 ميكرولترتر إلى ملليلتر واحد من محلول إعادة النيوسينجيون، نعلق النوى المتبقية على الجدار.تجنب عبوس الميلين الذي يبقى مع إعداد القائم على المنظفات. يمكن أن يؤدي الفشل في القيام بهذه الخطوات بسرعة إلى إعداد نوات مع الحطام الخلوي الزائد ، أو الميلين ، والتي يمكن أن تعوق تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة في المصب. تصفية النوى من خلال 30 إلى 35 ميكرون المسام حجم مصفاة وجمع في أنبوب ما قبل المبردة.تحديد العائد النووي، باستخدام مقياس الهيموسيتات لحساب النوى تحت هدف 10 x، قبل الشروع في تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة، كما هو موضح في بروتوكول النص. تظهر صور الحقل الساطع و epifluorescent من النوى ، المعزولة باستخدام بروتوكول التحلل الميكانيكي للمنظفات ، في 10 x. هذه النوى معزولة بطريقة غير متحيزة، مما يسمح لدراسة ملامح التعبير الجينية الذاتية على مستوى خلية واحدة.يظهر هنا، هو مؤامرة تمثيلية tSNE من تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة، من الحبل الشوكي القطني الماوس، وذلك باستخدام منصة تغليف قطرات موازية على نطاق واسع. يمكن استخدام النوى المعزولة من الأنسجة الطازجة أو المجمدة في التسلسل على كل من المنصات التجارية والأكاديمية. هذه التقنية تمكن الباحثين من استكشاف ملامح النسخ على مستوى الخلية الواحدة، وذلك باستخدام الأنسجة التي يصعب تفكيكها، مثل الحبل الشوكي، أو حتى الأنسجة المجمدة، مثل المواد البنك الحيوي.أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم تقليل مقدار الوقت بين القتل الرحيم والتحلل الخلوي. وعلاوة على ذلك، من المهم تقليل الفقاعات التي أدخلت في الحلول من التحلل الخلوي إلى إعادة الدمج، وشراء نواة الحيوانات الأليفة بعناية. وبعد هذا الإجراء، يمكن استخدام النوى في تطبيقات بديلة، مثل فرز الفاكسات، من أجل عزل أنواع خلايا محددة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

الحبل الشوكي الكهربية ثانيا : خارج الخلية التصنيع الكهربائي شفط

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

إنتاج الحمض النووي الريبي لتحليل النسخ من الماوس النخاع الشوكي خلية الخلايا العصبية الحركية الهيئات بواسطة الليزر التقاط الالتصاع الدقيق

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

RNA تسلسل تحليل التفاضلية التعبير الجيني في Electroporated الفرخ الجنينية الحبل الشوكي

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

إعداد الثقافات الدبقية المختلطة الابتدائية من الكبار ماوس النخاع الشوكي الأنسجة

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

البثق الهيدروليكي من الحبل الشوكي وعزل الظهرية جذر العقد في القوارض

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

الحبل الشوكي العصبونات العزلة والثقافة من الفئران حديثي الولادة

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

عزل ميكروليا الخاصة بالمنطقة من واحد الكبار الفار الدماغ نصف الكره لعمق خليه واحده التسلسل RNA

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

التسليم داخل الشرايين للخلايا الجذعية العصبية إلى الدماغ الفئران والفأر: تطبيق على الإقفاري الدماغي

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

تحريض كامل من إصابة الحبل الشوكي من نوع الترانصيب في الفئران

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...

A Minimally Invasive, Fast Spinal Cord Lateral Hemisection Technique for Modeling Open Spinal Cord Injuries in Rats

Open spinal cord injury techniques modeling laceration-like injuries are time-consuming and invasive because they involve laminectomy. This new technique ...